賈 蕾，何 慧，向極釬，趙小紅，侯 燾,

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢 430070；2.恩施土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北恩施 445002）

恩施碎米薺（Cardamine enshiensis）是一種十字花科碎米薺屬的多年生草本植物，可藥食兩用，現(xiàn)已開始規(guī)?；N植[1]。該植物屬于高聚硒植物，脂肪含量低、蛋白含量高、礦物質(zhì)種類豐富，具有明顯的地域特色，是極具開發(fā)價(jià)值的植物資源[2]。植物中硒的蓄積通常涉及硒代氨基酸的合成，以此消除植物體出現(xiàn)的硒代謝不平衡，防止機(jī)體功能失調(diào)[3]。目前，針對碎米薺的研究多集中于其生理特性、耐硒機(jī)理、大分子物質(zhì)（如硒蛋白、硒多糖）的生理活性等方面。比如，石愛華等人對碎米薺的基礎(chǔ)理化性質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行了研究[4]；有學(xué)者利用基因組學(xué)、生物信息學(xué)等技術(shù)對碎米薺的耐硒機(jī)制進(jìn)行了初步探究[5]；還有研究發(fā)現(xiàn)碎米薺多糖具備良好的抗腫瘤活性[6]。然而，對來源于碎米薺的小分子活性物質(zhì)的研究卻鮮見，結(jié)合其耐硒、富硒的植物特點(diǎn)以及硒和肽均具有良好的抗氧化活性[7-8]，開發(fā)來源于碎米薺的抗氧化活性硒肽極具應(yīng)用前景。

近年來，國內(nèi)外研究者在植物源抗氧化肽方面已做了大量研究，證實(shí)其營養(yǎng)價(jià)值和附加價(jià)值均較高，與生物合成的抗氧化物相比，其副作用小、生產(chǎn)成本低，對于促進(jìn)人體健康具有重要意義[9]。例如，米糠蛋白水解物被證實(shí)具有良好的抗氧化、抗炎活性，能夠減輕氧化應(yīng)激，緩解代謝綜合征[10]；燕麥麩蛋白水解物在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，表現(xiàn)出了降低活性氧含量、提高抗氧化酶活性和降低促凋亡酶活性的能力，可防止氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[11]；菜籽粕蛋白水解物在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均顯示具有良好的抗氧化能力，不僅能夠清除超氧陰離子，且能夠大幅度降低體內(nèi)的丙二醛含量，是抗氧化肽的優(yōu)良來源[12]。

本研究以恩施碎米薺為原料，從中提取碎米薺蛋白，然后以自由基清除能力為評價(jià)指標(biāo)，通過蛋白酶的篩選及單因素實(shí)驗(yàn)確定最佳酶解方案，后采用膜分離設(shè)備得到抗氧化活性較強(qiáng)的小分子碎米薺硒肽，以期為碎米薺的深入開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

恩施碎米薺干株 恩施土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；堿性蛋白酶（1.50×105U/mL）、中性蛋白酶（6.69×104U/mL）、復(fù)合蛋白酶（1.85×105U/g）、胰蛋白酶（2.50×105U/g）、木瓜蛋白酶（8.00×105U/g）諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、2,2′-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS） 源葉生物；硒標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 mg/mL） 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；鹽酸、硝酸為國產(chǎn)優(yōu)級純；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)、ML204/02電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；LGJ-12冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；半自動凱氏定氮儀 海能儀器股份有限公司；Multiskan Spectrum全波長酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；截留分子量為5、3、1 kDa再生纖維素卷式膜美國 Millipore公司；Kylin-S12+AS-90L+SA50+5500型液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀 北京吉天儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程及操作要點(diǎn) 本實(shí)驗(yàn)碎米薺肽的制備工藝流程如圖1所示。恩施碎米薺干株打粉，過80目篩，低溫干燥條件下貯藏，用于碎米薺蛋白提?。坏鞍滋崛〔捎脡A液提取，調(diào)節(jié)pH以沉淀蛋白，并對所提取蛋白進(jìn)行氨基酸分析。利用商業(yè)酶酶解蛋白，酶解前碎米薺蛋白溶液沸水浴30 min預(yù)變性，酶解結(jié)束后，同樣沸水浴滅酶10 min，最終以DPPH·、ABTS+·清除能力為指標(biāo)篩選制備具有高抗氧化活性的碎米薺肽，利用超濾分級獲得活性最高的肽級分。

圖1 碎米薺硒肽制備的工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of preparation of selenopeptide from C.enshiensis

1.2.2 碎米薺蛋白提取工藝優(yōu)化及氨基酸分析

1.2.2.1 碎米薺蛋白沉淀的最佳pH的確定 利用0.10 mol/L的NaOH溶液在液料比40:1 mL/g、40 ℃的條件下對碎米薺浸提3 h，提取結(jié)束后，離心（3800 r/min，20 min）保留上清液，將其均分為11份，依次調(diào)節(jié) pH為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，靜置 2 h后，離心（10000 r/min，20 min）收集上清液。用考馬斯亮藍(lán)法測上清液中蛋白的殘留量。

1.2.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 以0.100 mol/L NaOH溶液、提取溫度40 ℃、液料比40:1 mL/g、提取時(shí)間3 h、提取1次作為固定條件，考察NaOH溶液濃度（0.025、0.050、0.075、0.100、0.125 mol/L）、提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）、液料比（20:1、30:1、40:1、50:1、60:1 mL/g）、提取時(shí)間（2、3、4、5、6 h）、提取次數(shù)（1、2、3）對碎米薺蛋白提取率的影響。

1.2.2.3 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用三因素三水平正交表L9（34），如表1所示，以蛋白提取率為測定指標(biāo)，對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 碎米薺蛋白提取正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Independent variables and levels of orthogonal of the extraction of C.enshiensis proteins

1.2.2.4 蛋白質(zhì)提取率的測定 參考文獻(xiàn)[13]對碎米薺粉的蛋白質(zhì)氮和非蛋白質(zhì)氮進(jìn)行分離，具體方法為：20 mL 5%三氯乙酸溶液在室溫下浸提0.1 g碎米薺粉1 h，非蛋白質(zhì)氮類物質(zhì)溶于三氯乙酸，蛋白質(zhì)氮存于沉淀內(nèi)。參考GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》，利用凱氏定氮法對碎米薺粉的氮含量、非蛋白質(zhì)氮含量以及碎米薺蛋白純度進(jìn)行測定，蛋白質(zhì)系數(shù)取6.25，得到碎米薺粉中的蛋白含量為9.79%。碎米薺蛋白提取率參考以下公式進(jìn)行計(jì)算：

1.2.2.5 氨基酸分析 參考GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》對碎米薺蛋白進(jìn)行氨基酸種類及含量進(jìn)行測定。

1.2.3 碎米薺硒肽制備工藝的優(yōu)化及體外抗氧化活性

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 考察堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶對碎米薺蛋白酶解效果的影響。在五種酶的最適反應(yīng)條件下（表2），按照碎米薺蛋白質(zhì)量濃度3%、加酶量3%、反應(yīng)時(shí)間3 h的酶解條件，以水解度（DH）、DPPH·和ABTS+·清除率為主要指標(biāo)，篩選出最佳試驗(yàn)用蛋白酶。

表2 蛋白酶的最適反應(yīng)條件Table 2 Optimal reaction conditions of protease

在最佳實(shí)驗(yàn)用蛋白酶的最適反應(yīng)條件下，考察碎米薺蛋白質(zhì)量濃度（2%、3%、4%、5%、6%）、酶解時(shí)間（1、2、3、4、5 h），酶底比（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）對碎米薺蛋白酶解效果的影響。其中，以碎米薺蛋白質(zhì)量濃度3%、酶解3 h、酶底比3.0%為固定條件，以DPPH·、ABTS+·清除率為主要指標(biāo)，篩選出最佳的酶解條件。

1.2.3.2 碎米薺蛋白酶解物的分級 碎米薺蛋白酶解液依次通過截留分子量為5、3、1 kDa的超濾膜，收集不同級分的濾出液，旋轉(zhuǎn)濃縮后凍干即為不同級分的碎米薺肽。測定不同級分碎米薺肽的DPPH·、ABTS+·清除能力以及硒含量，確定分離碎米薺酶解液的超濾膜規(guī)格。

1.2.3.3 水解度的確定 采用Ph-STAT 法測定 DH[14-15]。

式中：α表示NH2基團(tuán)的平均解離度，等于1.01；B表示堿液的用量（L）；Nb表示堿液的濃度（0.5 mol/L）；M表示蛋白的質(zhì)量（kg）；htot表示蛋白底物的總肽鍵數(shù)，由氨基酸檢測結(jié)果計(jì)算得知碎米薺蛋白的htot值為7.95 mmol/g。

1.2.3.4 硒含量的測定 參考GB 5009.93-2017《食品中硒含量的測定》對碎米薺不同級分肽的硒含量進(jìn)行測定。

1.2.3.5 DPPH·清除能力的測定 參考文獻(xiàn)[16]的方法對碎米薺蛋白酶解液（2.0 mg/mL）及不同級分碎米薺肽的DPPH·清除能力進(jìn)行測定。清除率為50%的質(zhì)量濃度為半有效濃度（EC50值），用來表示不同級分碎米薺肽的DPPH·清除能力。

1.2.3.6 ABTS+·清除能力的測定 參考文獻(xiàn)[17]的方法對碎米薺蛋白酶解液（2.0 mg/mL）及不同級分碎米薺肽的ABTS自由基清除能力進(jìn)行測定。用EC50值表示不同級分碎米薺肽的ABTS+·清除能力。

1.2.3.7 還原力的測定 參考文獻(xiàn)[18]的方法對碎米薺硒肽的還原力進(jìn)行測定。取100 μL待測樣品溶液與試管內(nèi)，依次加入100 μL 0.2 mol/L PBS緩沖液（pH6.6）和 100 μL 1.0% 的鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃水浴20 min，冷卻至室溫后加入100 μL 10%的三氯乙酸溶液，混勻，3000 r/min下離心10 min，取100 μL上清液于96孔板內(nèi)，依次加入等體積的蒸餾水和1/5體積的0.1%三氯化鐵溶液，混勻，室溫下避光靜置10 min，用酶標(biāo)儀在700 nm下測定吸光值。

1.2.3.8 Fe2+螯合能力 參考文獻(xiàn)[19]的方法對碎米薺硒肽的Fe2+螯合能力進(jìn)行測定。96孔板內(nèi)，依次加入100 μL待測樣品溶液、135 μL超純水和5 μL 2 mmol/L FeCl2·4H2O，室溫靜置 3 min 后，繼續(xù)加入10 μL 5 mmol/L的菲洛嗪溶液，均勻混合后，室溫靜置10 min，用酶標(biāo)儀在562 nm下測定吸光值，以EDTA-2Na作為陽性對照。

式中：A1為待測樣品的吸光值；A0為空白對照組的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，數(shù)據(jù)處理利用SPSS.17軟件，繪圖利用GraphPad Prism7.0軟件進(jìn)行處理，采用單因素方差分析（ANOVA）對P＜0.05的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碎米薺蛋白最佳沉淀pH的確定

考馬斯亮藍(lán)法是測定可溶性蛋白含量的方法，在其他條件固定的情況下，所測OD值的大小與蛋白含量呈正相關(guān)關(guān)系，因此，碎米薺蛋白提取液上清中蛋白含量最低時(shí)的pH即為沉淀碎米薺蛋白的最佳pH。如圖2所示，OD值隨著pH的增大呈現(xiàn)先減后增的趨勢，當(dāng)pH為4.0時(shí)，OD值最小，即蛋白沉降較為完全。由此確定碎米薺蛋白沉淀的最佳pH為4.0。

圖2 pH對上清液光密度的影響Fig.2 Effect of pH on the optical density of the supernate

2.2 碎米薺蛋白提取的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 NaOH溶液濃度對蛋白提取率的影響 如圖3a所示，碎米薺蛋白提取率隨NaOH溶液濃度的增大呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。因?yàn)殡S著堿液濃度的增加，碎米薺的細(xì)胞壁被破壞，更利于蛋白的溶出，當(dāng)NaOH溶液為0.1 mol/L時(shí)，蛋白提取率最高為61.57%，顯著高于其他堿液濃度提取所得蛋白（P＜0.05），而隨著堿液濃度的繼續(xù)增大，部分蛋白質(zhì)溶解，不利于沉降，碎米薺蛋白提取率隨之下降。因此，選擇碎米薺蛋白提取的最佳NaOH溶液濃度宜控制在0.10 mol/L左右。

圖3 各因素對碎米薺蛋白提取率的影響Fig.3 Influence of various factors on the extraction rate of SeCP

2.2.2 提取溫度對蛋白提取率的影響 如圖3b所示，提取溫度在30～50 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率變化不顯著（P＞0.05）；60 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率顯著高于其他處理組（P＜0.05）。隨著溫度的增加，蛋白提取率下降，其原因可能是溫度過高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，影響蛋白質(zhì)的溶出。因此，碎米薺蛋白提取的最佳溫度應(yīng)控制在60 ℃左右。

2.2.3 液料比對蛋白提取率的影響 如圖3c所示，蛋白的提取率隨著液料比的增加而趨于平穩(wěn)，在液料比為50:1 mL/g時(shí)，蛋白質(zhì)提取率最高為69.32%，且與液料比為40:1 mL/g時(shí)的提取率有顯著性差異（P＜0.05），因?yàn)殡S著液料比的增加，溶液的濃稠度變小，碎米薺粉的分散性改善，有利于蛋白的溶出。因此，蛋白質(zhì)提取的液料比宜控制在50:1 mL/g左右。

2.2.4 提取時(shí)間對蛋白質(zhì)提取率的影響 如圖3d所示，隨著提取時(shí)間的增加，碎米薺蛋白的提取率并沒有顯著性改變，說明浸提時(shí)間對蛋白的提取率影響較小。這可能是在較短的浸提時(shí)間內(nèi)，堿液就打開了碎米薺的細(xì)胞壁，與蛋白質(zhì)充分接觸，高效地促使蛋白溶出。綜合考慮，選擇3 h作為最佳提取時(shí)間。

2.2.5 提取次數(shù)對蛋白提取率的影響 如圖3e所示，碎米薺蛋白提取率隨著提取次數(shù)的增加而增大，提取2次與3次，蛋白提取率雖有增大，但已無顯著性差異（P＞0.05），故選擇碎米薺蛋白的最佳提取次數(shù)為2次。

2.3 碎米薺蛋白質(zhì)提取的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取NaOH溶液濃度、提取溫度、液料比3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，各因素設(shè)3個(gè)水平，結(jié)果如表3所示。采用極差分析可知3個(gè)因素均會影響碎米薺蛋白提取率，NaOH溶液濃度的影響最大，其最佳提取組合為A1B2C2，即采用液料比 45:1 mL/g、60 ℃、0.1 mol/L NaOH 溶液、3 h、提取2次作為碎米薺蛋白的最佳提取條件。經(jīng)驗(yàn)證，此時(shí)碎米薺蛋白的提取率為72.91%，所得碎米薺蛋白的純度為50.50%。

表3 碎米薺蛋白提取的正交試驗(yàn)及極差分析Table 3 Orthogonal test and range analysis of SeCP extraction

2.4 碎米薺蛋白的氨基酸分析

由表4可知，碎米薺蛋白富含多種氨基酸。其中，44.37%為人體必需氨基酸，疏水性氨基酸占比約52.09%。生物活性肽的活性與其分子量、鏈長、氨基酸組成以及排序等有關(guān)，疏水性氨基酸（如Leu、Ile、Pro）以及芳香族氨基酸（如Tyr）對于肽的抗氧化活性具有顯著貢獻(xiàn)[20-22]。疏水氨基酸可以增加水-脂界面多肽的存在，并有助于清除脂相中產(chǎn)生的自由基[23]。高含量的疏水性氨基酸及其在序列N端或C端第三位的位置更有利于抗氧化能力的提升，例如，在棕櫚仁餅粕蛋白水解物中有9種抗氧化肽均具有較強(qiáng)的DPPH·清除作用，其結(jié)構(gòu)中的疏水氨基酸含量較高[24]。碎米薺蛋白含有豐富的疏水性氨基酸（約 52.09%）和芳香族氨基酸（如 Phe、Tyr），具有制備抗氧化活性肽的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

表4 碎米薺蛋白的氨基酸分析結(jié)果Table 4 Amino acid analysis results of SeCP

2.5 不同蛋白酶對碎米薺蛋白酶解效果的影響

由圖4可知，經(jīng)堿性蛋白酶和胰蛋白酶處理后，碎米薺蛋白水解物的自由基清除率顯著高于其他酶解組（P＜0.05），且堿性蛋白酶在水解過程中擁有最高的DH，此時(shí)，碎米薺蛋白水解物的DPPH·、ABTS+·清除率和DH分別為84.86%、67.16%、14.58%。綜合自由基清除率和水解度考慮，選擇堿性蛋白酶作為水解碎米薺蛋白的實(shí)驗(yàn)用酶。

圖4 蛋白酶的種類對碎米薺蛋白水解物自由基清除率和水解度的影響Fig.4 Effects of protease types on free radical scavenging rate and degree of hydrolysis of SeCP hydrolysatese

2.6 碎米薺蛋白酶解的單因素實(shí)驗(yàn)

2.6.1 碎米薺蛋白質(zhì)量濃度對碎米薺蛋白酶解的影響 如圖5a所示，隨著碎米薺蛋白質(zhì)量濃度的增加，碎米薺蛋白酶解物的自由基清除率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)，DPPH·、ABTS+·清除率均達(dá)到了最高，分別為75.06%、70.41%，但與其他濃度并沒有顯著性差異（P＞0.05）。這可能是因?yàn)樗槊姿j蛋白質(zhì)量濃度較低時(shí)，蛋白酶與碎米薺的蛋白接觸未達(dá)到飽和狀態(tài)，隨著碎米薺蛋白濃度的增加，酶促反應(yīng)速率提高，繼續(xù)提高碎米薺蛋白濃度，則會出現(xiàn)底物抑制作用，不利于碎米薺蛋白水解。因此選擇4%作為碎米薺蛋白酶解的底物濃度。

2.6.2 酶解時(shí)間對碎米薺蛋白酶解的影響 如圖5b所示，隨著酶解時(shí)間的增加，ABTS+·的清除率變化不顯著，DPPH·的清除率還略有減小，當(dāng)酶解時(shí)間為1 h時(shí)，DPPH·、ABTS+·清除率分別為 76.55%、67.32%。這說明1 h就足以產(chǎn)生較多的抗氧化肽段，而隨著酶解時(shí)間的持續(xù)增長，部分活性肽被進(jìn)一步水解，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響其抗氧化活性。因此，選擇1 h作為碎米薺蛋白酶解的最佳時(shí)間。

圖5 各因素對碎米薺蛋白酶酶解效果的影響Fig.5 Influence of various factors on the enzymatic hydrolysis of SeCP

2.6.3 加酶量對碎米薺蛋白酶解的影響 如圖5c所示，當(dāng)加酶量處于0.5%～3.0%時(shí)，酶解物的自由基清除率沒有顯著性變化（P＞0.05），且隨著加酶量繼續(xù)增大，自由基清除率有所下降。當(dāng)加酶量為1.0%時(shí)，酶解物對DPPH·、ABTS+·的清除率達(dá)到最高。因此，選擇1.0%為碎米薺蛋白酶解的最佳加酶量。

2.7 不同級分碎米薺肽的硒含量及抗氧化活性

如圖6所示，不同分子量的碎米薺肽其含硒量無顯著差異（P＞0.05），但 ABTS+·清除率 EC50值卻呈現(xiàn)顯著性變化（P＜0.05）。Mw＜1 kDa的碎米薺肽其 EC50值顯著小于其他級分（P＜0.05）；DPPH·清除率的EC50值隨著分子量的減小而有所下降，但Mw＜1 kDa和Mw＜3 kDa碎米薺肽的DPPH·清除率無顯著差異（P＞0.05）。綜合考慮，選擇截留量為1 kDa的超濾膜用于分離分級碎米薺蛋白酶解液，所得碎米薺肽即為碎米薺硒肽，其含硒量為362.378 mg/kg，DPPH·和 ABTS+·清除率的 EC50值分別為 0.435和0.399 mg/mL。

圖6 不同級分碎米薺肽的硒含量及自由基清除率Fig.6 Selenium content and free radical scavenging rate of SeCP hydrolysate in different fractions

肽的分子質(zhì)量、疏水性、氨基酸組成和肽序列是影響肽抗氧化活性發(fā)揮的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)因素[25]。有研究表明小分子量的肽相較于蛋白質(zhì)往往擁有更好的抗氧化活性，其原因可能是小肽更易通過腸上皮細(xì)胞被機(jī)體吸收利用，從而發(fā)揮生理活性[26]。Li等[27]將來源于郫縣豆瓣醬的水溶性肽分離為＞5、3～5、1～3和＜1 kDa四種級分，經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分子量＜1 kDa的肽表現(xiàn)更顯著的DPPH·和ABTS+·清除活性，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與該文獻(xiàn)報(bào)道一致。硒是多種氧化還原酶的重要組成部分（如谷胱甘肽過氧化物酶、硒蛋白P），其生物活性的發(fā)揮受攝入量、賦存形式以及生物利用度等因素的影響[28]。其中，有機(jī)硒化合物的安全性高，活性穩(wěn)定，在調(diào)節(jié)氧化還原平衡、催化引發(fā)細(xì)胞損傷的過氧化物的還原以及保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷方面，表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢[29]。碎米薺肽中硒含量較高，其具有高抗氧化能力可能是硒、肽協(xié)同作用的結(jié)果。

2.8 碎米薺硒肽的體外抗氧化活性

碎米薺硒肽的還原力、Fe2+螯合能力如圖7所示。由圖7a可知，碎米薺硒肽的還原力與其質(zhì)量濃度存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，濃度越高，OD700nm值越大，還原力越強(qiáng)。由圖7b可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí)，碎米薺硒肽的Fe2+螯合能力與陽性對照EDTA-2Na大致相當(dāng)，螯合率達(dá)到了94.99%，說明碎米薺硒肽能充當(dāng)還原劑與氧化劑反應(yīng)，并能螯合金屬離子，抑制其對油脂氧化反應(yīng)的催化能力。

圖7 碎米薺硒肽的體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Antioxidant test of SeCPPs in vitro

3 結(jié)論

以恩施碎米薺為原料，利用堿溶酸沉法提取碎米薺蛋白，并在其質(zhì)量濃度4%、酶解時(shí)間1 h、堿性蛋白酶加酶量1%、超濾膜截留分子量為1 kDa的條件下制備得碎米薺硒肽，其DPPH·、ABTS+·清除率的EC50值分別為0.435和0.399 mg/mL。本研究以恩施州特色農(nóng)產(chǎn)品為原料，為開發(fā)碎米薺硒肽成為功能性食品奠定了基礎(chǔ)，也為其產(chǎn)業(yè)化提供了新思路。