邱樹磊,陳曉蘭,楊海峰,陳玉庫(kù),胡元亮,高永旭,武彩紅
(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,泰州 225300;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),南京 210095)
天然植物中的多糖具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性并促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌生物活性因子的功能[1-2]。硒作為動(dòng)物代謝的必需微量元素,在抗氧化、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤等方面發(fā)揮著重要的作用[3]。研究發(fā)現(xiàn),對(duì)多糖進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆肿有揎椏梢蕴岣咧兴幎嗵堑拿庖咴鰪?qiáng)活性和抗病毒、抗氧化活性等[4]。尤其是近年來(lái)通過(guò)化學(xué)修飾方法得到的硒化多糖備受關(guān)注,因其與亞硒酸鈉等無(wú)機(jī)硒相比,不僅兼具硒和多糖的雙重功效,還克服了硒難以吸收、毒性蓄積等弊端,且生物活性高于硒和多糖[5]。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí),經(jīng)硝酸-亞硒酸鈉進(jìn)行硒化修飾得到的硒化大蒜多糖sGPS3、sGPS5和sGPS6的免疫增強(qiáng)活性較好,能提高雞外周血淋巴細(xì)胞的增殖能力及雞新城疫疫苗的免疫效果[6-7]。目前,對(duì)硒化大蒜多糖免疫調(diào)節(jié)作用的研究多集中在其對(duì)抗體水平和外周血淋巴細(xì)胞等免疫指標(biāo)的影響方面,而對(duì)硒化大蒜多糖的具體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究較少。
巨噬細(xì)胞具有識(shí)別異物、吞噬病原體、捕獲抗原、分泌多種活性因子等功能,是動(dòng)物體非常重要的一種免疫活性細(xì)胞,在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用,在細(xì)胞免疫學(xué)和分子免疫學(xué)等免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究中備受關(guān)注,其中小鼠腹腔巨噬細(xì)胞具有容易獲得、便于培養(yǎng)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而成為常用的細(xì)胞模型[8-10]。為進(jìn)一步揭示硒化大蒜多糖的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制,本研究以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象,以可以激活巨噬細(xì)胞的脂多糖(LPS)為對(duì)照,通過(guò)中性紅法、CCK-8法分別檢測(cè)sGPS3、sGPS5和sGPS63種硒化大蒜多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能及増殖能力的影響,檢測(cè)了活性最好的硒化大蒜多糖對(duì)巨噬細(xì)胞上清液中一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ-干擾素(IFN-γ)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-12(IL-12)含量的影響,通過(guò)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、小鼠碳粒廓清實(shí)驗(yàn)測(cè)定其吞噬指數(shù)與吞噬百分率,以明確硒化大蒜多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響,為硒化大蒜多糖的作用挖掘和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
1.1.1 硒化大蒜多糖制備 大蒜購(gòu)自泰州某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),產(chǎn)地山東。將大蒜通過(guò)水提醇沉、去蛋白、過(guò)DEAE-52纖維素柱后得到大蒜多糖(GPS,糖含量為94.5%),再根據(jù)Qiu等[6]的方法用硝酸-亞硒酸鈉對(duì)大蒜多糖進(jìn)行硒化修飾,其中,sGPS3反應(yīng)條件:每500 mg GPS,加亞硒酸鈉400 g,于50 ℃條件下反應(yīng)10 h;sGPS5反應(yīng)條件:每500 mg GPS,加亞硒酸鈉300 g,于70 ℃條件下反應(yīng)10 h;sGPS6反應(yīng)條件:每500 mg GPS,加亞硒酸鈉400 g,于70 ℃條件下反應(yīng)6 h。
1.1.2 主要試劑及儀器 PBS、RPMI 1640培養(yǎng)液、0.09%中性紅溶液、6%淀粉肉湯、10 μg/mL LPS均參考趙曉娟[11]的方法進(jìn)行配制;RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;中性紅、LPS均購(gòu)自Sigma公司;胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青生物有限公司;亞硒酸鈉購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;CCK-8購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-12 ELISA試劑盒購(gòu)自R&D公司。電子天平(FA1104N)購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司;倒置顯微鏡(TS-100)購(gòu)自Nikon公司;CO2培養(yǎng)箱(SC010W-2)購(gòu)自Revco公司;酶標(biāo)儀(DG-3022)購(gòu)自國(guó)營(yíng)華東電子管廠。
1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 200只清潔級(jí)ICR小鼠,4~6周齡,體重(20±2) g,雌雄各半,購(gòu)自江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
1.2.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備 參考潘維華等[12]的方法于試驗(yàn)前3 d在小鼠腹腔中央與右后肢連線的中點(diǎn)處注射6%淀粉肉湯1 mL。3 d后,頸椎脫臼法處死小鼠,用75%酒精浸泡5 min。在超凈臺(tái)內(nèi),于小鼠下腹部剪開(kāi)一小口,撕開(kāi)皮膚,完全暴露腹膜,向腹腔注射PBS 5 mL,輕揉腹部5 min后,打開(kāi)腹腔,將內(nèi)臟推向一側(cè),用吸管回收腹腔液于離心管中,用同體積的PBS沖洗腹腔2次,合并腹腔液,1 000 r/min離心8 min,棄上清,細(xì)胞用PBS洗滌2次,加入含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×106/mL,加入96孔板,每孔100 μL。5% CO2培養(yǎng)箱38 ℃貼壁培養(yǎng)3 h。
1.2.2 硒化大蒜多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 參考Adel[13]的方法,以硒化大蒜多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的最大安全濃度為起始濃度,用無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)液倍比稀釋為100、50、25、12.5、6.25 μg/mL 5個(gè)濃度,在預(yù)先加入100 μL 2.5×106/mL小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的96孔板中,每孔加入100 μL各濃度的sGPS3、sGPS5、sGPS6,另設(shè)10 μg/mL LPS組(LPS,加LPS 100 μL)和細(xì)胞對(duì)照組(CC,加培養(yǎng)液100 μL),每組4個(gè)重復(fù)孔,5% CO2培養(yǎng)箱38 ℃培養(yǎng)48 h,棄上清,每孔加入終濃度為0.09%的中性紅溶液100 μL,反應(yīng)4 h后,在顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞的形態(tài)變化,然后用PBS洗細(xì)胞3次,加入100 μL二甲基亞砜,靜置過(guò)夜,用酶標(biāo)儀檢測(cè)A490 nm值。
1.2.4 硒化大蒜多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌NO及細(xì)胞因子的影響 通過(guò)1.2.2和1.2.3篩選出活性最好的硒化大蒜多糖。用100、50、25、12.5、6.25 μg/mL活性最好的硒化大蒜多糖按照1.2.2細(xì)胞分組方法處理細(xì)胞,5% CO2培養(yǎng)箱38 ℃培養(yǎng)48 h后,小心吸取細(xì)胞上清,分別收集于EP管中,置于-70 ℃保存待測(cè)。 按照ELISA試劑盒說(shuō)明書分別檢測(cè)上清中NO、TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6和IL-12含量。
1.2.5 硒化大蒜多糖對(duì)體內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 將160只小鼠隨機(jī)均分成4組,參考劉奇等[15]、烏英等[16]的方法,分別灌胃高(2 mg/mL)、中(1 mg/mL)、低劑量活性最好的硒化大蒜多糖(0.5 mg/mL)和生理鹽水(空白對(duì)照組)0.5 mL,1次/d,連續(xù)5 d。在試驗(yàn)第6天,每組隨機(jī)抽取10只經(jīng)尾靜脈注入用生理鹽水稀釋3倍的印度墨汁,按每克體重0.01 mL計(jì)算,于注入后2和10 min分別從內(nèi)眥靜脈叢采血20 μL,并將其加到2 mL 0.1% NaCO3溶液中,用分光光度計(jì)測(cè)定其在D600 nm值。采血后,處死小鼠,取出肝臟和脾臟,稱重,計(jì)算吞噬指數(shù)A。
式中,t1為第1次采血時(shí)間;t2為第2次采血時(shí)間;D1為第1次血液的D600 nm值,D2為第2次血液的D600 nm值
同時(shí),在試驗(yàn)第6天,每組隨機(jī)抽取10只小鼠,腹腔注射20%(V/V)雞紅細(xì)胞懸液1 mL,30 min后處死,然后注入2 mL生理鹽水,取腹腔液滴片,37 ℃溫箱孵育30 min,用1∶1(V/V)甲醇和丙酮進(jìn)行固定,Giemsa染色,體視顯微鏡下鏡檢,計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞,計(jì)算吞噬率及吞噬指數(shù)B。
吞噬指數(shù)B=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/100
吞噬率(%)=(吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/100)×100%
用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA),Duncan氏法進(jìn)行多重比較,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著。
由表1可知,3種硒化大蒜多糖中,除6.25 μg/mL sGPS3組外,100、50、25、12.5、6.25 μg/mL sGPS3、sGPS5和sGPS6組的A490 nm值均顯著大于對(duì)照組(P<0.05),其中6.25~50 μg/mL sGPS6組A490 nm值均顯著高于sGPS3和sGPS5組(P<0.05),50~100 μg/mL sGPS6組A490 nm值顯著高于LPS組(P<0.05)。
表1 各組巨噬細(xì)胞A490 nm值
由表2可知,100、50、25、12.5、6.25 μg/mL sGPS3、sGPS5和sGPS6組A450 nm值均顯著大于對(duì)照組(P<0.05),其中sGPS6組所有濃度A450 nm值均顯著高于sGPS3和sGPS5組(P<0.05);6.25~25 μg/mL sGPS3組、sGPS5組的A450 nm值顯著低于LPS組(P<0.05);100 μg/mL sGPS5組、50~100 μg/mL sGPS6組的A450 nm值顯著高于LPS組(P<0.05)。
各濃度范圍sGPS3、sGPS5、sGPS6組的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖率見(jiàn)圖1。由圖1可知,在6.25~12.5 μg/mL時(shí),sGPS3、sGPS5、sGPS6組的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖率均顯著低于LPS組(P<0.05),sGPS3、sGPS5、sGPS63組之間差異均顯著(P<0.05),sGPS6組最高,其次為sGPS5和sGPS3組;在25 μg/mL時(shí),sGPS3、sGPS5組的巨噬細(xì)胞增殖率均顯著低于LPS組(P<0.05),sGPS6組與LPS組差異不顯著(P>0.05);在50 μg/mL時(shí),sGPS6組的巨噬細(xì)胞增殖率均顯著高于其余各組(P<0.05),sGPS3、sGPS5、LPS組之間差異不顯著(P>0.05);在100 μg/mL時(shí),sGPS5、sGPS6組的巨噬細(xì)胞增殖率均顯著高于LPS組(P<0.05),sGPS3與LPS組差異不顯著(P>0.05)。
通過(guò)以上硒化大蒜多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能和增殖能力的結(jié)果,確定選擇活性最好的sGPS6用于后續(xù)試驗(yàn)。
表2 各組巨噬細(xì)胞A450 nm值
肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05);肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below圖1 各組巨噬細(xì)胞增殖率Fig.1 The proliferation rate of macrophages in each group
不同濃度sGPS6對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清中NO及細(xì)胞因子含量的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知,LPS組、12.5~100 μg/mL sGPS6組NO、TNF-α、IL-1β、IL-6含量及25~100 μg/mL sGPS6組IFN-γ、IL-12含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。
100 μg/mL sGPS6組NO、TNF-α和IL-12含量均顯著高于LPS組(P<0.05)(圖2A、2B、2F);所有濃度sGPS6組IFN-γ含量均顯著低于LPS組(P<0.05)(圖2C);6.25~25 μg/mL sGPS6組IL-1β含量顯著低于LPS組(P<0.05),100 μg/mL sGPS6組高于LPS組,但差異不顯著(P>0.05)(圖2D);6.25~50 μg/mL sGPS6組IL-6含量顯著低于LPS組(P<0.05),100 μg/mL sGPS6組與LPS組差異不顯著(P>0.05)(圖2E);6.25 μg/mL sGPS6組IL-12含量顯著低于LPS組(P<0.05),12.5~50 μg/mL sGPS6組與LPS組差異不顯著(P>0.05),100 μg/mL sGPS6組顯著高于LPS組(P<0.05)(圖2F)。
sGPS6對(duì)小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)吞噬指數(shù)A及對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)吞噬指數(shù)B和吞噬率的影響見(jiàn)表3。由表3可知,高(2 mg/mL)、中(1 mg/mL)、低(0.5 mg/mL)劑量sGPS6組的吞噬指數(shù)A均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),高劑量sGPS6組顯著高于低劑量組(P<0.05);高、中劑量sGPS6組的吞噬指數(shù)B顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),低劑量sGPS6組與空白對(duì)照組差異不顯著(P>0.05),高劑量sGPS6組的吞噬指數(shù)B高于中、低劑量組,但差異不顯著(P>0.05)。 高、中、低劑量sGPS6組的吞噬率均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),高劑量sGPS6組顯著高于中、低劑量組(P<0.05)。
1~7,分別代表6.25、12.5、25、50、100 μg/mL sGPS6組及LPS、CC組1-7, Represent 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL sGPS6, LPS and CC groups圖2 各組巨噬細(xì)胞上清中NO及細(xì)胞因子含量Fig.2 The contents of NO and cytokines in macrophage supernatant in each group
表3 sGPS6對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)及吞噬率的影響
巨噬細(xì)胞具有吞噬功能,因此,常把巨噬細(xì)胞的吞噬能力測(cè)定作為評(píng)價(jià)巨噬細(xì)胞功能及機(jī)體非特異性免疫狀態(tài)的指標(biāo)之一[17]。 本試驗(yàn)結(jié)果顯示,3種硒化大蒜多糖中,所有濃度sGPS5、sGPS6組的A490 nm值均顯著大于對(duì)照組,其中50~100 μg/mL sGPS6組A490 nm值均顯著高于LPS組。說(shuō)明硒化大蒜多糖能提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能,sGPS6組活性最強(qiáng),在高濃度時(shí)效果優(yōu)于LPS。由此可見(jiàn),硒化大蒜多糖可能通過(guò)提高巨噬細(xì)胞吞噬功能來(lái)增強(qiáng)免疫作用,且其增強(qiáng)免疫活性的效果與硒化修飾條件有關(guān),并與濃度呈正相關(guān)。與劉佳等[18]的研究結(jié)果硒化乳酸菌胞外多糖能增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)中性紅的吞噬能力一致。
植物多糖主要是通過(guò)影響巨噬細(xì)胞的增殖和細(xì)胞吞噬活性等來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用,因此,常把巨噬細(xì)胞的增殖情況作為評(píng)價(jià)巨噬細(xì)胞功能的指標(biāo)之一[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,3個(gè)硒化大蒜多糖所有濃度組的A450 nm值均顯著大于對(duì)照組,100 μg/mL sGPS5組、50~100 μg/mL sGPS6組的A450 nm值均顯著高于LPS組,說(shuō)明硒化大蒜多糖能提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖能力,且sGPS5、sGPS6組在高濃度時(shí)效果優(yōu)于LPS。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖率的比較發(fā)現(xiàn),50 μg/mL sGPS6組的巨噬細(xì)胞增殖率顯著高于其余各組,100 μg/mL sGPS5、sGPS6組的巨噬細(xì)胞增殖率均顯著高于LPS組。說(shuō)明硒化大蒜多糖能提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖率,sGPS5、sGPS6組在高濃度時(shí)效果優(yōu)于LPS,sGPS6在3個(gè)硒化大蒜多糖中增殖率最高??梢?jiàn),硒化大蒜多糖可通過(guò)提高巨噬細(xì)胞增殖能力來(lái)實(shí)現(xiàn)其對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié),且其對(duì)巨噬細(xì)胞增殖率的影響與硒化修飾條件有關(guān),并與濃度呈正相關(guān)。
NO是巨噬細(xì)胞活化后分泌的主要活性物質(zhì)之一,不僅能殺死非特異性細(xì)菌和腫瘤,還參與T、B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)[20]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,12.5~100 μg/mL sGPS6組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清中NO含量顯著高于對(duì)照組,100 μg/mL sGPS6組NO含量顯著高于LPS組。說(shuō)明sGPS6能提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清NO含量,在100 μg/mL時(shí)優(yōu)于LPS。這可能是硒化大蒜多糖增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用機(jī)制之一,為進(jìn)一步研究硒化大蒜多糖的抗菌、抗腫瘤作用提供了思路。
巨噬細(xì)胞活化后除分泌NO外,還會(huì)分泌多種細(xì)胞因子,如TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6和IL-12等,具有廣泛的生物學(xué)活性[21]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,除6.25 μg/mL組外,其余濃度sGPS6組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-12含量均高于或顯著高于對(duì)照組;100 μg/mL sGPS6組TNF-α、IL-12含量均顯著高于LPS組,說(shuō)明sGPS6能提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清中細(xì)胞因子含量,100 μg/mL sGPS6優(yōu)于LPS或與LPS作用相當(dāng)。吳秀欽等[22]研究結(jié)果顯示,硒化修飾太子參多糖能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子;顧麗霞等[23]研究結(jié)果也顯示,硒化低聚氨基多糖能促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌TNF-α、IL-6及IL-10并提高其mRNA表達(dá)水平。 說(shuō)明硒化大蒜多糖的免疫增強(qiáng)活性的產(chǎn)生可能與誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子有關(guān)。
通過(guò)小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)和巨噬細(xì)胞吞噬雞血紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn),可以測(cè)定小鼠經(jīng)過(guò)刺激后是否引起小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的改變,從而判斷小鼠固有免疫的敏感性,通常以吞噬率和吞噬指數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,高、中、低劑量sGPS6組的吞噬指數(shù)A、B和吞噬率均顯著高于空白對(duì)照組,說(shuō)明sGPS6能提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)和吞噬率。宋玉龍等[24]研究結(jié)果也顯示,硒化修飾太子參多糖能提高免疫損傷小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)。表明硒化大蒜多糖不僅可以直接作用于體外的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,還可以體內(nèi)給藥的方式來(lái)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的功能。
本試驗(yàn)結(jié)果表明,硒化大蒜多糖能增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性和增殖能力,并且25~100 μg/mL sGPS6能提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清中NO、TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-12含量,0.5~2 mg/mL sGPS6能提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)和吞噬率。結(jié)果可為硒化大蒜多糖的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù),同時(shí)也為其抗菌、抗腫瘤等作用的挖掘提供思路。