李 瀟，李偉麗，朱 濤，張國(guó)俊，吳 韜*

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川成都 610039；2.四川德健南江黃羊食品有限責(zé)任公司,四川巴中 636600；3.巴中市南江黃羊科學(xué)研究所,四川巴中 636600）

南江黃羊是四川省巴中市南江縣經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期選育而成的肉用型山羊品種，其研究成果曾獲得國(guó)家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)，現(xiàn)在已被認(rèn)定為國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品。它以生長(zhǎng)發(fā)育快、產(chǎn)肉性能好、繁殖能力強(qiáng)、板皮品質(zhì)優(yōu)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)而聞名全國(guó)，是全國(guó)首個(gè)進(jìn)入中南海國(guó)宴的專用羊肉品種，有“中國(guó)第一羊”的美譽(yù)。

飼養(yǎng)周期對(duì)羊肉食用品質(zhì)如色澤、嫩度和特征風(fēng)味等影響顯著。研究表明，不同年齡的畜禽其原料肉的肌纖維拉伸特性、膠原蛋白含量等差異較大[1]，進(jìn)而影響肉品的食用品質(zhì)。在原料肉中，5′-肌苷酸（ionosine-5′-mono-phosphate，IMP）和5′-鳥(niǎo)苷酸（guanosine-5′-mono-phosphate，GMP）是動(dòng)物組織中重要的鮮味物質(zhì)，二者能夠與谷氨酸鈉結(jié)合產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，增強(qiáng)鮮味，使肉質(zhì)鮮度提高數(shù)倍至數(shù)十倍[2?3]。本團(tuán)隊(duì)前期采用超高效液相色譜?四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-QTOF-MS）建立了牦牛肉中IMP、GMP 定性定量檢測(cè)方法[4]。與普通HPLC 檢測(cè)方法比較，超高效液相色譜分離度更好，峰容量更高，分析速度更快；而飛行時(shí)間質(zhì)譜能夠通過(guò)高分辨率質(zhì)荷比、二級(jí)碎片裂解模式等進(jìn)行定性分析，通過(guò)多反應(yīng)模式檢測(cè)目標(biāo)離子對(duì)進(jìn)行定量分析，具有高分辨率、高靈敏度等特點(diǎn)[5?7]。因此，UPLC-Q-TOF 技術(shù)非常適合對(duì)復(fù)雜原料肉體系中IMP、GMP 定性、定量檢測(cè)，提高檢測(cè)精準(zhǔn)度。

目前南江黃羊的研究主要集中在屠宰前生長(zhǎng)發(fā)育、種質(zhì)資源等方面，而對(duì)其肉質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)等加工相關(guān)屬性的研究極少。為明確月齡對(duì)南江黃羊肉質(zhì)構(gòu)特性與核苷酸含量的影響，本研究選取放牧喂養(yǎng)的3 月齡、6 月齡、9 月齡南江黃羊?yàn)檠芯繉?duì)象，揭示月齡對(duì)黃羊肉色度、質(zhì)構(gòu)、嫩度及核苷酸含量的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

黃羊肉試材為南江縣南江黃羊研究所放牧飼養(yǎng)的3、6、9 月齡南江黃羊，經(jīng)屠宰放血后，選取羊后腿股部肌肉，宰后24h 內(nèi)4℃冷鏈運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，36h 后進(jìn)行取樣與試驗(yàn)，測(cè)定質(zhì)構(gòu)特性和IMP、GMP 含量。

1.2 試劑

三氯乙酸（分析純），成都市科隆化學(xué)品有限公司；IMP 標(biāo)準(zhǔn)品（純度97%），GMP 標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%），上海百化商城；乙腈（色譜純），美國(guó)Aldrich-Sigma 公司；乙酸銨（分析純），甲酸（色譜純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

Wf-30 精密色差儀，廣州誠(chéng)敏電子科技有限公司；TA.XTPlus 質(zhì)構(gòu)分析儀，英國(guó)Stable Micro Systems 公司；FDU-1100 真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TD-5M 高速離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；超高效液相色譜儀LC-30A，日本島津儀器有限公司；X500R 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國(guó)AB SCIEX 公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 顏色

羊肉樣品在空氣中放置10min，將色差儀用黑腔白板進(jìn)行校正后，在肉樣上固定選取3 個(gè)位點(diǎn)測(cè)定肉樣L*、a*、b*值，每個(gè)位點(diǎn)測(cè)6 次，取測(cè)量結(jié)果的平均值作為肉樣的測(cè)定值[8]。

肉色判定指標(biāo)如下[9]：

其中：L*表示亮度，L*=100 為白，L*=0 為黑，L*值越大，色澤越亮白；a*>0 表示紅色程度，a*<0 表示綠色程度；b*>0 表示黃色程度，b*<0 表示藍(lán)色程度。

1.4.2 質(zhì)構(gòu)

1)樣品前處理。將羊肉樣品去除脂肪和結(jié)締組織后，切成3.0cm×3.0cm×3.0cm 的方形肉塊。

2)質(zhì)構(gòu)儀測(cè)試條件。將質(zhì)構(gòu)儀調(diào)整為單次下壓模式，選用P/0.5 探頭，測(cè)前速度1mm/s，測(cè)試速度1mm/s，測(cè)后速度1mm/s，觸發(fā)力15g，測(cè)定時(shí)間間隔10s，壓縮比30%，觸發(fā)力10g，測(cè)定樣品硬度（g）、彈性（g·s）、黏性和咀嚼性（g·s），每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取平均值作為測(cè)定結(jié)果[10]。

1.4.3 嫩度

1)樣品前處理。將羊肉樣品去除脂肪和結(jié)締組織后，切成3.0cm×3.0cm×3.0cm 的方形肉塊。

2)質(zhì)構(gòu)儀測(cè)試條件。選擇A/MORS 探頭，測(cè)前速度1mm/s，測(cè)試速度2mm/s，測(cè)后速度10 mm/s，位移15mm，觸發(fā)力20g，測(cè)定剪切力值（g），每個(gè)樣品測(cè)定3 次，取平均值作為測(cè)定結(jié)果[11]。

1.4.4 核苷酸含量

1)樣品前處理。將羊肉去除筋膜，切薄片，稱取20g，真空冷凍干燥后粉碎成粉末，取羊肉凍干粉1g 于50mL 離心管中，加10mL 體積分?jǐn)?shù)為5%的三氯乙酸溶液，渦旋混勻后超聲處理5min，4000r/min 離心15min，將上清液過(guò)0.22μm 濾膜，上機(jī)待測(cè)[12]。

2)核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品配備。分別準(zhǔn)確稱取1mg 肌苷酸，鳥(niǎo)苷酸標(biāo)準(zhǔn)品（精確到0.01mg），加1mL 水溶解配制成濃度為1mg/mL 的肌苷酸，鳥(niǎo)苷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液，分別取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5、50、125、500 μL 于10mL 容量瓶中，用去離子水定容后得到濃度分別為0.5、5、12.5、50μg/mL 的肌苷酸，鳥(niǎo)苷酸標(biāo)準(zhǔn)液。

3)色譜分析條件。色譜柱：采用島津shimpack C18 柱（2.1mm×100mm，1.8μm 粒徑）；色譜柱溫度：40℃；流動(dòng)相A 為純乙腈，流動(dòng)相B 為0.25mmol/L 乙酸銨水溶液（0.1%甲酸，V/V）；流速0.25mL/min；進(jìn)樣量2μL，采用梯度洗脫，流速不變，梯度條件見(jiàn)表1。

表1 洗脫條件

4)質(zhì)譜分析條件。質(zhì)譜分析條件：離子源：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），負(fù)離子模式；掃描方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）；氣簾氣（curtain gas，CUR）35psi，溫度（temperature，TEM）：400℃，噴霧氣（spray gas，GS1）：310.275 kPa，輔助加熱氣（auxiliary heating gas，GS2:）：55℃，去簇電壓（declustered voltage，DP）-60V,碰撞能量（collegeision energy，CE）-10V，掃描范圍m/z50～800。

2 結(jié)果與分析

2.1 色度差異

色度是評(píng)價(jià)羊肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。本研究通過(guò)色差儀測(cè)定南江黃羊肉顏色，由結(jié)果計(jì)算有色度值和肉色飽和度，有色度值越低，肉色越鮮紅；肉色飽和度值越高，肉色越深[13]。羊肉顏色測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。不同月齡羊肉有色度值和肉色飽和度差異較大，但不同月齡羊肉色度差異不顯著，由圖1（a）可知，3 月齡羊肉有色度值最高，達(dá)到了0.72，6 月齡羊肉和9 月齡羊肉有色度值差異極小，由圖1（b）可知，隨著月齡增加，肉色飽和度值逐漸增大，3 月齡羊肉肉色飽和度最小，為19.73，說(shuō)明肉色偏黃，9 月齡羊肉肉色飽和度最大，達(dá)21.35，肉色最鮮紅，3 月齡羊肉肉色最淺，9 月齡羊肉肉色最深。結(jié)果表明，從3 月齡羊肉到9 月齡羊肉，隨著月齡增加，肉色變得更鮮紅飽滿。這可能是由于隨著飼喂時(shí)間增加，黃羊的生長(zhǎng)發(fā)育從初生期達(dá)到了高峰期，肌肉中肌紅蛋白迅速積累，含量提高有關(guān)。研究表明肌肉色素主要由肌紅蛋白和血紅蛋白構(gòu)成，其中肌紅蛋白對(duì)肉色起主要作用，肌紅蛋白含量越高，肉色越深越紅[14]。

圖1 不同月齡南江黃羊肉顏色對(duì)比

2.2 質(zhì)構(gòu)差異

質(zhì)構(gòu)特性是肉制品重要的食用品質(zhì)指標(biāo)，與咀嚼過(guò)程中的力學(xué)特性變化息息相關(guān)，質(zhì)構(gòu)特性指標(biāo)包括硬度、彈性、黏性和咀嚼性。肉的硬度是使肉達(dá)到設(shè)定形變所需要的最大力；彈性是表示樣品達(dá)到設(shè)定形變后恢復(fù)到形變前條件的能力；黏性是探頭與肉樣品接觸后克服兩者表面間吸引力所必需的力；咀嚼性是表示將肉咀嚼成吞咽狀態(tài)所需要的能量[15]。

3 批次樣品測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖2，隨著喂養(yǎng)時(shí)間增加，羊肉的硬度、彈性、咀嚼性都呈增加的趨勢(shì)，而黏性變化趨勢(shì)略有不同。圖2（a）表明，3 月齡羊肉硬度最小，達(dá)63.27g，顯著小于6 月齡、9 月齡羊肉，而6 月齡羊肉和九月齡羊肉間差異不顯著。從圖2（b）可知，3 月齡羊肉彈性強(qiáng)度為8.2，顯著小于6 月齡羊肉和9 月齡羊肉，9 月齡羊肉彈性強(qiáng)度達(dá)25.08，是3 月齡羊肉的3 倍，6 月齡羊肉和9 月齡羊肉間差異不顯著。圖2（c）、圖2（d）表明，在咀嚼性上，3 月齡、6 月齡、9 月齡羊肉間均有顯著差異，9 月齡羊肉咀嚼性最大，可達(dá)1113.35（g·s），是3 月齡羊肉的3.5 倍，6 月齡羊肉的1.3 倍。在黏性上，6 月齡羊肉最大，達(dá)到了19.66（g·s），而3 月齡羊肉最小，為7.76（g·s），3 月齡羊肉、6 月齡羊肉、9 月齡羊肉間均有顯著差異。有學(xué)者對(duì)大青山山羊肉質(zhì)構(gòu)特性研究結(jié)果顯示，一年半、兩年半、三年半年齡的大青山山羊肉硬度、彈性、黏性、咀嚼性均隨年齡增長(zhǎng)而增大，肉質(zhì)逐漸變老，但差異不顯著[16]，而本研究結(jié)果顯示不同月齡羊肉在硬度、彈性、黏性、咀嚼性上差異顯著，這可能是由于品種基因差異，黃羊在3 月齡、6 月齡、9 月齡黃羊正處于生長(zhǎng)發(fā)育高峰期，生長(zhǎng)發(fā)育達(dá)到最大速度，且經(jīng)歷了生長(zhǎng)發(fā)育拐點(diǎn)，導(dǎo)致肉質(zhì)差異顯著，而18 月后，羊的生長(zhǎng)速率趨于穩(wěn)定，導(dǎo)致肉質(zhì)差異不顯著[17]。

圖2 不同月齡南江黃羊肉質(zhì)構(gòu)對(duì)比

2.3 嫩度

從圖3 可知，不同月齡羊肉嫩度差異顯著，九月齡羊肉剪切力值最大，為1857g，而3 月齡羊肉剪切力值最小，為634.23g，9 月齡羊肉剪切力值是3 月齡羊肉的2.9 倍，肌肉剪切力值隨月齡增加而增大。肉的嫩度是指肉柔軟的程度，肉嫩，是指肉被咀嚼時(shí)柔軟、易咀嚼。肉的嫩度可以通過(guò)剪切力值反映，通常與剪切力值呈負(fù)相關(guān)[18]。有研究指出，對(duì)不同年齡羊肉剪切力值測(cè)定結(jié)果顯示，年齡對(duì)羊肉剪切力值有顯著影響，隨著年齡增加，羊肉剪切力值顯著增大[19]，張宏博等[20]的研究也表明，不同月齡巴美羊嫩度存在差異，羊肉嫩度隨月齡增加而減小，與本實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果一致。

圖3 不同月齡南江黃羊肉嫩度對(duì)比

2.4 肌苷酸、鳥(niǎo)苷酸含量

2.4.1 結(jié)果計(jì)算與標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品中肌苷酸、鳥(niǎo)苷酸含量計(jì)算公式如下：

式中：X，樣品中肌苷酸/鳥(niǎo)苷酸含量，mg/kg；c，由工作曲線上查出的樣品提取液中肌苷酸/鳥(niǎo)苷酸質(zhì)量濃度，μg/mL；v，樣品提取液體積，mL；m，樣品質(zhì)量，g。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

取濃度梯度為0.5、5、12.5、50μg/mL 的肌苷酸、鳥(niǎo)苷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1.2mL 于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣量2 μL，在上述色譜、質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以肌苷酸、鳥(niǎo)苷酸濃度為橫坐標(biāo)（x），吸收強(qiáng)度為縱坐標(biāo)（y），作回歸方程如表2 所示，在0.5～50μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，肌苷酸、鳥(niǎo)苷酸的線性關(guān)系、相關(guān)性良好。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

2.4.3 IMP、GMP 定量分析離子對(duì)選擇

為了選擇IMP、GMP 合適的定量離子對(duì)，首先對(duì)它們的二級(jí)質(zhì)譜圖與裂解方式進(jìn)行研究。如圖4（a）所示，IMP 母離子為347.04，IMP 母離子裂解后，形成m/z211 的核糖磷酸酯和m/z135 的次黃嘌呤，核糖磷酸酯再次裂解形成m/z97 的磷酸，磷酸脫去一個(gè)水分子形成m/z79 的基團(tuán)；因此，對(duì)IMP 的定性定量分析，選擇m/z211.00 作為定性離子，選擇信號(hào)最強(qiáng)的（347.04→78.95）作為定量離子對(duì)。同樣的，對(duì)GMP，選擇m/z211.00 作為定性離子，選擇信號(hào)最強(qiáng)的（362.05→78.95）作為定量離子對(duì)。

圖4 IMP、GMP 的二級(jí)飛行時(shí)間質(zhì)譜圖與裂解規(guī)律

2.4.4 IMP、GMP 含量差異

對(duì)黃羊肉樣品IMP、GMP 含量進(jìn)行測(cè)定，3 批次樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5 可以看出，羊肉中肌苷酸含量顯著高于鳥(niǎo)苷酸，含量差異最大達(dá)34 倍。其中，圖5（a）表明肌苷酸含量9 月齡羊肉最高，為315.16mg/kg，3 月齡羊肉含量最低，為112.32mg/kg。圖5（b）顯示鳥(niǎo)苷酸含量9 月齡羊肉最高，為9.06mg/kg，3 月齡羊肉最低，為2.98 mg/kg。在肌苷酸、鳥(niǎo)苷酸含量方面，3 月齡羊肉、6 月齡羊肉、9 月齡羊肉均有顯著差異，但3 月齡羊肉與6 月齡羊肉鳥(niǎo)苷酸含量差異較小。其中，9 月齡羊肉肌苷酸含量是3 月齡羊肉的2.8 倍，9 月齡羊肉中鳥(niǎo)苷酸含量是3 月齡羊肉的3 倍，這可能是由于IMP，GMP 是隨黃羊生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程逐漸積累和沉降導(dǎo)致的。有研究認(rèn)為雞肉中IMP 含量與雞的生長(zhǎng)速率有關(guān)，慢生型雞肉因此具有較濃的風(fēng)味[21]。也有學(xué)者對(duì)不同日齡雞肉中肌苷酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，42 日齡雞肉中肌苷酸含量顯著高于21 日齡，表明日齡對(duì)雞肉中肌苷酸含量的影響存在顯著的互作效應(yīng)[22]。本研究結(jié)果表明，南江黃羊肉中肌苷酸、鳥(niǎo)苷酸含量隨月齡增加而增大。

圖5 南江黃羊肉中IMP、GMP 含量

3 結(jié)論

本文研究了飼喂月齡對(duì)南江黃羊肉顏色、質(zhì)構(gòu)、嫩度和核苷酸含量的影響。不同月齡羊肉顏色存在差異，但月齡對(duì)其影響不顯著。月齡對(duì)南江黃羊肉質(zhì)構(gòu)和嫩度有顯著影響，羊肉的硬度、彈性、咀嚼性、嫩度均隨月齡增加而增大，其中，3 月齡羊肉和6 月齡羊肉間差異更大，6 月齡羊肉與9 月齡羊肉差異較小。羊肉中IMP、GMP 含量差異較大，不同月齡對(duì)羊肉核苷酸含量有顯著影響，IMP、GMP 含量隨月齡增加而增大?？偟膩?lái)說(shuō)，隨著月齡的增加，羊肉肉質(zhì)逐漸變老，但伴隨著呈味核苷酸的積累，肉味更鮮美。通過(guò)對(duì)比不同月齡黃羊肉質(zhì)構(gòu)特性和核苷酸含量變化，結(jié)合羊肉分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，有助于建立南江黃羊肉質(zhì)鑒定分級(jí)體系，實(shí)現(xiàn)根據(jù)產(chǎn)品需要，精準(zhǔn)選擇加工原料肉，達(dá)到降低生產(chǎn)成本、提升產(chǎn)品品質(zhì)的目的。