孔繁銘，胡 悅，辛 宇，賈珍珍，霍文凱，張煒煜

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130117）

植物黃體素（lutein），又稱(chēng)葉黃素，屬于類(lèi)胡蘿卜素中的一種四萜類(lèi)化合物，廣泛存在于果蔬、在藻類(lèi)植物中，是維生素A的重要來(lái)源[1]。天然黃體素為菱格狀的鮮艷黃色晶體[2]，其結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)紫羅酮環(huán)，可作為強(qiáng)氧化劑用于抗氧化、抗視疲勞以及預(yù)防心血管疾病，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健品等領(lǐng)域[3]。但黃體素水溶性較差，微溶于油，存在多個(gè)不飽和鍵和末端雙羥基結(jié)構(gòu)，化學(xué)性質(zhì)較不穩(wěn)定，易受溫度、光照、金屬離子等各種理化因素的影響而產(chǎn)生變化[4]。

類(lèi)脂質(zhì)體復(fù)合物是一種良好的藥物載體，利用非離子型表面活性劑與膽固醇在水合介質(zhì)中形成雙分子層的結(jié)構(gòu)，含有疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)[5]。其制備方法與脂質(zhì)體制備方法相似，區(qū)別為將磷脂替換為非離子型表面活性劑，增強(qiáng)其抗氧化性，降低制備的成本。Minamisakamoto等[6]研究發(fā)現(xiàn)DOXPEG類(lèi)脂質(zhì)體貫穿給藥可大幅度提高抗腫瘤效果，Damrongrungruang等[7]近期研究發(fā)現(xiàn)將紫糯玉米和藍(lán)蝶豌豆花瓣提取物通過(guò)類(lèi)脂質(zhì)體復(fù)合物包合可加速創(chuàng)面愈合。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)擬制備黃體素類(lèi)脂質(zhì)體以解決黃體素理化性質(zhì)不穩(wěn)定、水溶性差等問(wèn)題，同時(shí)降低工藝成本。

1 儀器與試劑

1.1 儀器設(shè)備

KQ200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（常州市江南實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)）、AR2140型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）、UV-5100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（山東析遠(yuǎn)儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

葉黃素原料藥（上海源葉生物有限公司）、葉黃素對(duì)照品（上海源葉生物有限公司）、膽固醇（上海源葉生物有限公司）、硬脂山梨坦（上海麥克林生化科技有限公司）、聚山梨酯80（上海麥克林生化科技有限公司）、無(wú)水乙醇（天津新通精細(xì)化工有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃體素類(lèi)脂質(zhì)體制備

取處方量黃體素、膽固醇、Span60與Tween80溶于無(wú)水乙醇中，恒溫水浴下將有機(jī)相緩慢注入水相中，并攪拌至無(wú)水乙醇完全蒸發(fā)，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2 體外分析方法建立

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定黃體素標(biāo)準(zhǔn)品0.005 g，置25 mL棕色量瓶中，加無(wú)水乙醇定容，搖勻，制成0.2 mg.mL黃體素的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取黃體素類(lèi)脂質(zhì)體分散液于離心管中，以12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心20 min，取下層蒸干后用無(wú)水乙醇溶解，吸取200 uL于10 mL棕色量瓶中，定容，混勻，濾過(guò)，即得。

2.2.3 確定最佳吸收波長(zhǎng) 精密稱(chēng)取0.002 g葉黃素，加無(wú)水乙醇溶解，移至25 mL棕色量瓶，定容。移取1.0 mL置25 mL棕色量瓶中，加無(wú)水乙醇定容。用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描發(fā)現(xiàn)葉黃素在447 nm處有最大吸收，故選447 nm作為最大吸收波長(zhǎng)。見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 黃體素對(duì)照品在各波長(zhǎng)下的吸光度

圖2 黃體素供試品在各波長(zhǎng)下的吸光度

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立 量取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL、1.1 mL分別加入10 mL棕色量瓶中，定容。在447 nm處測(cè)定吸光度，重復(fù)3次，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

如圖3所示，黃體素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y= 25.143X+0.011 6，R2=0.999 2，表明黃體素的吸光度與濃度在0.012 mg·mL-1～0.022 mg·mL-1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖3 黃體素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取黃體素類(lèi)脂質(zhì)體，按2.2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，按紫外分光光度法在447 nm處測(cè)定溶液吸光度，1 d內(nèi)測(cè)定5次。根據(jù)表3，測(cè)量RSD值＜2%（n= 5），此分析方法的精密度良好。見(jiàn)表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 按處方量120%、100%、80%，按2.2.2項(xiàng)下制備3種不同濃度的供試液，平均回收率99.29%，RSD值0.910%，表明此分析方法準(zhǔn)確度良好。見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 %

2.2.7 包封率、載藥量測(cè)定 取黃體素類(lèi)脂質(zhì)體分散液2 mL于12 000 r·min-1下離心20 min，取上清液200 μL置10 mL棕色量瓶，加無(wú)水乙醇定容，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，根據(jù)黃體素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)用紫外分光光度計(jì)法計(jì)算游離藥物的含量，進(jìn)而計(jì)算包封率與載藥量。包封率=（總藥量-游離藥量）÷總藥量×100%。載藥量=類(lèi)脂質(zhì)體中所含藥重÷類(lèi)脂質(zhì)體總重×100%

2.3 處方單因素考察

2.3.1 表面活性劑用量 固定黃體素用量0.01g，膽固醇用量0.05 g，Span60與Tween80比例為4:1，水化溫度50 ℃，水相體積為40 mL，攪拌時(shí)間30 min，有機(jī)相注入速度為0.8 mL·min-1，有機(jī)相體積5 mL，攪拌速度450 r·min-1?？疾觳煌昧縎pan60 與Tween80（0.04 g、0.06 g、0.08 g、0.10 g、0.12 g）對(duì)包封率與載藥量的影響。結(jié)果表明，表面活性劑用量為0.08 g時(shí)包封率達(dá)到峰值，超過(guò)0.08 g后，包封率呈下降趨勢(shì)，因此初步確定表面活性劑用量為0.08 g。見(jiàn)表3。

表3 非離子表面活性劑用量單因素考察結(jié)果 %

2.3.2 表面活性劑比例 固定其他條件同“2.3.1”?？疾觳煌壤齋pan60與Tween80（4:1、4:2、4:3、4:4、4:5）對(duì)包封率與載藥量的影響。結(jié)果表明，表面活性劑比例為4:4時(shí)包封率達(dá)到峰值，隨著Tween80的比例的增加，包裹親脂性藥物的能力減弱，因此初步確定表面活性劑比例為4:4。見(jiàn)表4。

表4 表面活性劑比例單因素考察 %

2.3.3 膽固醇用量 固定其他條件同“2.3.1”?？疾觳煌昧康哪懝檀迹?.03 g、0.04 g、0.05 g、0.06 g、0.07 g）對(duì)包封率和載藥量的影響，結(jié)果表明，包封率與載藥量最好呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)膽固醇用量達(dá)到0.05 g時(shí)包封率和載藥量最好。見(jiàn)表5。

表5 膽固醇用量單因素考察結(jié)果 %

2.3.4 黃體素用量 固定其他條件同“2.3.1”?？疾觳煌昧康狞S體素（0.005 g、0.010 g、0.015 g、0.020 g、0.025 g）類(lèi)對(duì)包封率和載藥量的影響。結(jié)果表明，當(dāng)黃體素用量為0.015 g時(shí)包封率達(dá)最峰值。隨著黃體素用量繼續(xù)增加，超過(guò)類(lèi)脂質(zhì)體承載能力的黃體素保留在溶液中，包封率和載藥量也隨之下降，因此選擇黃體素最佳用量為0.015 g。見(jiàn)表6。

表6 黃體素用量單因素考察結(jié)果 %

2.3.5 水化溫度 固定其他條件同“2.3.1”?？疾焖瘻囟龋?0 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）對(duì)黃體素類(lèi)脂質(zhì)體理化性質(zhì)的影響，結(jié)果表明，當(dāng)水化溫度為60 ℃時(shí)包封率與載藥量達(dá)到峰值，當(dāng)水化溫度大于60 ℃時(shí)，包封率與載藥量逐漸降低，分析原因可能為高溫致使黃體素分解。因此判斷最佳水化溫度為60 ℃。見(jiàn)表7。

表7 水化溫度單因素考察結(jié)果 %

2.3.6 水相體積 固定其他條件同“2.3.1”?？疾觳煌w積水相（10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL），對(duì)黃體素類(lèi)脂質(zhì)體包封率和載藥量的影響。結(jié)果表明，水相體積為30 mL時(shí)包封率、載藥量均達(dá)到峰值，隨著水相增加，包封率與載藥量呈下降趨勢(shì)。見(jiàn)表8。

表8 水相體積單因素考察 %

2.3.7 攪拌時(shí)間 固定其他條件參照“2.3.1”，考察不同攪拌時(shí)間（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）對(duì)黃體素類(lèi)脂質(zhì)體包封率及載藥量的影響。結(jié)果表明，攪拌時(shí)間為50 min時(shí)包封率與載藥量均達(dá)到峰值，之后包封率與載藥量有所下降，原因可能是超過(guò)50 min后黃體素分解過(guò)多。因此初步判斷最佳攪拌時(shí)間為50 min。見(jiàn)表9。

表9 攪拌時(shí)間單因素考察 %

2.3.8 有機(jī)相注入速度 固定其他條件參照“2.3.1”?？疾觳煌袡C(jī)相注入速度（0.4 mL·min-1、0.8 mL·min-1、1.6 mL·min-1、2.4 mL·min-1、3.2 mL·min-1）的包封率與載藥量情況，結(jié)果表明，有機(jī)相注入速度為0.8 mL·min-1時(shí)包封率與載藥量均到達(dá)峰值，速度大于0.8 mL·min-1后黃體素?zé)o法及時(shí)進(jìn)入類(lèi)脂質(zhì)體的囊泡中，導(dǎo)致包封率與載藥量減低，因此初步確定有機(jī)相最佳注入速度為 0.8 mL·min-1。見(jiàn)表10。

表10 有機(jī)相注入速度單因素考察 %

2.3.9 有機(jī)相體積 固定其他條件參照“2.3.1”?？疾觳煌w積無(wú)水乙醇（2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL）對(duì)包封率與載藥量的影響。結(jié)果表明，有機(jī)相體積為5 mL時(shí)包封率與載藥量均達(dá)峰值，隨著有機(jī)相體積增大，包封率與載藥量逐漸降低，因此初步確定有機(jī)相最佳體積為5 mL。見(jiàn)表11。

表11 有機(jī)相體積單因素考察 %

2.3.10 攪拌速度 固定其他條件同“2.3.1”?？疾觳煌瑪嚢杷俣龋?00 r·min-1、150 r·min-1、300 r·min-1、450 r·min-1、600 r·min-1）對(duì)包封率與載藥量的影響。結(jié)果表明，攪拌速度為300 r·min-1時(shí)包封率與載藥量均達(dá)峰值，當(dāng)攪拌速度超過(guò)300 r·min-1時(shí)包封率與載藥量逐漸下降，因此初步判斷最佳攪拌速度為300 r·min-1。見(jiàn)表 12。

表12 攪拌速度單因素考察 %

2.4 歸一化值（OD）的計(jì)算

評(píng)價(jià)指標(biāo)綜合包封率和載藥量的歸一化值（overall desirability，OD）。對(duì)取值越大越好的EE%、DL%分別進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，求各個(gè)指標(biāo)歸一值（d）。公式如下：

式中d1、d2分別代表黃體素脂質(zhì)體的EE%和DL%歸一化值，Y1為實(shí)測(cè)值，Ymin是實(shí)驗(yàn)中包封率和載藥量測(cè)得最小值，Ymax是實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的包封率和載藥量最大值。將各指標(biāo)的歸一值綜合求算，得總歸一化值，公式如下：

2.5 處方優(yōu)化

2.5.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在前期單因素考察研究的基礎(chǔ)上，設(shè)置表面活性劑用量（A）、表面活性劑比例（B）、膽固醇用量（C）、葉黃素用量（D）、水化溫度（E）、水相體積（F）、攪拌時(shí)間（G）、有機(jī)相注入速度（H）、有機(jī)相體積（J）、攪拌速度（K）10個(gè)主要影響因素為自變量，以黃體素類(lèi)脂質(zhì)體的OD值為響應(yīng)值，設(shè)定各因素兩水平（-1、+1）的取值。設(shè)計(jì)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表13。

表13 Plackett-Burman試驗(yàn)因素及水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表14，用 Minitab 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，得到其回歸模型方程為OD =0.39846-0.01985A+0.16169B+0.01011C+0.17627D+0.20907E-0.08436F-0.02202G+0.02961H+0.00730J-0.06576K，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表15，模型P值為0.049，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；F值為252.92，r= 0.986 5，提示回歸擬合程度較好。由圖4可知，B、D及E差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對(duì)黃體素類(lèi)脂質(zhì)體OD值顯著性排列為E＞B＞D；其余因素對(duì)OD值無(wú)顯著性影響（P＞0.05）。

圖4 響應(yīng)值（Y）的Pareto圖（a）及正態(tài)圖（b）

表14 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

表15 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的顯著性結(jié)果

2.5.2 Box-Behnken響應(yīng)面法 應(yīng)用 Design-Expert.V8.0.6.1軟件設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken響應(yīng)面法，以表面活性劑比例（A）、黃體素用量（B）、水化溫度（C）為考察因素，以O(shè)D值為響應(yīng)值，對(duì)3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。

應(yīng)用 Design-Expert.V8.0.6.1對(duì)表17進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表18，以O(shè)D值對(duì)各因素自變量進(jìn)行模型擬合，通過(guò)擬合得到的二次回歸方程為OD = 0.8582+0.0725A+0.0803B-0.0838C-0.0845AB-0.0875AC-0.0265BC-0.1914A2-0.1474B2-0.0983C2（R2=0.9393，失擬度檢驗(yàn)F值為1.45，P= 0.3537＞0.05），由擬合方程結(jié)果可知擬合模型F值為12.04（P＜0.05），說(shuō)明擬合模型擬合度高，失擬項(xiàng) F值較小為1.45（P=0.353 7＞0.05），表明失擬項(xiàng)不顯著，該擬合模型擬合結(jié)果良好，可用于實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。信噪比值為10.70，相對(duì)較高，證明該模型可用于實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。

表16 Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平

表17 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表18 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果

根據(jù)二次回歸方程擬合結(jié)果，將一個(gè)因素固定，進(jìn)行OD對(duì)其他兩個(gè)因素的擬合，可得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的等高線(xiàn)與三維效應(yīng)曲面圖對(duì)黃體素類(lèi)脂質(zhì)體工藝參數(shù)的優(yōu)選。處方優(yōu)化結(jié)果為：表面活性劑比例為0.703:1，葉黃素用量為15.4 mg，水化溫度為32 ℃。見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 因素A及因素B對(duì)綜合評(píng)分OD的等高線(xiàn)圖和三維響應(yīng)圖

圖6 因素A及因素C對(duì)綜合評(píng)分OD的等高線(xiàn)圖和三維響應(yīng)圖

2.5.3 工藝驗(yàn)證 根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最佳工藝，即表面活性劑比例為0.703:1，葉黃素用量為15.4 mg，水化溫度為32 ℃，預(yù)測(cè)OD值為0.81，進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明3批黃體素類(lèi)脂質(zhì)體的平均包封率為（75.283±0.22）%，平均載藥量為（38.512±0.21）%，平均OD值為0.794。證明黃體素類(lèi)脂質(zhì)體最佳制備工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃體素受外界因素影響較大，導(dǎo)致藥物快速分解。在單因素實(shí)驗(yàn)、PBD實(shí)驗(yàn)、BBD實(shí)驗(yàn)中，過(guò)高的溫度使水相蒸發(fā)速率加快，從而影響包封率與載藥量的測(cè)定，故本實(shí)驗(yàn)制備類(lèi)脂質(zhì)體時(shí)，將反應(yīng)容器半封口，以減少水相的流失。

類(lèi)脂質(zhì)體的材料主要由非離子表面活性劑和膽固醇組成，二者在水合介質(zhì)中形成的雙分子層包括了親水部分和親脂部分，由于黃體素親脂性相對(duì)較好，因此在包合過(guò)程中，黃體素進(jìn)入親脂部分較多，而親水部分幾乎不含有黃體素，因此可利用親水腔作后續(xù)的創(chuàng)新。

本研究運(yùn)用質(zhì)量源于設(shè)計(jì)理念，對(duì)影響黃體素類(lèi)脂質(zhì)體制備因素進(jìn)行剖析，結(jié)合 PBD及BBD，優(yōu)化黃體素類(lèi)脂質(zhì)體的制備工藝。傳統(tǒng)的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)利用線(xiàn)性數(shù)學(xué)模型，分析出多個(gè)因素水平的最佳組合；但正交設(shè)計(jì)只能分析離散型數(shù)據(jù)，其科學(xué)性及預(yù)測(cè)性較差。PBD聯(lián)合BBD，采取線(xiàn)性模型得到回歸方程，通過(guò)合理預(yù)測(cè)得出最佳工藝條件更具有科學(xué)性。