任 靜，郝琴琴，成俊麗，李鵬飛

（山西農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷 030801）

將外源基因?qū)胝婧思毎麅?nèi)并使其表達的技術稱為細胞轉(zhuǎn)染技術，該技術是研究基因表達調(diào)控的重要手段。常用的轉(zhuǎn)染方法包括化學轉(zhuǎn)染法，如陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀法等；生物轉(zhuǎn)染法如病毒介導轉(zhuǎn)染；物理轉(zhuǎn)染法如電穿孔法、顯微注射法等。根據(jù)轉(zhuǎn)染載體不同又可分為病毒載體轉(zhuǎn)染和非病毒載體轉(zhuǎn)染[1]。因細胞類型和試驗結(jié)果要求的不同，選擇轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性小的轉(zhuǎn)染方法至關重要。PC12是源于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤的一種細胞株，可在神經(jīng)生長因子的誘導下發(fā)生形態(tài)及生理功能的變化[2]，在多種疾病研究中被廣泛使用[3]。PC12是一類較難轉(zhuǎn)染的細胞，研究中普遍采用病毒介導轉(zhuǎn)染[4-6]，該方法轉(zhuǎn)染效率較高且能夠使目的基因在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達[7]，但存在無法攜帶大片段、具有一定危險性和成本較高等缺點[8]。為解決這些問題，許多研究人員采用非病毒載體作為替代的轉(zhuǎn)染方法以達到瞬時轉(zhuǎn)染PC12細胞的目的，非病毒載體主要包括陽離子聚合物載體和陽離子脂質(zhì)體載體[9]。因此，在不影響PC12細胞活性及分化能力的基礎上，選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑及最佳轉(zhuǎn)染量，提高PC12細胞的轉(zhuǎn)染效率，是后續(xù)研究基因功能的重要前提。

本試驗選取了陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑RFect、D-Portal、TransIntroTMEL和陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000、Lipofectamine 2000共5種，通過比較各類轉(zhuǎn)染試劑在相同條件下對PC12轉(zhuǎn)染NC-FAM mimics的效果，選擇最佳轉(zhuǎn)染試劑，后續(xù)優(yōu)化轉(zhuǎn)染PC12的最佳NC-FAM mimics轉(zhuǎn)染量，以確定適合PC12細胞的轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染條件，旨在為PC12細胞的高效轉(zhuǎn)染奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤PC12細胞株購自上海中橋新舟生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

FAM標記的microRNA NC mimics由上海吉瑪公司合成；RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone公司；RFect購自常州百代生物科技股份有限公司；D-Portal購自天津美瑞特疫療科技有限公司；TransIntroTMEL購自北京全式金生物技術有限公司；Lipofectamine 3000、Lipofectamine2000均購自Thermo公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 PC12細胞培養(yǎng) 以RPMI-1640完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、1%雙抗）于37℃在5%CO2條件下培養(yǎng)PC12細胞，待細胞密度達到80%以上時進行細胞傳代，選取處于對數(shù)生長期的細胞進行轉(zhuǎn)染。

1.3.2 不同轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染PC12細胞 用完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為5.0×105個/mL，接種至6孔板，并于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照每種轉(zhuǎn)染試劑說明書的要求進行轉(zhuǎn)染操作（依照說明書中6孔板最大規(guī)格添加試劑及樣品），轉(zhuǎn)染試劑添加量分別為RFect 10μL、D-Portal 10μL、TransIntroTMEL 12.5μL、Lipofectamine 3000 10μL、Lipofectamine 2000 12.5μL；與之相對應的NC-FAM mimics添加量分別為4、4、3、5、5μg。

1.3.3 不同轉(zhuǎn)染量轉(zhuǎn)染PC12細胞 設置6個NCFAM mimics轉(zhuǎn)染濃度梯度，分別為50、60、70、80、90、100 nmol/L，每組設置3個重復。先用無血清培養(yǎng)基Opti-MEM分別預孵育轉(zhuǎn)染試劑和NCFAM mimics 5 min，再混合孵育20 min后轉(zhuǎn)染PC12細胞。根據(jù)轉(zhuǎn)染濃度分別加入6孔板后，添加RPMI-1640培養(yǎng)液至3 mL。細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后更換無血清培養(yǎng)基。

1.3.4 轉(zhuǎn)染效率測定及細胞計數(shù) 轉(zhuǎn)染后，陽性細胞能夠發(fā)出綠色熒光，在倒置熒光顯微鏡下觀察每組細胞熒光信號并采集圖像。每個試驗組中隨機選取3個有代表性的視野進行觀察計算，采用Image J軟件對圖像進行處理，統(tǒng)計熒光強度和細胞數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析使用GraphPad Prism 9.0軟件，采用單因素方差分析（One-Wat ANOVA）進行組間比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 PC12細胞正常狀態(tài)下形態(tài)特征

熒光顯微鏡下觀察正常狀態(tài)下PC12細胞形態(tài)可知（圖1），高分化狀態(tài)下的PC12細胞為圓形，出現(xiàn)聚集成團生長的現(xiàn)象，且細胞間突觸形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細胞貼壁狀態(tài)良好。

2.2 不同轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效果及細胞損傷情況

由圖2可知，5種轉(zhuǎn)染試劑中RFect熒光強度最低，轉(zhuǎn)染效果最差；D-Portal、Lipofectamine 3000和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染效果優(yōu)于RFect，但仍未達到最佳轉(zhuǎn)染效果；TransIntroTMEL轉(zhuǎn)染細胞熒光強度最高，轉(zhuǎn)染效果最好。此外，不同轉(zhuǎn)染試劑對細胞損傷結(jié)果如圖3所示，5種轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染PC12細胞后，各組細胞數(shù)量無統(tǒng)計學差異，說明本試驗選擇的5種轉(zhuǎn)染試劑對細胞損傷的影響無明顯差別。

2.3 不同NC-FAM mimics轉(zhuǎn)染量轉(zhuǎn)染效果及細胞損傷情況

為確定轉(zhuǎn)染PC12細胞的最佳mimics轉(zhuǎn)染量，選擇轉(zhuǎn)染效果最好的TransIntroTMEL轉(zhuǎn)染試劑對不同濃度的NC-FAM mimics進行轉(zhuǎn)染，分析每組熒光強度。從圖4-A可以看出，當轉(zhuǎn)染量在50~100 nmol/L濃度梯度時，隨著NC-FAM mimics轉(zhuǎn)染量的增加，熒光強度呈先增高隨后逐漸下降的趨勢，轉(zhuǎn)染效果隨之先升高隨后逐漸降低；進一步分析細胞熒光平均光密度，結(jié)果顯示（圖4-B），平均光密度在轉(zhuǎn)染濃度達到70 nmol/L前逐漸升高，之后逐漸降低。以上結(jié)果表明，當NC-FAM mimics濃度為70 nmol/L時，熒光信號最強，轉(zhuǎn)染效果最好。

進一步研究不同濃度NC-FAM mimics對細胞損傷的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同轉(zhuǎn)染濃度組的細胞數(shù)量間無統(tǒng)計學差異（圖5），說明本試驗選取的6個濃度梯度對細胞損傷的影響無明顯差別。

3 結(jié)論與討論

PC12由于細胞體積較小，生長緩慢，未分化狀態(tài)下不易貼壁，轉(zhuǎn)染較為困難[10-11]。前人采用物理轉(zhuǎn)染法的電穿孔技術對PC12進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率較低，約為10%~20%[12]；而生物轉(zhuǎn)染法如慢病毒載體轉(zhuǎn)染，雖能達到較高的轉(zhuǎn)染效率，但是靶向特異性差且操作困難[13]。本試驗采用化學轉(zhuǎn)染法，選用了陽離子脂質(zhì)體（Lipofectamine 3000和Lipofectamine 2000）和陽離子聚合物（RFect、D-Portal和TransIntroTMEL）2類轉(zhuǎn)染試劑，其主要差別在于攜帶質(zhì)粒進入細胞的載體不同。已有研究證實，陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑在PC12細胞中的轉(zhuǎn)染效果均高于物理轉(zhuǎn)染方法和病毒載體轉(zhuǎn)染[14]。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑TransIntroTMEL的轉(zhuǎn)染效果最好，可能是由于脂質(zhì)體會抑制磷酸激酶C、ATP酶等活性[15-16]，作為siRNA載體進行轉(zhuǎn)染時會導致脫靶效應[17]，此外脂質(zhì)體進入細胞后易產(chǎn)生細胞毒性[18]，而陽離子聚合物是一類線性高分子聚合物，攜帶大量活性較高的功能基團，能夠與細胞膜親和形成氫鍵，以傳遞外源基因[19]，產(chǎn)生的細胞毒性較脂質(zhì)體更小。目前，許多研究者選擇缺乏免疫原性、包裝核酸方面具有靈活性且更易降解的陽離子聚合物作為載體進行試驗。LIU等[20]采用聚乙二醇-聚乙烯亞胺（PEG-PEI）作為載體轉(zhuǎn)染siRNA降低PC12細胞中SNCA的表達，證明PEG-PEI載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率及較低的細胞毒性。由于化學轉(zhuǎn)染試劑原料及研發(fā)手段的不同，轉(zhuǎn)染同種細胞時選擇不同的轉(zhuǎn)染試劑會產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)染效果，因此，對于培養(yǎng)條件嚴格、轉(zhuǎn)染困難的PC12細胞，必須通過進一步的優(yōu)化來提高轉(zhuǎn)染效率。

轉(zhuǎn)染效果受到細胞狀態(tài)、傳代次數(shù)、轉(zhuǎn)染濃度和質(zhì)粒大小等的影響，其中轉(zhuǎn)染濃度的影響尤為重要。俞曉煒等[21]用TransIntroTMEL對食管鱗癌細胞進行轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)當質(zhì)粒質(zhì)量濃度為4 ng/μL時轉(zhuǎn)染效率最高。陳鳳婷[22]用TransIntroTMEL對MDAMB-231細胞轉(zhuǎn)染CY 3標記的NC mimics，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，發(fā)現(xiàn)當NC mimics濃度為40、50、100 nmol/L時，轉(zhuǎn)染效率均可達到80%以上。而本試驗中，用TransIntroTMEL轉(zhuǎn)染PC12細胞，最佳的轉(zhuǎn)染濃度為70 nmol/L，與前人研究結(jié)果不同，這說明同一轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染不同類型細胞時，最佳轉(zhuǎn)染濃度存在差異。本試驗中設置的不同轉(zhuǎn)染條件之間PC12細胞損傷無明顯差異，不同試劑及不同轉(zhuǎn)染濃度對細胞造成的損傷均在試驗允許范圍內(nèi)。

本試驗選用5種試劑對PC12細胞進行化學轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示，非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑TransIntroTMEL的轉(zhuǎn)染效果最好；進一步對NC-FAM mimics轉(zhuǎn)染濃度進行優(yōu)化，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染濃度為70 nmol/L條件下TransIntroTMEL對PC12細胞轉(zhuǎn)染后熒光信號最強，且各濃度處理間的細胞損傷無顯著差異，能夠在保證細胞存活率的前提下獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。