喬伊娜，劉夢(mèng)輝，陳瓊芳，馮曉純

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長(zhǎng)春 130021）

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）是一種特殊類型的哮喘，咳嗽是其主要的臨床癥狀，發(fā)病機(jī)制與哮喘相似，據(jù)我國(guó)流行病調(diào)查研究[1]顯示，CVA是導(dǎo)致小兒慢性咳嗽（病程＞4周）的第二大病因。有研究[2-3]顯示，6～14歲兒童中1/3～1/2的CVA患兒最終會(huì)發(fā)展為典型哮喘；咳嗽的性質(zhì)主要為干咳、夜間咳嗽、運(yùn)動(dòng)后咳嗽等；與典型哮喘相比，CVA疾病程度較輕[4]，發(fā)病機(jī)制包括氣道持續(xù)慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性、氣道重塑等，根據(jù)其臨床特殊表現(xiàn)，發(fā)病機(jī)制還包括咳嗽敏感性增高；CVA[5]四季均可發(fā)病，以春冬季節(jié)好發(fā)，病程一般在1～2個(gè)月。近年來，中醫(yī)藥治療該病的臨床優(yōu)勢(shì)逐漸被研究和報(bào)道，中醫(yī)藥治療CVA較西醫(yī)復(fù)發(fā)率低、遠(yuǎn)期療效更好，可以彌補(bǔ)西醫(yī)治療的不足[6-7]。

CVA病因病機(jī)復(fù)雜且涉及面廣，單基因-單靶點(diǎn)的藥物治療模式遠(yuǎn)不能應(yīng)對(duì)病機(jī)復(fù)雜的病證。中藥方劑配伍是在中醫(yī)治病“整體觀念”的指導(dǎo)下依據(jù)其獨(dú)特的“四氣五味”、君臣佐使加減變化治療疾病，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)分析的整體性與系統(tǒng)綜合性相吻合[8-9]。然而，這兩味藥如何協(xié)同發(fā)揮作用，其機(jī)制尚不明確，基于此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討麻黃和全蝎有效成分配伍治療CVA作用機(jī)制，為對(duì)該藥的藥效成分篩選和進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 麻黃、全蝎化學(xué)成分研究

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、中藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid/）分別收集麻黃、全蝎（TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)未收錄）的主要化學(xué)成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為條件[10]篩選有效活性成分，OB和DL是藥物活性成分在研究、開發(fā)中的兩個(gè)重要參數(shù)，分別反映了藥物在體內(nèi)吸收與已有藥物的類似性、開發(fā)成藥的可能性；使用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）對(duì)化合物名稱和分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行核對(duì)，并用SwissTargetPrediction網(wǎng)站（http://www.swisstargetprediction.ch/）預(yù)測(cè)其靶點(diǎn)，通過查閱文獻(xiàn)手動(dòng)篩選不符合條件但是含量高或活性強(qiáng)的化合物。

1.2 CVA靶點(diǎn)的收集

Genecards（https://www.gene cards.org/）是一個(gè)以基因?yàn)橹行牡臄?shù)據(jù)庫(kù)，以cough variant asthma為關(guān)鍵詞查詢并下載有關(guān)的全部基因，并挖掘文獻(xiàn)報(bào)道[11]補(bǔ)充全蝎的化學(xué)成分膽甾醇（MOL000953-cholesterol），篩除其中重復(fù)項(xiàng)。由于靶點(diǎn)信息來源于不同物種及存在命名不規(guī)范等現(xiàn)象，因此，先對(duì)蛋白進(jìn)行基因信息標(biāo)準(zhǔn)化，本文使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）的搜索功能，將物種設(shè)置為Human，將檢索得到的所有靶點(diǎn)校正為基因名稱。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將獲得的中藥-疾病共有基因輸入String（https://string-d b.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)的Multiple proteins搜索功能中，選擇“Homo sapiens”，根據(jù)得到的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜程度調(diào)整“minimum required interaction score”，隱藏游離節(jié)點(diǎn)進(jìn)行麻黃-全蝎治病靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建（PPI）。并通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治鲕浖﨏ytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，使藥物-成分-靶點(diǎn)關(guān)系可視化，使用插件Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò)的靶點(diǎn)度值（Degree），Degree高的節(jié)點(diǎn)很可能在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵作用，可用于評(píng)價(jià)麻黃、全蝎中成分和靶點(diǎn)的重要程度。

1.4 基因本體（GO）富集及KEGG通路富集

本研究采用David v 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)麻黃-全蝎治病靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能生物過程富集分析和KEGG通路富集分析。從通路角度闡釋麻黃-全蝎治療CVA的科學(xué)內(nèi)涵。

2 結(jié)果

2.1 麻黃-全蝎成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)設(shè)定的ADME參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)得到麻黃潛在活性成分23個(gè)、靶點(diǎn)245個(gè)；通過TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)，全蝎納入成分5個(gè)、靶點(diǎn)16個(gè)，去掉重復(fù)靶點(diǎn)后共131個(gè)，兩者共有靶點(diǎn)為9個(gè)。

2.2 麻黃-全蝎、CVA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

利用Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并下載CVA疾病有關(guān)的全部基因，共得到2 242個(gè)靶點(diǎn)基因。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)校正所有靶點(diǎn)名稱，將麻黃-全蝎活性化學(xué)成分潛在靶點(diǎn)與CVA作用靶點(diǎn)進(jìn)行整合，得到麻黃-全蝎治療CVA靶點(diǎn)67個(gè)。

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

通過Cytoscape3.7.1構(gòu)建麻黃-全蝎-活性化合物-治病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，由156個(gè)節(jié)點(diǎn)和284條邊組成，節(jié)點(diǎn)代表活性成分或作用靶點(diǎn)，粉色六邊形代表麻黃活性成分，綠色六邊形代表全蝎活性成分，藍(lán)色菱形代表靶點(diǎn)基因，見圖1；從化合物角度，排名前6的化合物依次為木犀草素（MOL000006-luteolin）、槲皮素（MOL000098-quercetin）、山奈酚（MOL000422-kaempferol）、β-谷 甾 醇（MOL000358-beta-sitosterol）、豆 甾 醇（MOL000449-stigmasterol）、膽甾醇等，可能是麻黃-全蝎治療CVA的關(guān)鍵化合物。從靶點(diǎn)角度，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）擁有最大度42，表明該靶點(diǎn)可能是麻黃-全蝎治療CVA的重要潛在靶點(diǎn)。

圖1 麻黃-全蝎-活性化合物-治病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

將67個(gè)麻黃-全蝎治病靶點(diǎn)輸入String中，保持minimum required interaction score為默認(rèn)值后hide disconnected nodes in the net-work，得到67個(gè)靶點(diǎn)蛋白并通過Cytoscape3.7.1構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，網(wǎng)絡(luò)中共有67個(gè)節(jié)點(diǎn)，329條邊，平均自由度為9.82，見圖2。超過平均自由度的蛋白質(zhì)有25個(gè)，取前十個(gè)為核心蛋白，如AKT1、表皮生長(zhǎng)因子（EGFR）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（Src）、雌激素受體（ESR1）等。利用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建核心蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。

圖2 麻黃-全蝎治療CVA PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 麻黃-全蝎核心蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 核心靶點(diǎn)的GO富集分析及KEGG通路富集分析結(jié)果

對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的67個(gè)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO富集分析，GO-BP富集共202個(gè)條目，圖4為顯著性前20的富集結(jié)果，圖4橫坐標(biāo)表示每個(gè)條目中涉及的核心靶點(diǎn)的數(shù)目，顏色從紅到藍(lán)表示P值由大到小。麻黃-全蝎治病靶點(diǎn)富集結(jié)果涉及炎癥反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、酪氨酸磷酸化途徑、蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞核的正調(diào)控、雌二醇反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞因子分泌、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、組織重塑等的調(diào)控，表明麻黃-全蝎治病靶點(diǎn)可能參與了CVA的病理和生理過程。對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的67個(gè)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行KEGG通路富集分析，通路富集共得到39條通路，圖5為顯著性前20的富集結(jié)果。氣泡圖中節(jié)點(diǎn)的顏色與大小由P值和相關(guān)聯(lián)基因的數(shù)量決定，顏色從綠色到紅色反應(yīng)P值從大到小，節(jié)點(diǎn)從小到大反應(yīng)相關(guān)聯(lián)基因的數(shù)量從少到多。麻黃-全蝎治病靶點(diǎn)主要參與PI3KAKT信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、Rap1信號(hào)傳導(dǎo)通路等。

圖4 GO富集分析的生物過程

圖5 麻黃-全蝎治療CVA預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的KEGG通路富集圖

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為本病主要以風(fēng)邪為外感病因，病機(jī)本質(zhì)為外感失治、邪郁于肺導(dǎo)致的肺失宣降、肺氣上逆、氣道攣急，隨著病情的遷延不愈發(fā)展為慢性咳嗽，久病導(dǎo)致病邪入絡(luò)，阻礙氣血運(yùn)行?！杜R證指南醫(yī)案》中明確提出“久病入絡(luò)”“久痛入絡(luò)”，可用蟲類藥物治療久病傷絡(luò)的疾?。蝗?，始見于《蜀本草》，其通過甾體衍生物、生物堿等特殊化學(xué)成分發(fā)揮作用。此外，全蝎中的氨基酸、脂質(zhì)、鎂、鈣微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分也對(duì)藥理活性有重要貢獻(xiàn)[12]。

在臨床上治療CVA患者常用麻黃、全蝎為君藥再配合其他藥物加減，麻黃發(fā)表散寒，宣肺平喘，全蝎息風(fēng)解痙，通絡(luò)止痛。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明[11，13]，麻黃-全蝎都具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等眾多作用，全蝎還有抗癲癇、抗驚厥、抗凝、抗菌、鎮(zhèn)痛消炎、促生長(zhǎng)、提高免疫力等多種作用。李海燕等[14]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)全蝎提取物可以降低小鼠支氣管肺泡灌洗液中嗜酸粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的比例，對(duì)支氣管哮喘引起的炎癥疾病有治療作用。

在本研究中，成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)顯示麻黃-全蝎治療CVA的關(guān)鍵成分有木犀草素、槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、膽甾醇等，既往研究[15-16]也證實(shí)木犀草素能通過抑制TGF-β1mRNA及NF-κB等的表達(dá)減輕支氣管炎癥的嚴(yán)重程度，而槲皮素能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2表達(dá)平衡，下調(diào)氣道上皮組織中TLR4/NF-κB的表達(dá)可減輕炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、影響突觸功能從而抑制大鼠氣管收縮治療哮喘[17]，全蝎中的成分由于數(shù)據(jù)庫(kù)納入的成分、靶點(diǎn)都極少，無法得出全蝎全部有效成分的靶點(diǎn)，其中膽甾醇是得到的確定有效成分，屬于一類甾體衍生物。2012年，膽甾醇首次在全蝎中被發(fā)現(xiàn)[18]，有研究證明[19]膽甾醇廣泛分布于人體血液中，是體內(nèi)激素產(chǎn)生的重要原料基礎(chǔ)，能維持人體正常的生命活動(dòng)；膽甾醇衍生物還具有抗菌、抗病毒、消炎等作用[20]，推測(cè)是全蝎在CVA治療中發(fā)揮抗炎藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，麻黃-全蝎關(guān)鍵成分有抗菌、抗病毒、抑制炎癥反應(yīng)、抑制支氣管痙攣等作用，在CVA治療中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

麻黃-全蝎治療CVA的關(guān)鍵靶點(diǎn)有25個(gè)，其中AKT1和MMP9均參與氣道炎癥反應(yīng)發(fā)生及氣道重塑的過程[21]，AKT1作為麻黃-全蝎治療CVA最重要的潛在靶點(diǎn)可以調(diào)節(jié)許多過程，包括代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和血管的生成，有研究[22]表明，AKT1能促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的分化增殖并且能有效地靶向下調(diào)CD38的表達(dá)，成為CVA等慢性炎癥性疾病的治療靶點(diǎn)，MMP9上也含有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)[23]；MPO[24]在氣道炎癥、氣道高反應(yīng)及氣道重塑過程中也發(fā)揮重要作用，由此推測(cè)，麻黃-全蝎可能通過這些靶點(diǎn)對(duì)氣道炎癥反應(yīng)、氣道重塑等過程產(chǎn)生影響從而發(fā)揮對(duì)CVA的治療作用。

通過KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，麻黃-全蝎治療CVA的關(guān)鍵通路有PI3K-AKT信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、Rap1信號(hào)傳導(dǎo)通路等。PI3K-AKT[25]信號(hào)通路能促進(jìn)新陳代謝，促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖，并且與血管生成有密切關(guān)系；VEGF信號(hào)通路對(duì)血管的形成和生長(zhǎng)起關(guān)鍵作用，在新血管形成過程中，VEGF對(duì)基因表達(dá)起到了誘導(dǎo)作用，還能調(diào)節(jié)血管通透性，是哮喘氣道炎癥和重塑的介質(zhì)[26]；FoxO信號(hào)通路[27]除在細(xì)胞存活、死亡、增殖和代謝中起關(guān)鍵作用外，還在免疫相關(guān)細(xì)胞（包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和其他非免疫細(xì)胞）的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在慢性炎癥性疾病中調(diào)節(jié)炎癥的淋巴樣譜系，并且能和PI3K-AKT信號(hào)通路共同發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用；cGMP-PKG[28]是細(xì)胞內(nèi)的第二個(gè)信使，它通過介導(dǎo)一氧化氮（NO）和利鈉（NPs）的作用調(diào)節(jié)各種各樣的生理過程，其與氣道平滑肌的收縮關(guān)系密切；有研究報(bào)道[29]Rap1信號(hào)傳導(dǎo)通路能調(diào)節(jié)MAP激酶活性，是與免疫、炎癥相關(guān)的途徑。

綜上所述，麻黃-全蝎很可能是通過調(diào)控PI3K-AKT信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、MMP9、MPO等細(xì)胞因子及氧化還原反應(yīng)、酪氨酸磷酸化途徑等多途徑、多靶點(diǎn)來干預(yù)細(xì)胞代謝的多個(gè)過程，發(fā)揮抑炎作用從而有效治療CVA，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)麻黃-全蝎治療CVA可能作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，此結(jié)論還需要通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。雖然全蝎作為蟲類藥用于久病入絡(luò)、息風(fēng)解痙有較長(zhǎng)的歷史和較好的療效，但對(duì)其藥理學(xué)機(jī)制研究卻沒麻黃那么充分，得到確定有效的成分、靶點(diǎn)也較少，故全蝎治療CVA的藥理機(jī)制還需進(jìn)一步探究。