李明慧，侯俊宇，胡 迪，劉 靜，趙夢(mèng)丹，葛俊宏，申 野，李 坦，彭鈺博，劉 鵬 ，孫 新,

（1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林吉林 132013；3.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林吉林 132013；4.北華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林 132013；5.北華大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，吉林吉林 132013）

隨著人口老齡化的增加，探索衰老的相關(guān)分子機(jī)制已成為現(xiàn)代科學(xué)研究的一個(gè)重要研究熱點(diǎn)[1-2]。衰老是由氧化應(yīng)激[3]引起或在正常條件下生物發(fā)育成熟后，一個(gè)緩慢的自身機(jī)能減退以及結(jié)構(gòu)和功能逐漸退化的過程[4-5]。衰老過程中，細(xì)胞形態(tài)變化與分子水平改變往往漸進(jìn)性影響健康，因此衰老與疾病和死亡密切相關(guān)[6]。大多數(shù)正常細(xì)胞的分裂能力是有限的，細(xì)胞停止分裂后就進(jìn)入衰老狀態(tài)，因此衰老細(xì)胞被認(rèn)為是機(jī)體衰老的重要原因[7]。

玉竹（Polygonatum odoratum），為百合科黃精屬多年生植物的干燥根莖，呈圓柱形，種類各異。為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，并記載在《神農(nóng)本草經(jīng)》中。玉竹主要化學(xué)成分包括多糖、類固醇、蒽醌、生物堿、皂苷、維生素等[8]，已被證明在治療與年齡有關(guān)的疾病如糖尿病、肺病、疲勞和消化不良的臨床實(shí)踐中非常有效，玉竹不僅具有藥用價(jià)值，還具有食用價(jià)值，被列為藥食同源性物品[9-10]。許多中草藥中的多糖成分已被證明具有抗衰老活性，并引起抗衰老領(lǐng)域?qū)＜以絹碓酱蟮呐d趣[11]。多糖是玉竹根中最主要的活性成分，目前有很多關(guān)于玉竹多糖（Polygonatum odoratumpolysaccharides，POP）的藥理作用、自由基清除及其抗氧化活性的研究[12-14]。李化強(qiáng)等[15]研究表明POP對(duì)DPPH·、、·OH和均有一定的清除作用。彭壯等[16]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)POP能夠改善D-半乳糖（D-gal）誘導(dǎo)的衰老模型小鼠認(rèn)知障礙，改善海馬區(qū)的病理狀態(tài)。POP還可通過miRNA-1224的Hippo信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞生成[17]。但關(guān)于POP的體外抗衰老及線粒體膜電位保護(hù)作用的研究較為少見。

本研究應(yīng)用水提醇沉的方法提取POP，并用Sevag法去除多糖中的蛋白質(zhì)。應(yīng)用D-gal作用于大鼠胸大動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（A7r5）建立細(xì)胞衰老模型，研究POP對(duì)D-gal誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞衰老的保護(hù)作用，為POP的抗衰老基礎(chǔ)研究及抗衰老食品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉竹干燥根莖 長(zhǎng)白山特色植物種植地；大鼠胸大動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（A7r5） 北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；乙醇 遼寧泉瑞試劑有限公司；氯仿 天津凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；苯酚、硫酸、正丁醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D-氨基半乳糖胺（D-gal）北京金泰宏達(dá)生物科技有限公司；DMSO、維生素E（VE） 美國(guó) Sigma公司；MTT 美國(guó) Amresco公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清 美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶 美國(guó)Invitrogen公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、細(xì)胞衰老β半乳糖苷酶（SA-β-gal）試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒 碧云天生物科技有限公司。

Z323K低溫高速離心機(jī)、Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀 美國(guó)Beckman公司；TDL-5-R低速離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；EZ585臺(tái)式凍干機(jī) 美國(guó)SIM公司；MCO-18AICUVL-PC二氧化碳培養(yǎng)箱日本Panasonic公司；MDF-U4086S -80 ℃超低溫冰箱 日本SANYO公司；CLRSS II TYPE B2超凈工作臺(tái) 北京HDL公司；TH4-200倒置熒光顯微鏡、FV1200激光共聚焦顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 POP的提取與純化 目前提取POP的方法有超聲波輔助法、超聲波輔助酶法、水提醇沉法等。其中超聲波輔助法可破壞植物細(xì)胞的細(xì)胞壁易影響多糖結(jié)構(gòu)[18-19]。本實(shí)驗(yàn)采用簡(jiǎn)單、易操作、提取率高的水提醇沉法提取玉竹粗多糖，經(jīng)查閱多篇文獻(xiàn)，現(xiàn)已確定水提醇沉法提取黑龍江源POP可獲得最佳提取率為7.93%，其選擇的提取條件為溫度80 ℃，時(shí)間2 h，固液比1:15 g/mL[20]。在本研究中，在該條件基礎(chǔ)上進(jìn)行多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化POP提取條件，發(fā)現(xiàn)POP提取條件在料液比為1:20 g/mL、提取溫度90 ℃、提取時(shí)間為2.5 h條件下進(jìn)行煎煮，可得到最佳提取率，故我們選用該條件進(jìn)行POP的提取。首先稱取玉竹根莖300 g，研磨打碎，按上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行提取，反復(fù)三次后合并三次的提取液，而后進(jìn)行濃縮至700 mL。將濃縮液3500 r/min離心10 min，去除沉淀。用分液漏斗緩慢滴入無水乙醇直至乙醇含量達(dá)到90%。4 ℃冰箱靜置過夜，次日取出后3500 r/min離心，去上清，沉淀物用無水乙醇洗脫，干燥后得到玉竹粗多糖。

將玉竹粗多糖溶于蒸餾水中配置成5%的糖溶液，放置于-80 ℃冰箱過夜，次日取出置于水浴箱中溶解，12000 r/min離心棄沉淀，反復(fù)凍融直至無沉淀離出。將氯仿和正丁醇以4:1的比例配制混合液進(jìn)行Sevag，取多糖溶液與氯仿、正丁醇混合液按1:4混合，震蕩 1 h，4000 r/min離心 15 min，此時(shí)離心管內(nèi)會(huì)出現(xiàn)三層，上層為糖溶液，中間層為變性蛋白，下層為有機(jī)試劑，收取最上層的糖溶液，反復(fù)Sevag直至無變性蛋白析出。把Sevag后的糖溶液加入3500 Da的透析袋中，置于流水下24 h，最后將透析24 h后的多糖溶液收集到平皿中，在22 mT、-102.8 ℃條件下凍干，得到POP。POP得率計(jì)算公式：

式中：M1為提取出的POP的質(zhì)量，g；M2為玉竹原材料質(zhì)量，g。

1.2.2 POP總糖含量測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用苯酚-硫酸法測(cè)定POP中總糖含量，目前已有研究測(cè)量其含量為75.23%[21]。首先配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液使其濃度為100 μg/mL，然后將其稀釋為 0、10、20、40、60、80、100 μg/mL濃度梯度的葡萄糖溶液，分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL 于試管中，用蒸餾水定容至1 mL，將POP配制成100 μg/mL的糖溶液1 mL，在不同濃度梯度的葡萄糖溶液及POP溶液中依次加入6%苯酚溶液0.5 mL，濃硫酸2.5 mL，振蕩，沸水浴10 min，然后冷卻至室溫，490 nm處測(cè)得吸光度值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算POP中總糖含量。

1.2.3 A7r5細(xì)胞活力測(cè)定

1.2.3.1 POP對(duì)A7r5細(xì)胞增殖的影響 將含有10%FBS、1%青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)A7r5細(xì)胞后，以5000 cells/孔接種于96孔板中，設(shè)置對(duì)照組，25、50、100、200、400、800 μg/mL POP處理組，每組6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，置于37 ℃、5% CO2培育箱孵育過夜。次日用上述濃度梯度的POP溶液處理細(xì)胞24 h。然后每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，培養(yǎng)箱孵育4 h后去除上清，每孔加入150 μL DMSO，置于酶標(biāo)儀上混勻，490 nm處測(cè)得吸光度值，細(xì)胞存活率計(jì)算公式：

式中：A處理組為不同濃度POP處理后測(cè)得的吸光度值；A對(duì)照組為正常培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞測(cè)得的吸光度值。

1.2.3.2 D-gal對(duì)A7r5細(xì)胞增殖的影響 將含有10%FBS、1%青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)A7r5細(xì)胞后，以5000 cells/孔接種于96孔板中，根據(jù)查閱文獻(xiàn)得到D-gal致細(xì)胞衰老模型的適宜濃度梯度[22-23]，對(duì)本實(shí)驗(yàn)的處理濃度及處理時(shí)間進(jìn)行條件摸索。設(shè)置對(duì)照組，5、10、20、40、80 mg/mL D-gal處理組，每組6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，至于37 ℃、5% CO2培育箱孵育過夜。次日用上述濃度梯度的D-gal處理細(xì)胞24和48 h。然后每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，培養(yǎng)箱孵育4 h后去除上清，每孔加入150 μL DMSO，置于酶標(biāo)儀上混勻，490 nm處測(cè)得吸光度值，細(xì)胞存活率計(jì)算公式：

式中：A處理組為不同濃度D-gal處理后測(cè)得的吸光度值；A對(duì)照組為正常培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞測(cè)得的吸光度值。

1.2.3.3 POP對(duì)D-gal處理A7r5細(xì)胞增殖的影響將含有10% FBS、1%青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)A7r5細(xì)胞后，以5000 cells/孔接種于96孔板中，設(shè)置對(duì)照組、D-gal模型組、POP處理組，每組6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。置于37 ℃、5% CO2培育箱孵育過夜。待細(xì)胞長(zhǎng)到適宜的密度后，首先用25、50、100、200、400、800 μg/mL POP 處理細(xì)胞 5 h后，將模型組和處理組同時(shí)加入D-gal使其濃度達(dá)到40 mg/mL，放入培養(yǎng)箱孵育48 h。然后每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，培養(yǎng)箱孵育4 h后去除上清，每孔加入150 μL DMSO，置于酶標(biāo)儀上混勻，490 nm處測(cè)得吸光度值，細(xì)胞存活率計(jì)算公式：

式中：A處理組為不同濃度POP處理組及D-gal模型組測(cè)得的吸光度值；A對(duì)照組為正常培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞測(cè)得的吸光度值。

1.2.4 POP對(duì)D-gal誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞內(nèi)指標(biāo)的影響

1.2.4.1 A7r5細(xì)胞內(nèi)SA-β-gal活性的測(cè)定 將含有10% FBS、1%青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)A7r5細(xì)胞后，以1.1×105cells/孔接種于6孔板中，設(shè)置對(duì)照組、D-gal模型組、POP處理組和VE陽性對(duì)照組，每組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。至于37 ℃、5%CO2培育箱孵育過夜。次日先用100 μg/mL POP和100 μg/mL VE處理細(xì)胞5 h后，將模型組、POP處理組和陽性對(duì)照組同時(shí)加入D-gal使其濃度達(dá)到40 mg/mL，放入培養(yǎng)箱孵育48 h。然后用β-半乳糖苷酶染色試劑盒進(jìn)行染色，首先用PBS清洗1次，加入染色固定液每孔1 mL，37 ℃、5% CO2培育箱固定15 min，然后用PBS清洗3次，每次3 min，清洗完畢后加入染色液 A 10 μL/孔、染色液 B 10 μL/孔、染色液 C 930 μL/孔、X-Gal溶液 50 μL/孔，而后將培養(yǎng)皿封閉放入無CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。倒置熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照，以評(píng)估POP對(duì)D-gal誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞內(nèi)SA-β-gal活性的影響。

1.2.4.2 A7r5細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（ROS）的測(cè)定 為檢測(cè)D-gal誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，應(yīng)用ROS試劑盒進(jìn)行染色。細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.2.4.1。將處理后細(xì)胞中的培養(yǎng)液去除，加入PBS清洗1次，以1:2000的比例用無血清的DMEM稀釋DCFH-DA，每孔加入1 mL DCFH-DA稀釋液使其細(xì)胞表面充分覆蓋，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min后去除稀釋液，用無血清的DMEM清洗3次，3 min/次。熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞染色的熒光強(qiáng)度，研究POP對(duì)ROS產(chǎn)生的影響。

1.2.4.3 A7r5細(xì)胞線粒體膜電位的測(cè)定 為了檢測(cè)POP對(duì)D-gal誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞線粒體膜電位變化的影響，采用線粒體膜電位試劑盒（JC-1）以JC-1為熒光探針檢測(cè)細(xì)胞的線粒體膜電位變化。將6孔板內(nèi)每孔滴入200 μL培養(yǎng)液，將高壓滅菌后的蓋玻片緩慢放入6孔培養(yǎng)皿中使蓋玻片與培養(yǎng)皿底部貼合，培養(yǎng)A7r5細(xì)胞后，以11×104cells/孔接種于6孔板中，每孔緩慢滴入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液。設(shè)置對(duì)照組、D-gal模型組、POP處理組和VE陽性對(duì)照組，每組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。至于37 ℃、5% CO2培育箱孵育過夜。次日先用 100 μg/mL POP 和 100 μg/mL VE處理細(xì)胞5 h后，將模型組、處理組和陽性對(duì)照組同時(shí)加入D-gal使其濃度達(dá)到40 mg/mL，放入培養(yǎng)箱孵育48 h。然后用線粒體膜電位試劑盒進(jìn)行染色，首先PBS清洗1次，加入1 mL培養(yǎng)液再加入1 mL JC-1染色工作液，充分混合后放入CO2培養(yǎng)箱孵育20 min，然后用JC-1染色緩沖液（×1）4 ℃冰浴洗滌2次，最后每孔加入2 mL培養(yǎng)液，將有細(xì)胞覆蓋的蓋玻片用針頭取出，封片在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用GraphPad Prism 6.01，試驗(yàn)結(jié)果均為3次平行試驗(yàn)所得，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 POP的提取及測(cè)定

300 g玉竹根莖按照料液比為1:20 g/mL、提取溫度90 ℃、提取時(shí)間為2.5 h條件下煎煮濃縮，醇沉、sevag提取POP共24.68 g，POP得率為8.23%。

苯酚-硫酸法測(cè)得POP總糖含量，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=0.007x+0.0162，R2=0.9923。POP濃度為 100 μg/mL時(shí)吸光度為 0.52，根據(jù)公式得POP的總糖含量為76.48%±0.036%。

2.2 POP對(duì)A7r5細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測(cè)POP對(duì)A7r5細(xì)胞活力的影響，如圖1，實(shí)驗(yàn)表明 25、50、100、200、400、800、1600 μg/mL濃度梯度的POP處理A7r5細(xì)胞24 h后，POP呈劑量依賴性提高細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞增殖，當(dāng)濃度為400 μg/mL時(shí)，POP對(duì)A7r5細(xì)胞促增值作用最強(qiáng)，細(xì)胞存活率為 174.89%±3.30%（P＜0.001，n=3）。

圖1 POP對(duì)A7r5細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of POP on the survival of A7r5 cells

2.3 D-gal對(duì)A7r5細(xì)胞增殖的影響

MTT實(shí)驗(yàn)表明，圖2A為不同濃度D-gal處理A7r5細(xì)胞24 h，與對(duì)照組相比，80 mg/mL D-gal刺激A7r5細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率約為56.95%±2.78%（P＜0.001，n=3）。圖2B為不同濃度 D-gal處理A7r5細(xì)胞48 h，與對(duì)照組相比，40 mg/mL D-gal刺激A7r5細(xì)胞48 h細(xì)胞存活率約為65.93%±1.63%（P＜0.001，n=3）。D-gal呈劑量依賴性誘導(dǎo) A7r5 細(xì)胞存活率下降?？紤]到D-gal濃度過高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡的不可逆性損傷，此時(shí)的細(xì)胞損傷量是研究體外細(xì)胞衰老的最適劑量與時(shí)間。因此，本實(shí)驗(yàn)選用40 mg/mL D-gal處理48 h進(jìn)行構(gòu)建A7r5細(xì)胞衰老模型。

圖2 D-gal對(duì)A7r5細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of D-gal on the survival of A7r5 cells

2.4 POP對(duì)D-gal處理A7r5細(xì)胞增殖的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，如圖3，與對(duì)照組相比，D-gal組誘導(dǎo) A7r5 細(xì)胞存活率下降（P＜0.001，n=3）；與D-gal組相比，在加入25～800 μg/mL濃度梯度的POP 5 h后，加入 40 mg/mL D-gal處理 48 h后，均可促進(jìn)細(xì)胞增殖。濃度為100 μg/mL時(shí)POP對(duì)D-gal誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞存活率下降的保護(hù)作用最為顯著，細(xì)胞存活率為 226.87%±12.58%（P＜0.001，n=3）。因此，本實(shí)驗(yàn)選用濃度為100 μg/mL的POP及相應(yīng)濃度的VE陽性對(duì)照進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞染色的研究。

圖3 POP對(duì)D-gal誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞存活率下降的影響Fig.3 Effect of POP on D-gal-induced decline of A7r5 cell viability

2.5 POP對(duì)A7r5細(xì)胞內(nèi)SA-β-gal產(chǎn)生的影響

對(duì)D-gal及POP處理A7r5細(xì)胞后所產(chǎn)生的衰老相關(guān)SA-β-gal進(jìn)行檢測(cè)，如圖4A～D為對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照VE組（100 μg/mL）、POP 組（100 μg/mL）細(xì)胞的 SA-β-gal染色情況，圖4E 為 SA-β-gal染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。染色結(jié)果表明，與對(duì)照組相比經(jīng)D-gal處理的模型組SA-β-gal表達(dá)水平明顯增加，SA-β-gal染色陽性細(xì)胞百分比為81.33%±8.17%（P＜0.001，n=3）。100 μg/mL POP 處理組及 VE陽性對(duì)照組處理后，圖4C～D中SA-β-gal催化下生成的藍(lán)色產(chǎn)物明顯減少，SA-β-gal染色陽性細(xì)胞百分比分別為44.67%±2.49%、39.67%±2.05%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，D-gal誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生衰老，且POP有效降低了D-gal刺激A7r5細(xì)胞產(chǎn)生SA-β-gal的表達(dá)情況（P＜0.01，n=3）。

圖4 POP對(duì)D-gal誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的影響作用Fig.4 Effect of POP on the production of β-galactosidase in A7r5 cells induced by D-gal

2.6 POP對(duì)D-gal誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞產(chǎn)生ROS的抑制作用

如圖5A～D為對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照VE組（100 μg/mL）、POP 組（100 μg/mL）細(xì)胞的 ROS 熒光染色情況，圖5E為ROS染色的熒光強(qiáng)度細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，與對(duì)照組相比，模型組中陽性細(xì)胞數(shù)增多，ROS染色陽性細(xì)胞熒光強(qiáng)度為75.15%±3.70%（P＜0.001，n=3）熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。結(jié)果表明A7r5細(xì)胞經(jīng)D-gal處理后ROS水平升高。與模型組相比，VE陽性對(duì)照組和POP處理組中細(xì)胞染色陽性細(xì)胞數(shù)減少，ROS染色陽性細(xì)胞熒光強(qiáng)度分別為27.41%±1.96%、25.41%±2.58%，熒光強(qiáng)度明顯下調(diào)（P＜0.001，n=3）。細(xì)胞內(nèi)的酯酶可以將本身沒有熒光的探針DCFH-DA水解。活性氧可將水解產(chǎn)物DCFH氧化為有熒光的DCF，從而利用熒光強(qiáng)度反應(yīng)活性氧水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，POP可以有效抑制D-gal誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞中ROS的表達(dá)水平。

圖5 POP對(duì)D-gal誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞中ROS水平的影響Fig.5 Effect of POP on the level of ROS in A7r5 cells induced by D-gal

2.7 POP對(duì)A7r5細(xì)胞線粒體膜電位的影響

應(yīng)用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）對(duì)D-gal刺激A7r5細(xì)胞的線粒體膜電位變化進(jìn)行檢測(cè)。如圖6A～D為對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照VE組（100 μg/mL）、POP組（100 μg /mL）、圖6E為 JC-1染色的熒光強(qiáng)度細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。通過共聚焦顯微鏡檢測(cè)JC-1時(shí)可以參考觀察其它熒光時(shí)的設(shè)置，通過PI通道可觀察到聚合物（JC-1 aggregates）紅色熒光，F(xiàn)ITC通道可觀察到JC-1單體（JC-1 monomer）綠色熒光。并對(duì)不同通道的紅綠熒光進(jìn)行Merge。通過紅綠熒光顏色的轉(zhuǎn)變可知線粒體膜電位的變化。染色結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，經(jīng)D-gal處理的模型組JC-1染色的紅色熒光強(qiáng)度為18.74%±2.96%（P＜0.001，n=3），此時(shí)JC-1多為單體，綠色熒光強(qiáng)于紅色熒光，表明線粒體膜電位降低。與模型組相比，100 μg/mL POP處理組及VE陽性對(duì)照組處理后，JC-1在線粒體的基質(zhì)中聚集形成聚合物，綠色熒光強(qiáng)度減弱，紅色熒光強(qiáng)度升高分別為41.78%±3.24%、51.48%±4.69%，線粒體膜電位升高。結(jié)果表明POP對(duì)D-gal誘導(dǎo)的A7r5衰老細(xì)胞線粒體膜電位具有保護(hù)作用。

圖6 POP對(duì)D-gal誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞線粒體膜電位的影響作用Fig.6 Effect of POP on the mitochondrial membrane potential of A7r5 cells induced by D-gal

3 討論

隨著老齡化社會(huì)的到來，衰老相關(guān)疾病阿爾茨海默病、2型糖尿病、骨質(zhì)疏松、動(dòng)脈粥樣硬化等可嚴(yán)重影響人群健康。因此，抗衰老的研究也成為衰老研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。本研究采用水提醇沉法提取傳統(tǒng)中草藥玉竹根中的多糖活性成分，在料液比為1:20 g/mL、提取溫度90 ℃、提取時(shí)間為2.5 h條件下POP得率可達(dá)到8.23%，測(cè)得所提取的POP總糖含量為76.48%±0.036%。通過β-gal染色法、活性氧染色法、JC-1染色法深入探討POP體外抗衰老的生物學(xué)過程。

D-gal致衰老模型的生化指標(biāo)和生理指標(biāo)均與自然衰老相似，并廣泛用于抗衰老的研究[24]。目前有很多研究應(yīng)用D-gal構(gòu)建衰老模型，誘使ROS累積產(chǎn)生氧化應(yīng)激[25-26]。Liu等[27]應(yīng)用D-gal誘導(dǎo)心肌細(xì)胞衰老，影響心肌細(xì)胞內(nèi) SA-β-gal活性、ROS的產(chǎn)生及MDA含量。本研究成功構(gòu)建D-gal誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞衰老模型，并進(jìn)一步證實(shí)POP可呈劑量依賴性增強(qiáng)A7r5細(xì)胞活性，且濃度在100 μg/mL時(shí)可顯著保護(hù)D-gal誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞存活率下降，維持細(xì)胞正常活性。蔣春茂等[28]的研究證實(shí)POP濃度為1250 μg/mL時(shí)可增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的活性，并增強(qiáng)脂多糖刺激后脾臟B淋巴細(xì)胞的活性。王迦琦等[29]研究表明植物中多糖成分具有提高細(xì)胞存活率，保護(hù)細(xì)胞氧化損傷的能力。

衰老細(xì)胞通常在pH6.0時(shí)有高酶活性的SA-βgal，目前SA-β-gal已被證實(shí)與衰老密切相關(guān)[30]。SA-β-gal作為一種溶酶體水解酶，是目前應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞衰老生物標(biāo)志物[31]。吳爽等[32]的研究中表明衰老的人皮膚成纖維細(xì)胞中SA-β-gal活性顯著升高。本研究檢測(cè)不同組別A7r5細(xì)胞中SA-β-gal活性的變化，與模型組相比，POP可降低 D-gal誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞中SA-β-gal活性。因此POP可以減少衰老細(xì)胞中SA-β-gal的產(chǎn)生。

D-gal可誘導(dǎo)細(xì)胞代謝及特異性酶的改變，半乳糖合成酶可將D-gal氧化產(chǎn)生大量自由基，并使ROS水平增加，導(dǎo)致DNA穩(wěn)定性遭到破壞進(jìn)而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷細(xì)胞，改變細(xì)胞膜的成分，從而誘導(dǎo)細(xì)胞衰老[33-34]。ROS在細(xì)胞生物學(xué)中發(fā)揮重要的作用，它們主要來源于線粒體[35-36]。ROS的產(chǎn)生可以引發(fā)氧化應(yīng)激[37]，從而導(dǎo)致線粒體功能紊亂。細(xì)胞衰老與線粒體功能障礙有很大的聯(lián)系。許夢(mèng)然等[38]證實(shí)植物中草藥中的多糖成分可有效抑制ROS水平，保護(hù)及線粒體膜電位穩(wěn)定。但目前還未有關(guān)于POP抑制氧化應(yīng)激保護(hù)線粒體膜電位的研究。應(yīng)用線粒體膜電位的變化反應(yīng)其線粒體功能的穩(wěn)定性，在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中形成聚合物產(chǎn)生紅色熒光。在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體產(chǎn)生綠色熒光[39-40]。我們的研究證實(shí)，與模型組相比，POP可使D-gal誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞中ROS水平明顯降低，抑制氧化應(yīng)激，此時(shí)JC-1多為聚合體形式紅色熒光增強(qiáng)，線粒體膜電位升高。因此POP可抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，抑制線粒體膜電位下降使線粒體膜電位穩(wěn)定，從而保護(hù)D-gal誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞衰老。

4 結(jié)論

多糖為玉竹中最主要成分，毒副作用小，具有藥食同源的功效。本研究應(yīng)用簡(jiǎn)單、易操作、得率高的水提醇沉法提取POP。并將所提取純化的POP作用于A7r5細(xì)胞研究其對(duì)D-gal刺激A7r5細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明POP可有效地促進(jìn)細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞活力，抑制D-gal誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞存活率下降，減少D-gal誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞衰老時(shí)SA-βgal的產(chǎn)生。POP可降低經(jīng)D-gal誘導(dǎo)后A7r5細(xì)胞中ROS的熒光強(qiáng)度，抑制氧化應(yīng)激保護(hù)線粒體膜電位穩(wěn)定，從而抑制細(xì)胞衰老。在今后的研究中，本實(shí)驗(yàn)將針對(duì)其生物學(xué)分子機(jī)制，更深入地研究POP的抗衰老作用機(jī)制，為POP的應(yīng)用及抗衰老食品的研發(fā)領(lǐng)域提供理論依據(jù)。