蔡 杰，吳佳怡，潘苑霞，呼高偉，張林州

(1.中國科學院深圳先進技術研究院，深圳 518055；2.臺州學院生命科學學院，臺州 318000；3.湯陰縣畜牧獸醫(yī)總站，湯陰 456150)

金黃桿菌(Chryseobacteriumsp.)是一類無鞭毛，無芽孢，嚴格好氧生長的革蘭氏陰性菌，呈短小桿狀,其廣泛分布于水體、土壤和環(huán)境中，是常見的條件性致病菌[1]。常見的致病性金黃桿菌主要有腦膜膿毒金黃桿菌(Chryseobacteriummeningosepticum)、產(chǎn)吲哚金黃桿菌(Chryseobacteriumindologenes)及黏金黃桿菌(Chryseobacteriumgleum)，金黃桿菌既可引發(fā)外源性感染，也可因機體免疫力低下或抗生素濫用而引起內(nèi)源性感染，?？梢鹦膬?nèi)膜炎、術后感染、蜂窩織炎，嚴重時導致敗血癥的發(fā)生[2]。金黃桿菌雖為條件性致病菌,但其感染宿主范圍非常廣泛，不僅包括人，同時可引起畜禽[3]、虹鱒[4]、烏鱧[5]、鱘魚[6]、中華鱉[7]和河蟹等多種水生動物發(fā)生嚴重的疾病。金黃桿菌還可引起棘胸蛙發(fā)生歪頭病，致死率達100%[8]，而對鱘魚的致死率達83.3%[6]，由此說明金黃桿菌對部分水生動物具有較強的致病性，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可造成極大的經(jīng)濟損失。金黃桿菌不僅可感染動物，在植物體內(nèi)，如蘿卜和擬南芥中也發(fā)現(xiàn)了該菌[9-10]。

作為“四大海產(chǎn)”之一的大黃魚,因其肉質(zhì)鮮嫩，營養(yǎng)豐富深受消費者喜愛，是中國近海重要的經(jīng)濟魚類。近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)集約化養(yǎng)殖程度的加快和人工養(yǎng)殖密度的增加，加上管理水平的參差不齊和漁藥的不規(guī)范使用，引起大黃魚抵抗力降低或正常菌群失調(diào)，導致易感染條件性致病菌[11]。大黃魚感染金黃桿菌后影響“餐桌安全”，對人類健康造成潛在威脅。因此，對該菌在食品動物中進行流行病學調(diào)查和監(jiān)測工作的開展對于該病的防控起到重要作用。本試驗通過病料采集、細菌分離培養(yǎng)、16S rRNA基因序列鑒定、致病性及耐藥性分析，對該養(yǎng)殖場大黃魚疑似細菌感染病例進行診斷，并根據(jù)藥敏試驗指導臨床用藥，以期為大黃魚金黃桿菌病的診斷和臨床防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 伴隨有進食障礙、不合群、行動遲緩、體表潰瘍的患病大黃魚收集于浙江臺州某養(yǎng)殖場，體長30 cm左右，質(zhì)量400～500 g。

1.1.2 主要試劑及儀器 細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR Master Mix和凝膠回收試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；細菌生化微量鑒定管和藥敏紙片均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。FD-1B-80型真空冷凍干燥機購自北京博醫(yī)康公司。

1.2 病原菌分離和純化培養(yǎng)

取瀕死患病大黃魚，無菌條件生理鹽水反復沖洗體表3次，超凈臺中用75%酒精棉球?qū)w表進行擦拭消毒。剪取鰓絲、鰭條和潰瘍處組織制成水浸片進行鏡檢，排除寄生蟲感染。在超凈工作臺中剖取大黃魚的肝臟和腎臟，用生理鹽水沖洗后采用勻漿器將其研磨均勻，取研磨液置于離心管中，3 000 r/min離心5 min。取上清液劃線接種于TSA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h。挑取數(shù)量多，形態(tài)一致的單個優(yōu)勢菌落反復劃線純化培養(yǎng)。將純化菌株置于含15%甘油的LB液體培養(yǎng)基中，-80 ℃保存。

1.3 分離菌革蘭氏染色和掃描電鏡觀察

挑取純化培養(yǎng)后的單菌落，均勻涂布于含有一滴生理鹽水的載玻片中央，經(jīng)火焰固定，進行結晶紫染色、碘染、酒精脫色和蕃紅復染后光學顯微鏡進行觀察分析。

掃描電鏡樣品準備方法參考梁靜南等[12]方法進行，并做出相應的調(diào)整。離心收集1 mL經(jīng)培養(yǎng)后D600 nm值為1.0的菌液，PBS清洗3次。加入2.5%戊二醛，4 ℃固定過夜。固定后，PBS清洗3次。依次用30%、 50%、 70%、 80%、 90%和100%的酒精進行梯度脫水，最后采用乙酸異戊酯置換2次，15 min/次。將分離菌進行梯度冷凍(4、-20和-80 ℃)后置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥8 h。取少量凍干粉末進行真空噴金處理，使用日立S-4800型掃描電子顯微鏡進行觀察拍照。

1.4 分離菌生理生化鑒定

參考文獻[13-14]方法將分離的單菌落接種于相應的生理生化鑒定管中，按照細菌生化微量鑒定管說明書進行結果判定，并對照《伯杰細菌鑒定手冊》對分離菌株進行初步鑒定。

1.5 16S rRNA基因擴增及序列分析

利用細菌基因組提取試劑盒提取分離菌基因組DNA并作為模板,利用通用引物27F(5′-AGAGT-TTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTA-CCTTGTTACGACTT-3′)PCR擴增16S rRNA序列[13]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系50 μL：10×PCR Buffer 5 μL,MgCl23 μL,dNTP Mixture 1 μL,上、下游引物(5 μmol/L)各1 μL，基因組DNA 1 μL，Taq酶1 μL，ddH2O 37 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30個循環(huán)；72 ℃孵育10 min。PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠并利用凝膠純化回收試劑盒回收約1 500 bp 的PCR擴增產(chǎn)物，連接到pUCm-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

將測得的16S rRNA基因序列提交至NCBI-BLAST功能模塊和EzBioCloud database(https:∥www.ezbiocloud.net/)進行參考菌株的序列相似性比對分析，利用Clustal X軟件進行多重序列比對,利用Mega 6.0軟件構建遺傳進化樹，最大似然算法分析，并執(zhí)行Bootstrapping(1 000次復制)[15]。

1.6 動物回歸試驗

將純化后的分離菌在TSA培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，37 ℃震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。用平板稀釋法計算每毫升懸液的細菌數(shù)。選取體重10 g左右的健康大黃魚魚苗50尾(浙江宏野海產(chǎn)品有限公司)，適應飼養(yǎng)7 d。試驗分5組，試驗1、2、3、4組和對照組，10尾/組，試驗組分別腹腔注射濃度為1.0×109、1.0×108、1.0×107和1.0×106CFU/mL的分離菌，0.1 mL/尾，對照組注射等體積生理鹽水。 保持水溫20～25 ℃，期間正常給氧和換水，連續(xù)觀察15 d，記錄魚苗的死亡情況，根據(jù)Reed-Muench法計算半數(shù)致死量(LD50)[16]，并對瀕死魚肝臟進行病原菌分離與鑒定。

無菌條件下解剖病死魚，分離肝臟、腎臟和脾臟組織，使用4%多聚甲醛進行組織固定，送上海爾灣生物技術有限公司進行普通包埋和石蠟切片。樣品組織經(jīng)過70%～100%酒精逐級脫水處理，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，最后經(jīng)蘇木精-伊紅染色，顯微鏡進行成像。

1.7 藥敏試驗

挑取純化后的單個菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)12 h。采用紙片擴散法進行藥敏試驗[17]。將菌懸液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基表面，用滅菌的鑷子貼上含有不同種類抗菌藥的紙片，30 ℃恒溫培養(yǎng)36 h，測量抑菌圈直徑(inhibition zone diameter，IZD)，并參照藥敏試驗判斷標準來判定結果。

2 結 果

2.1 分離菌革蘭氏染色與形態(tài)學特征

在培養(yǎng)基表面可看到黃色圓形菌落，表面凸起、光滑，邊緣整齊富有光澤(圖1A)；革蘭氏染色結果顯示，分離菌為革蘭氏陰性紅色短棒狀菌，呈單個分散或成對分布(圖1B)，電鏡結果顯示，分離菌為末端鈍圓的棒狀桿菌。掃描電鏡觀察顯示，分離菌長為1.2～1.8 μm，寬為 0.4～0.6 μm，菌體黏連，無鞭毛，不具有運動能力，無芽孢(圖1C)。將分離菌命名為CH-2020-09。

2.2 分離菌生理生化特征

分離菌CH-2020-09生理生化試驗結果見表1。由表1可知，分離菌可在麥康凱瓊脂上生長，可利用葡萄糖、麥芽糖等產(chǎn)酸，不發(fā)酵蔗糖、乳糖等；氧化酶、過氧化氫酶、明膠酶、DNA 酶試驗結果均為陽性，可水解七葉苷，上述結果與細菌鑒定手冊中金黃桿菌屬菌株基本一致，因此，初步判定CH-2020-09為金黃桿菌屬細菌(Chryseobacteriumsp.)。

圖1 分離菌菌落形態(tài)(A)、革蘭氏染色鏡檢(B，1 000×)和超微結構觀察(C，50 000×)Fig.1 Observation of the isolate colonies (A),Gram staining (B，1 000×) and ultrastructure (C，50 000×)

表1 分離菌的生長特征與生化鑒定

2.3 分離菌16S rRNA基因擴增與序列分析

菌株CH-2020-09 16S rRNA基因PCR擴增結果顯示，擴增到了大小約1 500 bp的產(chǎn)物(圖2)。測序后將測得的長1 453 bp的16S rRNA基因序列提交至NCBI,經(jīng)BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)，分離株與GenBank中公布的金黃桿菌株5127相似性為98.0%，與金黃桿菌株FRGDSA 4580/97和水生金黃桿菌株10-46的相似性均為97.0%；而在EzBiO Cloud database 網(wǎng)站與標準菌株比對的結果顯示，菌株CH-2020-09與水生金黃桿菌亞種KCTC 12483的相似性最高，為99.3%。通過生物學軟件 Mega 6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示，菌株CH-2020-09可與不同種金黃桿菌(Chryseobacterium)聚為一簇(圖3)。綜合上述形態(tài)學特征、生理生化鑒定及 16S rRNA 基因序列比對結果，鑒定分離菌CH-2020-09為金黃桿菌未定種(Chryseobacteriumsp.)。

圖2 分離菌CH-2020-09 16S rRNA 基因 PCR 擴增結果電泳圖Fig.2 PCR amplification electrophoresis of 16S rRNA gene of the isolated strain CH-2020-09

圖3 分離菌CH-2020-09及金黃桿菌參考株的16S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene of strain CH-2020-09 and reference strains of Chryseobacterium

2.4 動物回歸試驗結果

分離菌經(jīng)腹腔注射大黃魚后，試驗魚主要表現(xiàn)為行動遲緩，不合群，采食障礙，注射部位微紅，有脹氣，解剖腹腔后，有少量腹水和肝臟腫大，而對照組大黃魚表現(xiàn)正常，死亡率為0(表2)。從人工感染發(fā)病瀕死大黃魚的肝臟組織可再次分離到與CH-2020-09形態(tài)一致的菌落，而未分離到其他細菌，同時在對照組試驗魚體內(nèi)未分離到該菌。經(jīng)計算CH-2020-09對大黃魚的LD50為6.32×104CFU/mL。

表2 分離菌CH-2020-09對大黃魚的感染致死情況

2.5 組織病理變化

感染CH-2020-09后的大黃魚肝臟、腎臟、脾臟組織病變明顯。正常大黃魚肝細胞排列緊密，呈不規(guī)則型，細胞界限和細胞核清晰(圖4A)，感染組肝臟腫大，細胞排列疏松、結構模糊，細胞壞死，細胞核消失，出現(xiàn)空泡化(圖4A′，箭頭所示)；正常大黃魚腎小管管腔結構規(guī)則清晰，腎小管上皮細胞排列整齊、界限清晰，管腔中刷狀緣明顯，細胞核完整(圖4B)，感染組腎小管充血，結構破壞，管腔呈現(xiàn)不規(guī)則或閉合，刷狀緣紊亂，細胞出血空泡變性(圖4B′，箭頭所示)；正常大黃魚脾臟組織紅細胞群和白細胞群均勻分布存在，細胞核完整，淋巴細胞分布其中(圖4C)，感染組脾細胞腫大，部分脾臟組織細胞壞死、空泡化，紅細胞崩解，含鐵血黃素沉積。淋巴細胞壞死和數(shù)量減少(圖4C′，箭頭所示)。

2.6 藥敏試驗結果

紙片法檢測菌株CH-2020-09對16種抗菌藥的敏感性，結果發(fā)現(xiàn)菌株CH-2020-09對阿米卡星和左氧氟沙星敏感，對慶大霉素、新霉素和紅霉素中度敏感，對頭孢克肟、氨芐西林、卡那霉素、呋喃唑酮、青霉素-G和鏈霉素等11種抗菌藥均耐藥(表3)。

A～C，分別為對照組魚的肝臟、腎臟和脾臟組織；A′～C′，分別為試驗組魚的肝臟、腎臟和脾臟組織A-C，Liver,kidney and spleen of fish in control group,respectively；A′-C′，Liver,kidney and spleen of fish in experimental group,respectively圖4 組織病理學觀察(2 000×)Fig.4 Histopathological observation (2 000×)

3 討 論

金黃桿菌屬于黃桿菌科 (Flavobacteriaceae) 金黃桿菌屬 (Chryseobacterium)，該屬目前有60 多種菌，近幾年相繼有新種被鑒定[18-19]。部分金黃桿菌是條件性致病菌，其可感染人類和多種動物引發(fā)疾病。近年來由于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)集約化程度的加大及漁藥的不規(guī)范使用，由金黃桿菌感染引起多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物發(fā)生疾病的報道逐年增多，包括烏鱧[5,17]、鱘魚[6]、中華鱉[7]、金結魚[15]、牛蛙[20]、鯽魚[21],可引起水產(chǎn)動物發(fā)生疾病的金黃桿菌主要有腦膜炎敗血金黃桿菌、大菱鲆金黃桿菌(Chryseobacteriumscophthalmum)和產(chǎn)吲哚金黃桿菌。其中從患病金結魚(Torputitora)分離到的大菱鲆金黃桿菌表現(xiàn)出很強的毒性效應。

本研究從患病大黃魚體內(nèi)分離到1株致病性金黃桿菌CH-2020-09，通過形態(tài)學觀察和生理生化試驗初步鑒定該分離菌為金黃桿菌屬細菌，該分離菌與卜令飛等[20]從牛蛙體內(nèi)分離到的金黃桿菌生理生化特征相似。16S rRNA序列分析結果顯示，其與不同種金黃桿菌的相似性在97.0%以上，與金黃桿菌標準菌株KCTC 12483的相似性最高為99.3%，綜合以上數(shù)據(jù)可證實分離菌株CH-2020-09為金黃桿菌未定種，種的確定還有待于進一步鑒定。

為進一步了解分離菌對宿主的致病性，本研究通過人工感染試驗和組織病理學觀察研究了分離的金黃桿菌對大黃魚的致病作用，結果顯示，金黃桿菌感染后可引起大黃魚的肝臟和腎臟組織發(fā)生充血腫大，組織細胞發(fā)生空泡化變性及脾臟組織中含鐵血黃素沉積。金黃桿菌CH-2020-09引發(fā)大黃魚發(fā)生的組織病理變化與Neetu等[15]研究發(fā)現(xiàn)大菱鲆金黃桿菌引起金結魚肝臟、腎臟、脾臟等組織充血出血的病理變化一致。截至目前有關金黃桿菌致病機理方面的研究較少，大多數(shù)研究主要是通過人工感染試驗研究其致病性，而王鑫毅等[5]對產(chǎn)吲哚金黃桿菌的胞外產(chǎn)物成分的致病性研究結果表明金黃桿菌的胞外產(chǎn)物具有較強的毒性。

抗生素是治療細菌性疾病的首選特效藥之一，但近年來，由于抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的過度應用，導致嚴重的耐藥性問題[22]。前期研究表明，在人類臨床上金黃桿菌屬對三代頭孢菌素、喹諾酮類及亞胺培南等抗菌藥存在嚴重的耐藥性[23]?？捉艿萚24]在鱘魚體內(nèi)分離到1株金黃桿菌liver 5，其對氧氟沙星敏感，對新霉素、紅霉素中度敏感。源于棘腹蛙中的金黃桿菌CQW201410對哌拉西林和環(huán)丙沙星敏感[25]。何夙旭等[6]研究結果表明，鱘魚源金黃桿菌B8對大多數(shù)臨床上上常用抗生素有很強的耐藥性，但對新霉素和紅霉素敏感。藥敏試驗結果顯示，本研究分離的金黃桿菌CH-2020-09對阿米卡星和左氧氟沙星敏感，對慶大霉素、新霉素和紅霉素中度敏感，對其他不同種類的抗菌藥均耐藥，該結果與上述研究基本相似。無論人類或獸醫(yī)臨床上金黃桿菌屬多數(shù)菌株的耐藥性愈發(fā)廣泛和嚴重，為該病的治療和防控帶來了巨大的挑戰(zhàn)。因此，在確診感染金黃桿菌時進行藥物敏感性檢測后選擇敏感性藥物用于臨床治療，可進一步減少抗菌藥濫用，另外，可抵御金黃桿菌感染的安全有效的疫苗有待被開發(fā)出來[26]。

4 結 論

本研究從浙江臺州地區(qū)發(fā)病的大黃魚體內(nèi)分離到1株金黃桿菌CH-2020-09，其16S rRNA序列與金黃桿菌標準株相似性為99.3%，CH-2020-09可導致大黃魚的肝臟、腎臟和脾臟組織發(fā)生明顯的病理變化，其對阿米卡星和左氧氟沙星敏感，對慶大霉素、新霉素和紅霉素中度敏感。