謝懂君，鄭乾，彭爽，馬鵬飛，吳旭玲，于云莉，徐祖才，馬勛泰，馮占輝

癲癇是神經(jīng)內(nèi)科常見疾病，慢性癲癇發(fā)作常常給患者生理和心理造成巨大影響，癲癇猝死(sudden unexpected death in epilepsy，SUDEP) 就是最嚴(yán)重的一類損害，雖然臨床很難診斷，但是在癲癇領(lǐng)域得到更多學(xué)者的關(guān)注，也在嘗試找到更好的方式開展相關(guān)研究[1-2]。有關(guān)SUDEP的研究更多地集中在個(gè)案研究，有學(xué)者報(bào)道心律失?？赡芘cSUDEP密切相關(guān)，也有報(bào)道稱呼吸抑制也是重要的原因，在深入的機(jī)制研究中，也有報(bào)道SUDEP患者離子通道存在異常，例如有Na+通道異常和K+通道異常等，這些離子通道功能障礙最終可導(dǎo)致猝死[3-4]。Van等[5]報(bào)道癲癇發(fā)作患者和非癲癇發(fā)作患者心律失常存在差異，認(rèn)為癲癇組患者更容易出現(xiàn)心臟停搏，房室傳導(dǎo)阻滯，房顫、室顫等，且癲癇患者猝死的可能性比正常人更高。

鈉氫交換體1(sodium hydrogen exchanger 1，NHE1)是NHE家族的成員之一，其作用非常重要，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的酸堿平衡，維持細(xì)胞的基本生理功能[6]。NHE1激活與細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境密切相關(guān)，隨著PH值的降低，功能逐漸增強(qiáng)；然而隨著NHE1功能增強(qiáng)，也會(huì)導(dǎo)致Na+逐漸內(nèi)流，從而促使神經(jīng)元和心肌細(xì)胞的興奮性增高。Na+過(guò)度內(nèi)流可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈉鈣交換體過(guò)度激活，從而促使Ca2+過(guò)度激活，而Ca2+信號(hào)可以加劇細(xì)胞的凋亡和壞死[7]。目前在患者反復(fù)癲癇放電的情況下，心肌細(xì)胞內(nèi)NHE1的表達(dá)特點(diǎn)以及心肌細(xì)胞凋亡情況鮮見報(bào)道?；诖?，課題組建立慢性癲癇動(dòng)物模型，在模型成功后的第60天，檢測(cè)慢性癲癇動(dòng)物模型心肌細(xì)胞的NHE1表達(dá)以及凋亡情況，為NHE1是否參與心肌細(xì)胞的凋亡提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取雄性SD大鼠40只，其中22只采用腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品構(gòu)建癲癇模型作為模型組；18只采用腹腔注射生理鹽水作為對(duì)照組；建立模型第60天后，進(jìn)行蛋白印跡(Western-blot)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑

NHE1抗體(美國(guó)Abcam)；β-actin抗體(美國(guó)Affinity)；地西泮10 mg/2 mL(成都 倍特公司)；匹羅卡品，氯化鋰(美國(guó)Sigma公司)；山羊抗兔二抗(中杉金橋)；RNAisoPlus和PrimeScript?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TakeraBio)；化學(xué)發(fā)光顯色試劑(ECL，美國(guó)Pierce)；SuperMaze動(dòng)物行為視頻分析系統(tǒng)(上海欣軟信息)；PM20自動(dòng)顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.3 模型制作

按文獻(xiàn)[8]建立癲癇大鼠模型，腹腔注射氯化鋰，劑量為127 mg/kg，20 h后腹腔注射硫酸阿托品，劑量為1 mg/kg，30 min后腹腔注射匹羅卡品，劑量為50 mg/kg，用藥后觀察大鼠行為學(xué)改變，以Racine分級(jí)作為標(biāo)準(zhǔn)。Racine Ⅳ級(jí)及以上發(fā)作持續(xù)1 h后，應(yīng)用地西泮，劑量為10 mg/kg，必須終止癲癇發(fā)作。對(duì)照組采用等量生理鹽水注射[8]。

1.4 Western blot方法

取模型組和對(duì)照組大鼠各6只，在自發(fā)性癇性發(fā)作開始第60天，應(yīng)用10%水合氯醛，劑量為300 mg/kg，麻醉后斷頭處死，快速分離心肌組織，置于液氮中快速冷凍，然后儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中。

取心肌組織提取蛋白(按試劑盒要求)，檢測(cè)蛋白濃度，提取50 μg蛋白進(jìn)行電泳，然后電轉(zhuǎn)到于8%SDS-PAGE上電泳，電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上；室溫5%BSA孵育聚偏二氟乙烯膜1.5 h，加入兔抗大鼠NHE1(1∶4 000)和β-actin(1∶1 000)孵育聚偏二氟乙烯膜4 ℃過(guò)夜；第二天室溫下孵育NHE1膜，加入二抗(1∶5 000)孵育2 h。加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯色試劑對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯影。用QuantityOne4.6.2軟件分析NHE1的相對(duì)含量，β-actin作為內(nèi)參[9]。

1.5 RT-PCR檢測(cè)方法

第60天取模型組和對(duì)照組大鼠各6只，采用RT-PCR方法檢測(cè)心肌NHE1mRNA的表達(dá)。按試劑盒說(shuō)明書，提取總RNA，應(yīng)用分光光度法測(cè)定RNA濃度和純度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。由TakaraBio設(shè)計(jì)合成RT-PCR引物。選擇GAPDH為管家基因：順義鏈5'-CCCCCAATGTATCCGTTGTG-3'，反義鏈5'-TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'；大鼠NHE1基因：順義鏈 5'-GCGGCGAGCAGATCAATAA-3'，反義鏈 5'-ACAGTGACGGCATCGTTGAG-3'[8]。

1.6 流式細(xì)胞檢測(cè)方法

取1 g心肌組織濾紙拭干，生理鹽水反復(fù)洗滌兩次，然后用小剪刀快速將心肌組織剪碎，大小約1～3 mm3；然后加入0.25 g/100 mL的胰蛋白酶5 mL進(jìn)行消化，然后采用恒溫水浴，時(shí)間30 min，其間間斷振蕩3 次；然后用尼龍網(wǎng)過(guò)濾，過(guò)濾后放入離心機(jī)，以800 r/min離心，將沉淀用冰鹽水洗2次，再次離心；丟棄上清液，放入70%乙醇中固定，再次離心，將上清液丟棄，用冰生理鹽水漂洗2次，保證細(xì)胞數(shù)在1×106個(gè)/mL，加入碘化丙啶染液1.0 mL，然后置于4 ℃恒溫箱中30 min，然后檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 模型制作情況

雄性SD大鼠40只，其中22只采用腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品構(gòu)建癲癇模型作為模型組，制作模型過(guò)程中死亡3只，死亡率為14%。另18只采用腹腔注射生理鹽水作為對(duì)照組，無(wú)死亡。

2.2 Western-blot結(jié)果比較

第60天模型組大鼠心肌細(xì)胞NHE1蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖1。

圖1 模型組和對(duì)照組大鼠第60天時(shí)心肌細(xì)胞NHE1蛋白的表達(dá)

2.3 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果比較

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞NHE1mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖2。

圖2 模型組和對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞NHE1mRNA的表達(dá)

2.4 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果比較

經(jīng)流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示,模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖3。

圖3 模型組和對(duì)照組大鼠心肌組織凋亡情況

3 討論

癲癇屬于神經(jīng)科第二大疾病，多以反復(fù)抽搐為臨床表現(xiàn)，癲癇發(fā)作中可以導(dǎo)致SUDEP。然而導(dǎo)致SUDEP的機(jī)制目前尚不清楚，為進(jìn)一步探討慢性癲癇患者心肌細(xì)胞是否出現(xiàn)異常，本研究制作了慢性癲癇鼠模型，分析在慢性癲癇模型鼠第60天時(shí)心肌細(xì)胞的凋亡情況，以期明確NHE1的表達(dá)特點(diǎn)以及細(xì)胞凋亡情況，基于心臟病變機(jī)制從而為癲癇慢性發(fā)作導(dǎo)致SUDEP提供依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌細(xì)胞NHE1蛋白和mRNA表達(dá)均增高，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡較對(duì)照組明顯增加。

NHE1屬于心肌細(xì)胞膜蛋白，在心肌細(xì)胞中表達(dá)最為廣泛[10]。該蛋白的主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)酸堿平衡，維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。在大腦皮層神經(jīng)元，NHE1主要是因?yàn)樯窠?jīng)元內(nèi)pH值降低而被激活[11]。當(dāng)神經(jīng)元呈酸中毒時(shí)，NHE1被激活，將H+排出，Na+攝入進(jìn)來(lái)，以此恢復(fù)神經(jīng)元內(nèi)生理pH值[12]。本研究在模型鼠心肌細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)了類似的特征，NHE1蛋白及mRNA均表達(dá)增高，提示在癲癇反復(fù)發(fā)作的情況下，NHE1通過(guò)激活不斷調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的酸堿平衡，這與Leineweber等[13]的結(jié)果一致。基于上述研究結(jié)果，可以推測(cè)在癲癇反復(fù)發(fā)作的情況下，心臟也不斷受到影響，心律失常也可能出現(xiàn)，NHE1可以通過(guò)調(diào)節(jié)PH值，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)通路應(yīng)對(duì)細(xì)胞的酸堿平衡的紊亂[14-15]。在反復(fù)的癲癇發(fā)作中，心肌細(xì)胞更多處于應(yīng)激狀態(tài)，NHE1不斷通過(guò)調(diào)控Na+和H+交換，改善心肌細(xì)胞內(nèi)的酸堿平衡，從而維持細(xì)胞的收縮性。然而這種不斷的調(diào)整可能會(huì)造成細(xì)胞凋亡及壞死的發(fā)生。

凋亡是細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界環(huán)境改變的一個(gè)慢性調(diào)節(jié)過(guò)程，然而隨著凋亡的增加也會(huì)導(dǎo)致心肌組織的病變逐漸加重，特別是作為心臟起搏點(diǎn)的竇房結(jié)細(xì)胞，在心律失常中起到重要的作用，如果竇房結(jié)細(xì)胞的凋亡過(guò)度發(fā)生，可能會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞在應(yīng)答癲癇發(fā)作時(shí)或者急性缺氧時(shí)出現(xiàn)電生理的異常，從而導(dǎo)致猝死發(fā)生。本研究基于心肌組織開展凋亡的相關(guān)檢測(cè)，證實(shí)模型鼠心肌組織在癲癇造模成功后第60天確實(shí)存在凋亡情況，由此證實(shí)心臟在癲癇發(fā)生的過(guò)程中確實(shí)是受到影響的。

本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NHE1可以通過(guò)酸堿平衡的調(diào)節(jié)，促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡，其機(jī)制可能與Ca2+信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。NHE1的過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)鈉鈣交換體的過(guò)度激活，通過(guò)鈉鈣交換，促進(jìn)Ca2+進(jìn)入細(xì)胞，這可以激活Calpain，然后進(jìn)一步激活Caspase3，從而促進(jìn)凋亡的發(fā)生[16]。為此認(rèn)為在心肌組織可能存在類似的改變，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡。

心肌細(xì)胞的凋亡可能在心律失常的發(fā)生起到重要作用，例如心臟停搏、房顫及室顫的發(fā)生。有研究表明，SUDEP患者在發(fā)作后有更為明顯的腦電抑制，繼而出現(xiàn)呼吸抑制和心臟心律失常[16]。據(jù)研究顯示，癲癇發(fā)作后丘腦的激活可以通過(guò)交感系統(tǒng)把興奮傳遞到心臟，從而逐漸加劇心肌損害[17-19]。

總之，本研究認(rèn)為慢性癲癇患者在不斷的癲癇發(fā)作中，可能會(huì)出現(xiàn)心律失常，同時(shí)心肌細(xì)胞慢性凋亡增加，凋亡的發(fā)生可能與NHE1的參與有關(guān)，最終可能導(dǎo)致患者發(fā)生SUDEP。