王小瑩，李秀梅，王秀敏，劉魏魏，楊 娟，田 薇，周煒煒，戴小楓

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

近年來(lái)隨著養(yǎng)雞業(yè)的快速發(fā)展，雞場(chǎng)逐漸規(guī)模化和標(biāo)準(zhǔn)化，但在飼養(yǎng)管理、消毒衛(wèi)生、傳染病防治等方面仍存在各種問(wèn)題[1]，易造成雞腹瀉等疾病的發(fā)生與蔓延[2-3]。雞常見(jiàn)的腹瀉類(lèi)型包括中毒性腹瀉、細(xì)菌性腹瀉、病毒性腹瀉、寄生蟲(chóng)性腹瀉、代謝性腹瀉和營(yíng)養(yǎng)性腹瀉等[4-5]。雖然抗生素可防治雞群腹瀉，改善飼料利用率，促進(jìn)雞的生長(zhǎng)[6-7]，但由于抗生素的過(guò)度使用和濫用，細(xì)菌極易產(chǎn)生耐藥性，從而導(dǎo)致“超級(jí)細(xì)菌”產(chǎn)生[8]，嚴(yán)重危害人類(lèi)和動(dòng)物的健康。為避免這些情況的發(fā)生，2020年7月，中國(guó)正式禁止飼料生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)含有促生長(zhǎng)類(lèi)藥物(除中藥外)添加劑的商品飼料?！敖沽睢钡氖┬型苿?dòng)了綠色安全替代產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)[9]。此外，中藥具有毒副作用低、無(wú)耐藥性、功能多樣、抗腹瀉效果等優(yōu)點(diǎn)[10-12]。因此，從中藥復(fù)方中尋找一種可替代抗生素治療雞腹瀉的方法成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)[13]。

白龍散是由白頭翁(20 g)、龍膽(10 g)、黃連(10 g)3種中藥組合而成的復(fù)方[14]，據(jù)2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》[15]記載，白頭翁為毛茛科植物白頭翁(PulsatillachinensisBge.)的干燥根，其味苦性寒[16]，歸胃、大腸經(jīng)，有清熱解毒、涼血止痢的功效，臨床上用于治療熱毒血痢、陰癢帶下；黃連為毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch.)、三角葉黃連(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao)或云連(CoptisteetaWall.)的干燥根莖，其味苦性寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)，功效為清熱燥濕、瀉火解毒；龍膽為龍膽科植物條葉龍膽(GentianamanshuricaKitag.)、龍膽(GentianascabraBge.)、三花龍膽(GentianatrifloraPall.)或堅(jiān)龍膽(GentianarigescensFranch.)的干燥根和根莖，其味苦性寒，歸肝、膽經(jīng)，有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效。白龍散可通過(guò)抑制大腸桿菌、志賀氏痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌[17]等的生長(zhǎng)達(dá)到治療雛雞白痢[18]、仔豬黃痢[19]、羔羊痢疾[20]的目的。但白龍散作為中藥復(fù)方，其藥物組成較多，有效成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)多，作用機(jī)制尚不明確。本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法揭示中藥復(fù)方白龍散治療雞腹瀉的潛在分子機(jī)制，從而為白龍散的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 白龍散活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)篩選白龍散(白頭翁、龍膽、黃連)的所有化學(xué)成分，篩選閾值設(shè)定為口服生物利用度(OB,oral bioavailability)≥30%及類(lèi)藥性(DL,drug-like index)≥0.18，利用所篩選的活性成分收集對(duì)應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)，將所有潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.uniprot.org/)中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理并設(shè)置物種為“Gallusgallus”，查詢(xún)得到基因簡(jiǎn)稱(chēng)，利用Cytoscape_3.8.0軟件構(gòu)建白龍散活性成分-潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 白龍散治療雞腹瀉的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.genecards.org/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥omim.org/)以“Gallusdiarrhea”為關(guān)鍵詞搜索疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集，獲取雞腹瀉相關(guān)的基因，將2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到的基因合并去重后得到雞腹瀉的相關(guān)靶點(diǎn)。使用Venny 2.1軟件(https:∥bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲取白龍散藥物靶點(diǎn)和雞腹瀉疾病靶點(diǎn)的交集，運(yùn)用Cytoscape_3.8.0軟件構(gòu)建白龍散-活性成分-靶點(diǎn)和雞腹瀉疾病-靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.string-db.org/)中，設(shè)置物種為“Gallus”，置信度≥0.04，獲取相應(yīng)的蛋白相互作用信息，并對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分析。

1.3 GO功能注釋及KEGG通路富集分析

將白龍散作用于雞腹瀉的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥david.ncifcrf.gov/tools.jsp)進(jìn)行功能注釋和富集分析，以探討其治療雞腹瀉的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路。

2 結(jié) 果

2.1 白龍散活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

通過(guò)TCMSP共篩選得到168個(gè)活性成分，其中白頭翁57個(gè)，龍膽63個(gè)，黃連48個(gè)。根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18篩選標(biāo)準(zhǔn)后，共得到27個(gè)活性成分，其中白頭翁9個(gè)，龍膽8個(gè)，黃連10個(gè)，檢索27個(gè)活性成分篩選去重后共獲得57個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。利用Cytoscape_3.8.0軟件構(gòu)建并分析白龍散活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)連接度較高的有黃連中的槲皮素(40)，龍膽中的山奈酚(15)、白頭翁中的異鼠李素(12)，還有Beta-谷固醇(10)、金魚(yú)草素(7)、豆固醇(7)、R型氫化小檗堿(7)等(表1)。

三角代表中藥，黃色、紅色、藍(lán)色的菱形代表白頭翁、黃連、龍膽的活性成分，橢圓形代表白龍散潛在作用靶點(diǎn)。圖3同Triangle represents the traditional Chinese medicine,the yellow,red and blue diamonds represent the active ingredients of Pulsatillae Radix,Coptidis Rhizoma and Gentianae Radix et Rhizoma,and the ellipse represents the potential target of Bailongsan.The same as fig.3圖1 白龍散活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Active ingredients-target network of Bailongsan

表1 白龍散的主要活性成分

續(xù)表

2.2 白龍散治療雞腹瀉的關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

通過(guò)GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)分別檢索得到4 060和413個(gè)雞腹瀉的相關(guān)基因，去重后共得到4 207個(gè)疾病靶點(diǎn)。venn分析得到45個(gè)交集靶點(diǎn)(圖2)，利用Cytoscape_3.8.0軟件構(gòu)建白龍散-活性成分-靶點(diǎn)和雞腹瀉疾病-靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。將45個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING軟件平臺(tái)后得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖后利用Cytoscape_3.8.0軟件進(jìn)行可視化(圖4)。根據(jù)Degree值列舉白龍散治療雞腹瀉的靶點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，白龍散藥物靶點(diǎn)與雞腹瀉靶點(diǎn)中轉(zhuǎn)錄因子AP-1(transcription factor AP-1,JUN)、原癌基因蛋白質(zhì)類(lèi)C(Myc proto-oncogene protein，MYC)、雌激素受體1(estrogen receptor 1，ESR1)、B細(xì)胞淋巴瘤2家族蛋白1(Bcl-2-like protein 1，BCL2L1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、G1/S-specific周期蛋白D1(G1/S-specific cyclin-D1，CCND1)等互作的頻率較大。

2.3 GO功能和KEGG通路富集分析

通過(guò)DAVID在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO功能富集分析，確定了112條GO條目，其中生物過(guò)程主要涉及細(xì)胞增殖、正調(diào)控IL-12的產(chǎn)生、蛋白水解作用、對(duì)病毒的防御反應(yīng)、消化道形態(tài)發(fā)生、炎癥反應(yīng)等76個(gè)；細(xì)胞組分主要涉及到胞質(zhì)、細(xì)胞核、核染色質(zhì)等13個(gè)； 分子功能主要涉及類(lèi)固醇綁定、甾類(lèi)激素綁定、雌激素受體的活動(dòng)、DNA結(jié)合、蛋白結(jié)合等23個(gè)(圖5)。KEGG通路分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，主要涉及細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、腫瘤抑制蛋白(tumor suppressor gene，p53)信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等22條信號(hào)通路(圖6)。綜合比較分析發(fā)現(xiàn)，白龍散中有效化學(xué)成分可作用于核染色質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)中炎癥反應(yīng)、類(lèi)固醇綁定、甾類(lèi)激素綁定等多個(gè)生物過(guò)程和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、p53信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等多條信號(hào)通路，達(dá)到治療雞腹瀉的目的。

圖2 白龍散與雞腹瀉交集靶點(diǎn)韋恩圖Fig.2 Venn diagram of intersection targets of Bailongsan and chicken diarrhea

圖3 白龍散活性成分-靶點(diǎn)和雞腹瀉疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network diagram of Bailongsan active ingredients-targets and chichen diarrhea disease-targets

依據(jù)度值作圖，度值越大，靶點(diǎn)的面積越大According to the degree,the larger the degree value,the larger the target area圖4 白龍散治療雞腹瀉關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 PPI network of key targets of Bailongsan in treatment of chicken diarrhea

表2 白龍散治療雞腹瀉STRING網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn)

3 討 論

雞腹瀉作為養(yǎng)雞場(chǎng)常見(jiàn)的群發(fā)性疾病在全國(guó)各地養(yǎng)雞場(chǎng)廣泛發(fā)生，已成為疾病防治中的重點(diǎn)研究對(duì)象之一，同時(shí)造成雞腹瀉的原因較多，為該病的防治帶來(lái)許多困難[21]。白龍散由白頭翁、黃連和龍膽3味中藥組成，其功效為清熱燥濕、涼血止痢，可用于治療濕熱瀉痢、熱毒血痢[22]，可見(jiàn)其在治療熱瀉、痢疾方面有良好的作用。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，利用OB和DL值篩選得到白龍散中27個(gè)活性成分。金魚(yú)草素、異鼠李素、槲皮素、異牡荊素、日當(dāng)藥黃素、山奈酚等黃酮類(lèi)化合物能顯著提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和機(jī)體抗病力,并改善動(dòng)物機(jī)體免疫機(jī)能[23]；其中，槲皮素具有抗炎活性，可通過(guò)改變腹腔毛細(xì)血管和腸黏膜的通透性，減少腸道水分和電解質(zhì)的分泌，以達(dá)到治療腹瀉的目的[24]。小檗堿、小檗紅堿、表小檗堿、R型氫化小檗堿、小檗浸堿、黃連堿、巴馬汀、甲基黃連堿等生物堿類(lèi)化合物具有抗菌、抗病毒作用[25]；其中，小檗堿具有抗菌消炎、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、修復(fù)腸道屏障等作用[26]；巴馬汀能減少腸道炎癥[27]。導(dǎo)致雞腹瀉的部分原因是機(jī)體感染病毒或細(xì)菌，而具有抗菌、抗病毒等作用的活性成分能抑制微生物生長(zhǎng)，從而有效治療腹瀉。β-谷甾醇、豆固醇、谷甾醇等甾體類(lèi)化合物具有良好的抗炎活性[28]。龍膽中的芝麻素屬于脂素類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗炎、調(diào)脂、保護(hù)肝腎及心血管系統(tǒng)、抗腫瘤等作用[29]。雞腹瀉會(huì)引起炎癥反應(yīng)，具有良好的抗炎活性能緩解機(jī)體炎癥，從而改善雞腹瀉?？梢?jiàn)，白龍散有效成分主要是通過(guò)抗炎、抗菌等作用來(lái)達(dá)到改善雞腹瀉的目的。

PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果表明JUN、MYC、ESR1、IL-6、前列腺素G/H合成酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)等是治療雞腹瀉的關(guān)鍵靶點(diǎn)。JUN是哺乳動(dòng)物二聚體轉(zhuǎn)錄因子AP-1亞基之一，AP-1是位于JNK下游的關(guān)鍵信號(hào)蛋白分子，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[30]。MYC是MYC原癌基因蛋白，與炎癥組織損傷和修復(fù)方面有關(guān)[31]。ESR1是雌激素受體，有研究報(bào)道ESR1可與NF-κB間以細(xì)胞類(lèi)型特異性的方式發(fā)生相互抑制[32]，降低NF-κB的DNA結(jié)合活性，抑制NF-κB介導(dǎo)的IL-6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，并取代啟動(dòng)子中的RELA/p65和相關(guān)的輔助調(diào)節(jié)因子[33]。IL-6在免疫、組織再生和代謝方面具有廣泛生物學(xué)功能[34]，其表達(dá)水平在感染、創(chuàng)傷或損傷后迅速上升，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[35]。PTGS2是前列腺素生物合成途徑中的雙環(huán)氧合酶和過(guò)氧化物酶，在各種細(xì)胞中可被促炎細(xì)胞因子、腫瘤促進(jìn)劑、有絲分裂原和生長(zhǎng)因子等高度誘導(dǎo)，從而參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和凋亡等多種病理過(guò)程[36]。綜上，JUN、MYC、ESR1、IL-6、PTGS2等靶點(diǎn)與炎癥反應(yīng)有關(guān)，這表明白龍散可能會(huì)通過(guò)作用于炎癥相關(guān)的靶點(diǎn)來(lái)治療雞腹瀉。

圖5 白龍散治療雞腹瀉的關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO功能富集分析Fig.5 GO functional enrichment analysis of key targets of Bailongsan in the treatment of chicken diarrhea

圖6 白龍散-雞腹瀉關(guān)鍵靶點(diǎn)基因KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of key targets of Bailongsan in treatment of chicken diarrhea

GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果表明，白龍散治療雞腹瀉涉及多條生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，根據(jù)P值得到細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、p53信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等主要信號(hào)通路。細(xì)胞因子是細(xì)胞間重要的調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞動(dòng)員因子，參與先天和適應(yīng)性炎癥宿主防御、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、死亡及恢復(fù)穩(wěn)態(tài)的發(fā)育和修復(fù)過(guò)程[37]。有研究報(bào)道,雞感染禽致病性大腸埃希菌后，IL-8、IL-1β、CCL19等基因表達(dá)量上升，參與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號(hào)通路中的炎癥反應(yīng)[38]。 p53作為腫瘤抑制基因與炎癥的主要調(diào)節(jié)因子NF-κB相互負(fù)調(diào)控，且p53信號(hào)通路可通過(guò)p53負(fù)調(diào)控NF-κB、TLR-4及TRAF6基因的表達(dá)，從而抑制NF-κB信號(hào)通路的活化[39-40]。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以介導(dǎo)單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞p38的激活，從而引起炎性反應(yīng)[41]。上述信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)相關(guān)，進(jìn)一步證明了白龍散可能是通過(guò)參與炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路來(lái)治療雞腹瀉。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到白龍散中3味中藥活性成分的潛在作用靶點(diǎn)，利用STRING和Cytoscape軟件、在線(xiàn)維恩圖、DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建白龍散與腹瀉的靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，預(yù)測(cè)了關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路，對(duì)中藥復(fù)方白龍散治療雞腹瀉進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)分析。白龍散治療雞腹瀉的分子機(jī)制可能主要通過(guò)槲皮素、山奈酚、異鼠李素等調(diào)控JUN、MYC、ESR1、IL-6等靶點(diǎn)，經(jīng)由細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、p53信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。但由于中藥成分復(fù)雜，雞腹瀉病因尚未知，白龍散治療雞腹瀉的實(shí)際作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。