謝玉瑾 宋雪云 馬永春

結(jié)核的重要病原菌是結(jié)核分枝桿菌(MTB)，屬于典型胞內(nèi)菌感染，MTB侵入機體后可發(fā)展為活動性肺結(jié)核，機體通過分泌前炎因子而清除病原菌感染，但前炎因子可進一步加重機體損傷，因而減少炎性因子的釋放，可有效改善持續(xù)性病原菌感染[1]。研究表明藥物可發(fā)揮抗炎作用從而減輕MTB誘導的炎性反應[2,3]。甲基蓮心堿屬于雙芐基異喹啉生物堿，具有抗氧化、抗炎等作用，并可通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位從而調(diào)控細胞凋亡，還可抑制骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細胞凋亡[4]。但筆者查閱文獻后發(fā)現(xiàn)關(guān)于甲基蓮心堿對MTB誘導的人單核細胞(THP-1)凋亡及炎性反應的影響尚未可知。微小RNA(miRNA)在MTB誘導的人巨噬細胞中表達異常，并可調(diào)控細胞凋亡[5]。但miRNA在甲基蓮心堿調(diào)控MTB誘導的THP-1細胞凋亡及炎性反應過程中的作用機制尚未闡明。BCG誘導的巨噬細胞中miR-3619-5p的表達水平降低，并可能參與病原菌感染過程[6]。但甲基蓮心堿是否可通過調(diào)控miR-3619-5p的表達從而抑制病原菌感染尚未可知。因此，本研究采用MTB誘導THP-1源巨噬細胞建立細胞損傷模型，探討甲基蓮心堿對MTB誘導THP-1源巨噬細胞凋亡及炎性反應的影響，探究其對miR-3619-5p的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人單核細胞THP-1購自上海中科院細胞庫；甲基蓮心堿購自購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑購自北京天根生化科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、IL-10檢測試劑盒購自美國eBioscience公司；佛波酯(PMA)、細胞凋亡試劑盒購自美國Sigma公司；結(jié)核分枝桿菌(MTB)、MTB培養(yǎng)基購自美國BD公司；兔抗人Bax、Bcl-2抗體購自美國Santa Cruz公司；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗購自美國Abcam公司；miR-con、miR-3619-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-3619-5p購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine2000試劑購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組:THP-1細胞(1×106個/ml)接種于6孔板(200 μl/孔)，加入PMA(20 ng/ml)刺激48 h后細胞轉(zhuǎn)化為巨噬細胞[7]，將THP-1源巨噬細胞(1×105個/ml)接種于24孔板(100 μl/孔)，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，待細胞貼壁生長后按照感染復數(shù)(MTB∶細胞=10∶1)感染巨噬細胞8 h[8]，PBS洗滌后加入含有慶大霉素的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，記為MTB組。同時將正常培養(yǎng)的THP-1源巨噬細胞作為NC組。分別加入不同濃度(1.25 μg/ml、2.5 μg/ml、5.0 μg/ml)的甲基蓮心堿培養(yǎng)基培養(yǎng)MTB感染的巨噬細胞24 h[9]，分別記為1.25 μg/ml Nef+MTB組、2.5 μg/ml Nef+MTB組、5.0 μg/ml Nef+MTB組。參照Lipofectamine2000試劑分別將miR-con、miR-3619-5p mimics轉(zhuǎn)染至MTB感染的巨噬細胞，分別記為MTB+miR-con組、MTB+miR-3619-5p組。參照Lipofectamine2000試劑分別將miR-con、miR-3619-5p mimics轉(zhuǎn)染至MTB感染的巨噬細胞，加入5.0 μg/ml 甲基蓮心堿培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記為anti-miR-NC+Nef+MTB組、anti-miR-3619-5p+Nef+MTB組。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率:取各組THP-1源巨噬細胞加入預冷PBS洗滌后棄上清，加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細胞后加入5 μl Annexin V-FITC后充分混勻，于37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育10 min，加入5 μl PI后室溫避光孵育10 min，應用FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測TNF-α、IL-6、IL-10的水平:取各組細胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA檢測TNF-α、IL-6、IL-10的水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 qRT-PCR檢測細胞中miR-3619-5p的表達水平:采用Trizol法提取各組THP-1源巨噬細胞中總RNA，應用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度與純度，RNA OD260/OD280處于1.8～2.0水平。反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 2 μl，10×RT Buffer 2 μl，dNTP 0.4 μl，Multiscripe RT 1 μl，10×Random Primer 2 μl，RNase-Free ddH2O補足體系至20 μl；反應條件：25℃ 10 min，37℃ 60 min，95℃ 5 min，4℃保存。以cDNA為模板進行qRT-PCR，反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μl/孔，正反向引物0.8 μl/孔，cDNA 1 μl/孔，ddH2O補足體系至20 μl；反應條件：95℃預變性5 min循環(huán)1次，95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次。應用美國ABI Step One Plus實時熒光定量PCR儀檢測細胞中miR-3619-5p的表達水平。

1.2.5 Western blot檢測Bax、Bcl-2蛋白表達:取各組THP-1源巨噬細胞加入適量RIPA裂解液提取細胞總蛋白，采用SDS-PAGE(10%)凝膠電泳分離蛋白，將其移至PDVF膜，脫脂牛奶(5%)封閉，分別添加Bax、Bcl-2與β-actin一抗(1∶1 000)，4℃孵育24 h，次日加入HRP標記的二抗(1∶5 000)，ECL化學發(fā)光法進行顯影，Bax、Bcl-2均以β-actin為內(nèi)參基因，并采用Quantityone軟件檢測條帶灰度值，蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度甲基蓮心堿對MTB處理的巨噬細胞凋亡率及凋亡蛋白的影響 與NC組比較，MTB組凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；與MTB組比較，1.25 μg/ml Nef+MTB組、2.5 μg/ml Nef+MTB組、5.0 μg/ml Nef+MTB組凋亡率降低(P<0.05)，Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 不同濃度甲基蓮心堿對MTB處理的巨噬細胞凋亡率及凋亡蛋白的影響

圖1 不同濃度甲基蓮心堿對MTB處理的巨噬細胞凋亡率及凋亡蛋白的影響;A 流式細胞儀檢測細胞凋亡;B Western Blot檢測Bax、Bcl-2蛋白的表達

2.2 Nef對MTB處理的巨噬細胞炎性因子表達水平的影響 與NC組比較，MTB組TNF-α、IL-6、IL-10的水平升高(P<0.05)；與MTB組比較，1.25 μg/ml Nef+MTB組、2.5 μg/ml Nef+MTB組、5.0 μg/ml Nef+MTB組TNF-α、IL-6、IL-10的水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 Nef對MTB處理的巨噬細胞炎性因子表達水平的影響

2.3 Nef對miR-3619-5p表達的影響 與NC組比較，MTB組miR-3619-5p的表達水平降低(P<0.05)；與MTB組比較，1.25 μg/ml Nef+MTB組、2.5 μg/ml Nef+MTB組、5.0 μg/ml Nef+MTB組miR-3619-5p的表達水平升高(P<0.05)。見表3。

表3 Nef對miR-3619-5p表達的影響

2.4 高表達miR-3619-5p對MTB處理的巨噬細胞凋亡和細胞炎性因子表達水平的影響 與MTB+miR-con組比較，MTB+miR-3619-5p組凋亡率降低(P<0.05)，Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，TNF-α、IL-6、IL-10的水平降低(P<0.05)。見表4，圖2。

圖2 Western Blot檢測Bax、Bcl-2表達

表4 高表達miR-3619-5p對MTB處理的巨噬細胞凋亡和細胞炎性因子表達水平的影響

2.5 低表達miR-3619-5p可以逆轉(zhuǎn)Nef對MTB處理的巨噬細胞凋亡和細胞炎性因子表達水平的影響 與anti-miR-NC+MTB組比較，anti-miR-3619-5p+MTB組凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)，TNF-α、IL-6、IL-10的水平升高(P<0.05)；與anti-miR-NC+Nef+MTB組比較，anti-miR-3619-5p+Nef+MTB組凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)，TNF-α、IL-6、IL-10的水平升高(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 Western Blot檢測Bax、Bcl-2表達

表5 低表達miR-3619-5p可以逆轉(zhuǎn)Nef對MTB處理的巨噬細胞凋亡和細胞炎性因子表達水平的影響

3 討論

甲基蓮心堿能夠減輕LPS誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的損傷，其機制可能與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞中NO的釋放和NOS的活力有關(guān)[10]。甲基蓮心堿通過miR-29a-3p/AQP4抑制Aβ1-42誘導的神經(jīng)細胞損傷，促進細胞存活，并抑制細胞凋亡[11]。甲基蓮心堿能減輕腦缺血再灌注損傷，其機制與抑制細胞凋亡及炎性反應有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，MTB誘導的THP-1源巨噬細胞凋亡率升高，并可促進Bax表達及抑制Bcl-2表達，與相關(guān)文獻報道[13]相似。提示成功構(gòu)建模型。本研究結(jié)果顯示，甲基蓮心堿可明顯降低MTB誘導的THP-1源巨噬細胞凋亡率，并可抑制Bax表達及促進Bcl-2表達，提示甲基蓮心堿可抑制MTB誘導的THP-1源巨噬細胞凋亡。

IL-6、TNF-α、IL-10可調(diào)節(jié)機體免疫應答，其在機體中表達水平降低可調(diào)節(jié)細胞免疫功能及抑制腫瘤生長[14]。本研究結(jié)果顯示，MTB誘導的THP-1源巨噬細胞中TNF-α、IL-6、IL-10的水平升高，而甲基蓮心堿處理后可明顯降低TNF-α、IL-6、IL-10的水平，提示甲基蓮心堿可抑制炎性反應從而減輕MTB誘導的THP-1源巨噬細胞損傷。

本研究顯示，MTB誘導的THP-1源巨噬細胞中miR-3619-5p的表達水平降低，而甲基蓮心堿可提高miR-3619-5p的表達水平，提示甲基蓮心堿可能通過上調(diào)miR-3619-5p的表達發(fā)揮作用。研究表明miR-3619-5p在人胎道平滑肌細胞中呈低表達，可調(diào)控細胞增殖過程[15]。miR-3619-5p可抑制膀胱癌的進展[16]。circZFR通過調(diào)節(jié)miR-3619-5p/CTNNB1軸而促進肝癌的進展[17]。本研究顯示，miR-3619-5p過表達可明顯降低MTB誘導的THP-1源巨噬細胞凋亡及TNF-α、IL-6、IL-10的水平，而抑制miR-3619-5p表達可提高MTB誘導的THP-1源巨噬細胞凋亡及TNF-α、IL-6、IL-10的水平，提示miR-3619-5p過表達可抑制MTB誘導的巨噬細胞凋亡及炎性反應。本研究顯示，抑制miR-3619-5p表達可逆轉(zhuǎn)甲基蓮心堿對MTB誘導的THP-1源巨噬細胞凋亡及炎性反應的作用。

綜上所述，甲基蓮心堿可通過上調(diào)miR-3619-5p的表達而抑制MTB誘導的THP-1源巨噬細胞凋亡及炎性反應從而緩解結(jié)核感染，甲基蓮心堿可能具有緩解MTB誘導的炎性反應作用，并可能成為調(diào)節(jié)免疫反應的抗結(jié)核治療的新藥物。