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        氟化鈉殼聚糖凝膠對乳牙釉質(zhì)抗酸能力的影響

        2022-03-17 12:45:54邱賽男臧睿覺梅予峰張曉旻周紅艷
        口腔醫(yī)學(xué) 2022年1期
        關(guān)鍵詞:多樂氟化鈉釉質(zhì)

        邱賽男,臧睿覺,梅予峰,張曉旻,曹 靈,周紅艷

        Stomatology,2022,42(1):68-71,91

        兒童因飲食習(xí)慣及有限的口腔衛(wèi)生清潔能力,乳牙齲病高發(fā),氟化物的使用可以有效地控制齲病的發(fā)展。pH值較低的酸會造成牙釉質(zhì)的釉柱本身及釉柱間隙的脫礦溶解,酸持續(xù)作用會造成牙齒表面的溶解伴發(fā)釉質(zhì)的軟化,并最終造成結(jié)構(gòu)缺損。本實(shí)驗(yàn)首先配制氟化鈉殼聚糖凝膠,觀察其基本性能;然后使用氟離子選擇電極檢測殼聚糖氟化鈉凝膠氟離子的釋放速率;最后比較氟化鈉殼聚糖凝膠及其他藥物預(yù)處理后的乳牙釉質(zhì)試件在酸蝕后的脫出鈣離子濃度,探討氟化鈉殼聚糖凝膠的抗酸能力。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        選擇2017年9月—12月于南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科拔除的乳前牙28顆(已征得患兒及家長同意)。要求乳前牙沒有齲壞,磨耗量適中保證唇面釉質(zhì)的面積大小,釉質(zhì)表面沒有裂紋,拔除時(shí)注意不要用力過猛,造成不必要的裂紋。

        1.2 儀器與試劑

        配制氟化鈉殼聚糖凝膠及檢測所需:殼聚糖(Sigma 448877),氟化鈉(AR,無錫亞盛化工),鹽酸(AR,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司),β-甘油磷酸鈉(AR,sigma),總離子強(qiáng)度緩沖液Ⅱ(TISAB Ⅱ,南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室提供),去離子水。大型磁力攪拌儀(國華),制冰機(jī)(三洋),DD-2B電極電位儀(江蘇姜堰市光大儀器廠),pH儀(FiveEasy),燒杯。

        試件釉質(zhì)處理和抗酸實(shí)驗(yàn)所需:乳酸(AR,滬試),抗酸指甲油(美寶蓮),原子吸收分光光度計(jì)(德國耶拿,AAS vario 6型)。

        1.3 配制5%氟化鈉殼聚糖凝膠及性能測定

        制備0.05 mol/L的鹽酸100 mL,放入殼聚糖,室溫?cái)嚢?4 h,制備出飽和的殼聚糖鹽酸溶液。使用離心機(jī),去除多余的殼聚糖粉末,保留上清。將殼聚糖上清液置于廣口瓶中,高壓蒸汽滅菌30 min,靜置冷卻到常溫,放入4 ℃冰箱備用。pH儀測定殼聚糖鹽酸溶液的pH值,去離子水配制56%(質(zhì)量濃度)的β-甘油磷酸鈉溶液。

        取2 mL殼聚糖鹽酸溶液,加入0.189 4 g NaF(參考多樂氟5%NaF濃度配制),逐滴滴加β-甘油磷酸鈉溶液1.2 mL,在冰水浴下攪拌均勻,配制成5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的殼聚糖氟化鈉凝膠。

        肉眼觀察其顏色、質(zhì)地、性狀等,倒置實(shí)驗(yàn)觀察其流動性,pH儀測定殼聚糖氟化鈉凝膠的pH值。

        1.4 氟化鈉殼聚糖凝膠釋氟速率檢測

        精確稱取4.2 g NaF,與100 mL去離子水混合,配制0.1 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)氟化鈉溶液,使用TISAB Ⅱ緩沖,甘汞氟離子選擇電極測定,獲取氟離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        制備三份殼聚糖氟化鈉凝膠樣本,甘汞氟離子選擇電極測定出氟離子的釋放濃度。

        1.5 釉質(zhì)抗酸實(shí)驗(yàn)

        1.5.1 釉質(zhì)試件準(zhǔn)備 拔出的乳前牙,用金剛砂平頸緣去除牙根,橡皮輪拋光釉質(zhì)表面,三用槍沖洗表面30 s后,置于去離子水中,4 ℃冰箱保存。存放24 h后,取出乳前牙,使用低速切割機(jī)縱向切除部分舌側(cè)硬組織,留約3 mm厚唇側(cè)硬組織片。試件唇側(cè)釉質(zhì)中央預(yù)留3 mm×3 mm的實(shí)驗(yàn)區(qū)域,其余部分用抗酸指甲油涂3遍,待指甲油干燥后,置于去離子水中,4 ℃冰箱保存。

        1.5.2 試件釉質(zhì)處理 試件隨機(jī)分成4組,每組7片,用吸水紙吸干試件表面的水分。三組在實(shí)驗(yàn)區(qū)分別均勻地涂上氟化鈉殼聚糖凝膠、殼聚糖空白凝膠、多樂氟,另一組不作處理作為空白對照。各組釉質(zhì)片在經(jīng)歷了5 min的酸蝕處理后,以Ekstrand增強(qiáng)肉眼光學(xué)檢查視診等級計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)(表1)評定。

        表1 Ekstrand增強(qiáng)肉眼光學(xué)檢查視診等級計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)

        上藥處理后,樣本置于燒杯中,加入去離子水,保持整體的濕潤環(huán)境,并放入37 ℃恒溫箱中4 h。取出各組試件,用尖刀片輕柔去除表面附著的藥物,用三用槍沖洗試件30 s,置于去離子水中備用。

        1.5.3 釉質(zhì)抗酸實(shí)驗(yàn) 配制0.1 mol/L的乳酸溶液,常溫測定pH值為4.0。每一組的試件分別浸泡于5 mL 0.1 mol/L乳酸溶液,酸蝕5 min,取出試件,用3 mL去離子水沖洗,收集各樣本的酸蝕溶液和沖洗液8 mL。溶液進(jìn)行火焰原子吸收分光光度法檢測溶液中鈣離子的濃度。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        各組數(shù)值錄入SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析,不同組的鈣離子濃度進(jìn)行方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 殼聚糖氟化鈉凝膠基本性能

        殼聚糖氟化鈉凝膠常溫下呈淡黃色粘稠清亮液體,pH=6.98。放置在37 ℃恒溫箱內(nèi),3 min初步凝固,10 min后從恒溫箱內(nèi)取出,呈軟白色果凍狀凝膠,質(zhì)軟(圖1)。

        左側(cè)為殼聚糖氟化鈉凝膠常溫下保存;右側(cè)為殼聚糖氟化鈉凝膠經(jīng)10 min 37 ℃恒溫箱保存

        2.2 殼聚糖氟化鈉凝膠釋放率

        氟化鈉標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)氟離子選擇電極測定氟離子標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)為y=41.143x-66.667(x軸Ig濃度,y軸為氟離子選擇電極的測定值);線性相關(guān)指數(shù)R2=0.934 5(圖2)。

        圖2 氟離子標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

        2.3 不同組釉質(zhì)試件酸蝕后使用Ekstrand增強(qiáng)肉眼光學(xué)檢查視診等級計(jì)分

        圖3 殼聚糖氟化鈉凝膠釋放曲線

        各組吹干5 s后發(fā)現(xiàn)不透明的斑塊,均為1級計(jì)分,潮濕牙面無明顯異常,其中殼聚糖空白凝膠組和空白對照組表現(xiàn)的色澤較殼聚糖氟化鈉凝膠組及多樂氟組要更白,通透性更差。

        2.4 不同組釉質(zhì)試件乳酸溶液中鈣離子濃度比較

        氟化鈉殼聚糖凝膠、殼聚糖空白凝膠、多樂氟、對照組鈣離子濃度分別為(4.29±0.65)、(7.20±0.88)、(4.22±0.34)、(7.34±1.41)mg/L。氟化鈉殼聚糖凝膠組與多樂氟組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),與殼聚糖空白凝膠組及空白對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),且鈣離子濃度低于殼聚糖空白凝膠組及空白對照組。

        3 討 論

        氟化物是公認(rèn)的防齲藥物之一,從20世紀(jì)初就已經(jīng)開始進(jìn)行應(yīng)用,具有降低釉質(zhì)溶解度和促進(jìn)釉質(zhì)再礦化、影響致齲細(xì)菌代謝、改變牙齒萌出后的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),從而具有防齲的功效[1]。含氟產(chǎn)品的使用可以是患者進(jìn)行的自我保健方法,也可以是專業(yè)的口腔醫(yī)生給予的專業(yè)預(yù)防操作保健。對于兒童來說,使用含氟牙膏的量及含氟漱口水的用量控制尤為重要,因?yàn)閮和暮芰屯萄实呐浜夏芰τ邢?,過量氟化物的使用,會引起兒童的中毒反應(yīng)。所以臨床上對兒童用氟的指導(dǎo)理念是小于4歲的不宜局部用氟,也不推薦使用含氟牙膏及含氟漱口水,而是由臨床醫(yī)生進(jìn)行含氟涂料或凝膠的涂布操作。

        Chau等[2]證實(shí),氟化物可以抑制細(xì)菌生物膜的形成,且其活性與時(shí)間有一定的相關(guān)性。其在用量和次數(shù)上有更多的限制,這樣對于控制氟的過量攝入有很好的保證。涂料在操作方式和方法上和凝膠有相似之處,都需要保持釉質(zhì)的干燥,在藥物涂布完后一定時(shí)間內(nèi)不喝水不吃東西,從操作的簡便性上看,并不是很復(fù)雜的操作。不過操作的難度和兒童對命令以及行為控制的配合程度有關(guān)[3]。

        歐洲兒科牙科學(xué)會(EAPD)發(fā)布的氟化物應(yīng)用指南[4]指出兒童含氟凝膠較涂料的操作要更簡單,清潔完牙面只需患者佩戴牙合墊輕咬幾分鐘即可,操作的用量仍需要嚴(yán)格控制。多樂氟的出現(xiàn),使得操作更為簡便,涂在釉質(zhì)表面的多樂氟在遇到唾液后可以硬化,只要控制兒童4 h不進(jìn)食飲水,唾液不下咽即可。

        但多樂氟凝膠成本相對較貴,用殼聚糖水凝膠作為一種凝膠載體,它的原料殼聚糖是自然界中的第二大多糖甲殼素的脫乙?;a(chǎn)物,來源豐富制取便宜,其價(jià)格便宜,同時(shí)Arnaud等[5]指出單純的殼聚糖溶液也有保護(hù)牙釉質(zhì)、抵抗酸蝕的作用。

        制作殼聚糖水凝膠的過程并不復(fù)雜,完成的凝膠為智能型凝膠,溫度升高凝膠由液相向膠體相轉(zhuǎn)變,這對于凝膠的保存以及使用時(shí)的方便程度都有很好的指導(dǎo)意義。臧圣奇等[6]的實(shí)驗(yàn)通過對殼聚糖溫敏凝膠的凝膠時(shí)間、黏度、溶脹率、降解率、微觀結(jié)構(gòu)等方面的研究,肯定了殼聚糖凝膠作為組織工程支架,復(fù)合細(xì)胞、藥物、蛋白的利用價(jià)值。

        殼聚糖氟化鈉凝膠的pH值接近中性,對藥物和人體組織的損害較小,生物相容性較好。作為大分子多糖,殼聚糖氟化鈉凝膠提供的空間可以作為藥物的良好載體。近年來多樂氟作為口腔局部用藥的經(jīng)典藥物,常作為評估其他藥物氟離子釋放率的參考標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)我們研究發(fā)現(xiàn)氟化鈉殼聚糖凝膠組與多樂氟組4 h氟離子釋放率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Ruel-Gariépy等[7-9]的研究證明,殼聚糖溫敏凝膠作為藥物的載體,其釋放速率與藥物的分子量有關(guān),藥物分子量越大,釋放速率越慢,本實(shí)驗(yàn)中氟化鈉作為小分子親水藥物4 h釋放70%是可以接受的。同時(shí)Keegan等[10]制作的殼聚糖納米噴霧搭載氟化鈉,其最大搭載藥物量達(dá)到14%的氟化鈉含量,釋放率達(dá)到84.1%,證明了殼聚糖作為氟化鈉搭載載體的能力。因此本課題設(shè)計(jì)制作的殼聚糖氟化鈉凝膠是成功的,搭載了高濃度的氟化鈉,并且很好地控制了藥物的pH值,其藥物的釋放率也符合殼聚糖溫敏水凝膠的一般特性。

        釉質(zhì)的早期齲壞即為釉質(zhì)表面在細(xì)菌代謝產(chǎn)物的酸蝕作用下出現(xiàn)的表面礦物質(zhì)析出,呈現(xiàn)出白堊色的色澤變化,白堊色越不明顯說明其脫礦情況越低。經(jīng)由Ekstrand增強(qiáng)肉眼光學(xué)檢查視診等級計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)[11]評定,各組都表現(xiàn)為釉質(zhì)脫礦集中在釉質(zhì)外層1/2,類似于臨床上見到的釉質(zhì)脫礦的早期齲壞。氟化鈉殼聚糖凝膠及多樂氟處理過的試件,在肉眼觀察其白堊色時(shí),無單純殼聚糖水凝膠和未處理組明顯。Torlakovic等[12]的研究結(jié)果說明早期齲的白色病損,其病變程度和白堊色深度呈正相關(guān)的,本實(shí)驗(yàn)的肉眼觀察結(jié)果說明氟化鈉殼聚糖凝膠及多樂氟抑制酸蝕的能力優(yōu)于殼聚糖空白凝膠及空白對照組。

        釉質(zhì)表面的酸蝕液進(jìn)行鈣離子濃度的檢測,是一種經(jīng)典的定量檢測方法Grenby[13]早在1996年釉質(zhì)檢測方法的綜述中就有詳細(xì)的描述,可以有效量化釉質(zhì)表面脫礦的程度。而且這種方法在體內(nèi)體外都可以進(jìn)行。Young等[14]驗(yàn)指出釉質(zhì)的化學(xué)檢測在體內(nèi)試驗(yàn)中需要絕對的隔絕唾液,以防止影響檢測結(jié)果,而體外實(shí)驗(yàn)的操作更加準(zhǔn)確簡便。從我們的結(jié)果可知,實(shí)驗(yàn)各組在酸蝕過程中脫出的鈣離子濃度是有區(qū)別的。組間的比較氟化鈉殼聚糖凝膠與多樂氟處理組析出的鈣離子濃度數(shù)值無差異,殼聚糖空白水凝膠與空白組無差異,同時(shí)氟化鈉殼聚糖凝膠、多樂氟析出的鈣離子濃度要遠(yuǎn)低于殼聚糖空白水凝膠及空白組。這說明,氟化鈉殼聚糖凝膠及多樂氟抗酸的效果優(yōu)于殼聚糖空白水凝膠,并且效果相似,這與肉眼觀察到的結(jié)果相同,說明了氟化鈉殼聚糖凝膠與多樂氟的抗酸蝕效果。

        多樂氟作為防齲處理的金標(biāo)準(zhǔn),一直被臨床廣泛應(yīng)用,其pH值為4.5[15],Magalh?es等[16]進(jìn)行的TiF4和NaF涂料的實(shí)驗(yàn),指出釉質(zhì)表面在各種藥物處理后,最高可以持續(xù)抵抗酸蝕30 min。同時(shí)Arnaud的實(shí)驗(yàn)[5]報(bào)道,殼聚糖溶液涂抹在釉質(zhì)表面產(chǎn)生的抗酸效果是殼聚糖本身滲透入釉質(zhì)層產(chǎn)生抗酸效果與本研究所提及的氟化鈉殼聚糖凝膠抗酸原理不同,本研究中的氟化鈉殼聚糖凝膠與殼聚糖空白凝膠的抗酸效果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且氟化鈉殼聚糖凝膠抗酸性能更好,這一效果提示其抗酸效果來自氟化物。

        釉質(zhì)的檢測方法有其多樣性,主要分為定量檢測和定性檢測[17]。SEM和EDS的聯(lián)合使用,使定性和定量的研究很好地結(jié)合在一起。在抗酸蝕的過程中,肉眼對于釉質(zhì)表面的變化的觀察,在臨床應(yīng)用中起到大致的指導(dǎo)性說明作用。乳牙牙釉質(zhì)薄,平均約1 mm左右,打磨拋光制成標(biāo)準(zhǔn)試件則表面的釉質(zhì)層可能已經(jīng)剝脫,所以選用化學(xué)檢測這一經(jīng)典方法,可以更明確地指出氟化鈉殼聚糖凝膠抗酸蝕的能力。

        R?lla、Saunders等[18-19]的實(shí)驗(yàn)證實(shí),氟化物具有保護(hù)牙體硬組織免于酸蝕傷害的作用,雖然也有文獻(xiàn)指出氟化物的保護(hù)作用有限[20],但大多數(shù)的文獻(xiàn)支持的結(jié)論與我們研究的結(jié)果相似,殼聚糖凝膠作為載體很好地使氟化物與釉質(zhì)接觸和反應(yīng),氟化鈉殼聚糖凝膠具有4 h的持續(xù)釋放能力,持續(xù)高濃度的氟化鈉提高了釉質(zhì)的抗酸蝕能力。

        氟化鈉殼聚糖凝膠處理后的乳前牙釉質(zhì),與金標(biāo)準(zhǔn)的多樂氟達(dá)到了一致的抗酸能力;所以氟化鈉殼聚糖凝膠有望作為防治乳牙早期齲的藥物,并應(yīng)用于臨床。

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