蘭 虹，任廣彩，葉俊賢，熊 挺，何獻(xiàn)銘，劉郁夫,2，楊澤坤，郝文茜，陳瑞愛(ài),2,,4

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室肇慶分中心，肇慶 526238；3.華農(nóng)(肇慶)生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，肇慶 526238；4.肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司，肇慶 526238)

禽腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于禽腺病毒科禽腺病毒屬成員，是呈二十面體對(duì)稱的無(wú)囊膜線性雙股DNA病毒，其基因組線性長(zhǎng)度為43～45 kb，病毒直徑為70～100 nm[1]。腺病毒的核衣殼有3個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白：六鄰體蛋白(Hexon)、纖突蛋白(Fiber)和五鄰體蛋白(Penton)[2-3]。Hexon蛋白是腺病毒科各屬病毒最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，每個(gè)Hexon蛋白表面攜帶有病毒主要的屬種特異性抗原決定簇，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的靶目標(biāo)，含有病毒主要的保護(hù)性抗原基因簇，與病毒的致病性密切相關(guān)[4-5]。根據(jù)群特異性抗原的不同，F(xiàn)AdV可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個(gè)亞群，Ⅰ亞群FAdV具有共同的群抗原，基于限制性內(nèi)切酶片段圖譜和核酸序列等分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)將Ⅰ群FAdV分為A～E 5個(gè)種[6]，每個(gè)種內(nèi)的病毒根據(jù)血清交叉中和試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步分為12個(gè)血清型(1～7、8a、8b、9～11)[7]。

FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11為中國(guó)FAdV流行的主要血清型，大部分毒株會(huì)造成包涵體肝炎(inclusion body hepatitis，IBH)，剖檢肝臟黃染、腫大、表面有密集的小出血點(diǎn)或出血斑，嚴(yán)重者可見(jiàn)灰黃色壞死灶，部分毒株還會(huì)有心包積液的癥狀[8]。IBH特征性病理變化為肝臟組織切片在顯微鏡下可觀察到嗜堿性核內(nèi)包涵體[9-10]。研究表明，F(xiàn)AdV的發(fā)生可能與機(jī)體的免疫抑制有關(guān)，病禽常伴發(fā)傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)與雞傳染性貧血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)繼發(fā)感染，CIAV繼發(fā)感染可增強(qiáng)某些腺病毒引起的肝炎癥狀和致死力，此外，當(dāng)FAdV與IBDV共同感染時(shí)，腺病毒的感染性增強(qiáng)[11-12]。由于FAdV屬于免疫抑制病原，既可水平傳播，又可垂直傳播，且可間歇性排毒，因此，該病是目前國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖戶最為關(guān)注的疫病之一。本研究以從江蘇省南通市某雞場(chǎng)分離到的FAdV-11毒株為研究主體，通過(guò)全基因組測(cè)序分析其遺傳進(jìn)化情況，并通過(guò)SPF雞致病性試驗(yàn)研究該毒株的致病力，以期為FAdV的分子流行病學(xué)研究和臨床防控措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料樣品及試驗(yàn)動(dòng)物

病料組織來(lái)源于江蘇省南通市某雞場(chǎng)疑似FAdV感染的雞的肝臟，于-80 ℃保存。SPF雞胚和SPF雞均購(gòu)自新興大華農(nóng)禽蛋有限公司。

1.2 主要試劑

AxyPrep體液病毒DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司；ExTaq酶購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；Trans2K DNA Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；TRIzol?Reagent(15596-026)購(gòu)自Invitrogen公司；無(wú)水乙醇、氯仿均購(gòu)自浙江寧波萃英化學(xué)技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑5×EasyQuick RT MasterMix購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；4%多聚甲醛組織固定液購(gòu)自廣州賽國(guó)生物科技有限公司。

1.3 病毒分離與增殖

將肝臟組織剪碎后按1∶3的比例加入滅菌PBS進(jìn)行研磨制成懸液，反復(fù)凍融3次，并于4 ℃、8 000×g離心15 min，取上清液，加入終濃度為1 000 U/mL的青、鏈霉素，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，無(wú)菌檢驗(yàn)合格后保存?zhèn)溆谩?/p>

將上述制備好的病料研磨液離心，上清經(jīng)卵黃囊途徑接種7日齡SPF雞胚，0.2 mL/枚，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，注射等量滅菌PBS，置于37 ℃溫箱孵育，每12 h照胚觀察一次，連續(xù)觀察192 h，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，收集攻毒組24 h后死亡雞胚的尿囊液，將收集的尿囊液過(guò)濾除菌后重新接種至新的SPF雞胚中，盲傳至第3代，觀察第3代死亡雞胚的肝臟組織，并收集死亡雞胚尿囊液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒PCR鑒定及純凈性檢測(cè)

用AxyPrep體液病毒DNA/RNA提取試劑盒抽提第3代雞胚尿囊液中的DNA，利用基因組的保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)Ⅰ群FAdV通用鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為：FAdV-F：5′-GTGGTRT-CCATGTTGGT-3′；FAdV-R：5′-ATGTACGCYT-CCGCCCTC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)約494 bp。PCR擴(kuò)增體系20 μL：2×ExTaq酶10 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，加滅菌ddH2O補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

利用Trizol法提取第3代雞胚尿囊液中的總RNA。采用PCR/RT-PCR方法檢測(cè)P3代尿囊液的外源病原體，檢測(cè)的禽DNA病毒有傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)和CIAV。檢測(cè)的禽RNA病毒有：IBDV、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)、禽流感病毒(Avian influenza viruses,AIV)、禽呼腸孤病毒(Avian reovirus,ARV)。檢測(cè)的禽支原體有：雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum,MG)、滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae,MS)。此部分鑒定引物均為本實(shí)驗(yàn)室常用鑒定引物，敏感性和特異性已得到驗(yàn)證[13]。

本研究所涉及的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，將鑒定為FAdV陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.5 電鏡負(fù)染

用50 μL純水重懸病毒粒子，在玻片上以1%磷鎢酸負(fù)染30 s，包埋在200目聚乙烯醇縮甲醛銅網(wǎng)上，用電子顯微鏡觀察病毒粒子的形態(tài)。

1.6 相似性與遺傳進(jìn)化分析

利用MegAlign軟件將NCBI網(wǎng)站上下載的FAdV參考毒株序列與本研究分離的毒株全基因序列進(jìn)行序列比對(duì)分析，并用Mega 6.0軟件，通過(guò)Neighbor-Joining法構(gòu)建病毒全基因組和Hexon基因遺傳進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap值重復(fù)1 000次。

1.7 致病性試驗(yàn)

20只10日齡SPF雞隨機(jī)分為攻毒組和對(duì)照組，10只/組。 攻毒組以胸肌注射的方式接種第15代死亡雞胚尿囊液，1 mL/只(105.33EID50/0.2 mL)，對(duì)照組注射等量無(wú)菌生理鹽水，連續(xù)觀察10 d。隔離飼養(yǎng)，記錄雞的發(fā)病情況及臨床表現(xiàn)。分別在攻毒后3、5、7、10 d采集雞喉頭、泄殖腔拭子，加入滅菌PBS，反復(fù)凍融3次后離心取上清提取病毒DNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腺病毒的排毒情況。 引物序列為：52K-fw：5′-ATGGCKCAGATGGCYA-AGG-3′；52K-rv：5′-AGCGCCTGGGTCAAACCGA-3′。

采集發(fā)病死亡雞及觀察期結(jié)束后存活雞(存活雞均處死)的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腺胃、肌胃組織研磨后提取DNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)病毒載量，一部分組織研磨處理后離心取上清，重新接種SPF雞胚進(jìn)行病毒分離；再另取各雞的肝臟、腎臟、心臟組織，用4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，用HE染色后進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離與鑒定

處理后的病料研磨液離心上清通過(guò)卵黃囊途徑接種7日齡SPF雞胚，收獲病死胚尿囊液，處理后盲傳至第3代，可見(jiàn)接毒雞胚144 h后開(kāi)始出現(xiàn)死亡，剖檢可見(jiàn)接毒雞胚肝臟腫大，質(zhì)脆，遍布出血斑點(diǎn)(圖1A)，對(duì)照組雞胚發(fā)育正常，無(wú)明顯眼觀病變(圖1B)。提取第3代增殖尿囊液的DNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后得到大小約494 bp的特異性擴(kuò)增條帶(圖2)，與預(yù)期大小相符。

2.2 病毒純凈性檢測(cè)

P3代雞胚尿囊液經(jīng)PCR/RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示ILTV、CIAV、IBDV、IBV、AIV、REV、ARV、NDV、MS和MG均為陰性(圖3)。

2.3 電鏡負(fù)染

將病毒粒子進(jìn)行負(fù)染，在透射電子顯微鏡下可見(jiàn)球型、無(wú)囊膜，直徑為70～90 nm，具有FAdV典型的二十面體結(jié)構(gòu)(圖4)。將該分離毒株命名為JSNT-1。

A，攻毒組；B，對(duì)照組A，Challenge group;B，Control group圖1 雞胚肝臟病變Fig.1 Chick embryo liver lesion

M，Trans2K DNA Marker;1，陽(yáng)性對(duì)照;2，第3代雞胚尿囊液;3，陰性對(duì)照M，Trans2K DNA Marker;1，Positive control;2，The third generation chicken embryo allantoic fluid;3，Negative control圖2 雞胚尿囊液PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR result of virus isolated from chick embryo allantoic

M，Trans2K DNA Marker；1，F(xiàn)AdV鑒定引物；2，陰性對(duì)照；3～15，分別是CIAV、IBV 1號(hào)、IBV 2號(hào)、A型AIV、H5亞型AIV、H9亞型AIV、IBDV、REV、ARV、NDV、ILTV、MS、MG鑒定引物M，Trans2K DNA Marker;1，F(xiàn)AdV identification primers;2，Negative control；3-15，CIAV,IBV No.1,IBV No.2,Avian influenza A virus,H5 subtype AIV,H9 subtype AIV,IBDV,REV,ARV,NDV,ILTV,MS and MG identification primers，respectively圖3 外源病原體PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of foreign pathogens

圖4 病毒粒子電鏡觀察(70 000×)Fig.4 Electron microscope observation of virus particle (70 000×)

2.4 全基因組遺傳進(jìn)化分析

利用Mega 6.0將JSNT-1株全基因組(全長(zhǎng)43 491 bp，GC含量53%)與不同血清型FAdV毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示,JSNT-1處于D型FAdV分支上，在這個(gè)分支內(nèi)，JSNT-1與加拿大ON P2(KU310942.1)、加拿大ON NP2(KP231537.1)、墨西哥MX95-S11(KU746335.1) FAdV-11型毒株親緣關(guān)系更近， 而與日本SR48(KT862806.1)、 英國(guó)685(KT862805.1) FAdV-2毒株，日本SR49(KT862807.1) FAdV-3毒株，加拿大A-2A(AF083975.2) FAdV-9毒株的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)(圖5)。

圖5 基于JSNT-1株全基因組核苷酸的遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree based on the whole genomic sequence of JSNT-1 isolate

2.5 Hexon基因遺傳進(jìn)化分析

JSNT-1株Hexon基因全長(zhǎng)2 853 bp，共編碼950個(gè)氨基酸。將JSNT-1株與GenBank中毒株進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，JSNT-1與中國(guó)JL/1407、加拿大ON P2和ON NP2、墨西哥MX95-S11毒株處于同一分支，同屬FAdV-11血清型(圖6)。用MegAlign比對(duì)JSNT-1與22個(gè)相關(guān)毒株的氨基酸序列相似性顯示，JSNT-1與參考毒株的相似性為77.2%～100%；與D種參考毒株相似性為89.4%～100%，其中與FAdV-11型中國(guó)分離株JL/1407、HBQ 12、LN/1507，加拿大分離株ON P2、ON NP2，墨西哥分離株MX95-S11氨基酸相似性最高，為100%，與FAdV-11血清型伊朗分離株UT-Kiaee、巴基斯坦分離株P(guān)KFAd18、美國(guó)分離株GA、英國(guó)分離株380相似性分別為99.6%、99.5%、98.4%和98.5%，分別存在4、5、16和15個(gè)點(diǎn)突變，與FAdV-2血清型加拿大分離株A-2A相似性最低，為89.4%(圖7)。

圖6 基于Hexon基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree based on Hexon gene nucleotide sequence of JSNT-1 isolate

圖7 基于Hexon蛋白氨基酸序列的相似性比對(duì)Fig.7 Similarity comparison based on the amino acid sequence of Hexon protein

2.6 致病性試驗(yàn)

2.6.1 回歸試驗(yàn)結(jié)果 以5×105.33EID50的劑量攻毒10日齡SPF雛雞后，僅有個(gè)別雛雞出現(xiàn)精神沉郁的癥狀，攻毒后5 d，死亡1只，至觀察期結(jié)束其余9只狀態(tài)良好，沒(méi)有明顯臨床癥狀。對(duì)照組至觀察期結(jié)束，臨床表現(xiàn)正常未見(jiàn)死亡。剖檢病死雞，發(fā)現(xiàn)肝臟褪色變黃，出血腫脹，邊緣鈍圓；腎臟腫大蒼白、有點(diǎn)狀出血。攻毒10 d后剖檢存活雞，各臟器均無(wú)明顯肉眼可見(jiàn)病變。

2.6.2 感染雞排毒情況監(jiān)測(cè) 取采集的感染雞喉頭、泄殖腔拭子處理后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，SPF雛雞感染病毒后3、5、7和10 d喉頭、泄殖腔均可檢測(cè)到排毒，其中泄殖腔排毒率均為100%，觀察期內(nèi)排毒量持續(xù)升高，而喉頭在攻毒后5 d達(dá)到排毒率及排毒量的高峰(圖8)。取發(fā)病死亡雞及觀察期限后存活雞的臟器組織研磨后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)病毒在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌胃、腺胃組織中均有分布，其中肝臟的病毒載量最多，且可從發(fā)病病死雞臟器重新分離到該病毒。

2.6.3 病理組織檢查 取新鮮死亡雞及觀察期結(jié)束后存活雞的肝臟、腎臟、心臟組織制作病理切片，并進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，攻毒死亡雞肝細(xì)胞變性壞死，見(jiàn)大量炎性細(xì)胞增生灶，同時(shí)可見(jiàn)嗜堿性核內(nèi)包涵體的典型癥狀(圖9A)，腎臟組織淤血出血，腎小球上皮細(xì)胞變性壞死(圖9B)，心肌纖維變性壞死，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞增生浸潤(rùn)(圖9C)；攻毒存活雞肝細(xì)胞變性壞死，大量炎性細(xì)胞增生浸潤(rùn)(圖9G)，腎小管上皮細(xì)胞變性壞死，有大量炎性細(xì)胞增生浸潤(rùn)(圖9H)，心肌纖維變性壞死，出現(xiàn)心外膜炎(圖9I)。

圖8 感染后不同時(shí)間喉頭、泄殖腔排毒情況Fig.8 Virus copies of throat and cloaca at different time post infection

A～C，攻毒死亡雞肝臟、腎臟、心臟；D～F，對(duì)照組雞肝臟、腎臟、心臟；G～I(xiàn)，攻毒存活雞肝臟、腎臟、心臟A-C，Liver,kidney and heart tissue of the chicken that died after challenge;D-F，Liver,kidney and heart tissue of normal chicken;G-I，Liver,kidney,heart of the chicken that survived after challenge圖9 組織病理學(xué)觀察(HE，200×)Fig.9 Histopathological observation (HE，200×)

3 討 論

近年來(lái)，中國(guó)很多地區(qū)的雞群暴發(fā)心包積液綜合征和包涵體肝炎疫情，發(fā)病雞數(shù)量明顯增加，且致病性逐漸增強(qiáng)，分析不同血清型的流行狀況可見(jiàn)FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11一直占據(jù)主導(dǎo)地位[14-15]，不同血清型對(duì)禽類(lèi)的致病作用存在差異，其中感染率最高的血清型為4型和8b型[16-17]。此前，F(xiàn)AdV-11血清型在中國(guó)流行的研究較少報(bào)道，此次江蘇省南通市某雞場(chǎng)疫病的發(fā)生，說(shuō)明在中國(guó)部分地區(qū)還存在FAdV-11血清型的流行。

在臨床中同一種血清型不同F(xiàn)AdV分離株之間致病性、臨床表現(xiàn)往往存在明顯差異[18-19]。本研究中分離到的FAdV-11 JSNT-1 株，以5×105.33EID50的劑量感染10日齡SPF雛雞后能導(dǎo)致10%的死亡率，病死雞剖檢可見(jiàn)肝臟、腎臟均出現(xiàn)明顯病變，組織病理學(xué)結(jié)果證實(shí)為包涵體肝炎，攻毒存活雞雖然臟器不存在肉眼可見(jiàn)病變，但組織病理學(xué)結(jié)果顯示肝臟、腎臟、心臟均存在不同程度的炎癥或細(xì)胞壞死現(xiàn)象。2015年，Zhao等[20]從中國(guó)分離到1株FAdV-11毒株HBQ12，以103.5EID50的劑量感染3周齡雞后能導(dǎo)致8.6%的死亡率，病死雞剖檢可見(jiàn)肝臟變黃、腫脹、有壞死灶；腎臟腫脹、蒼白；肝臟病理組織切片可見(jiàn)嗜堿性核內(nèi)包涵體，表現(xiàn)出明顯的IBH癥狀。2017年，Absalón等[21]從墨西哥地區(qū)健康雞中分離到1株非致病性的FAdV-11毒株MX95，106TCID50劑量感染1日齡雛雞不會(huì)導(dǎo)致死亡，無(wú)明顯的臨床癥狀，剖檢可見(jiàn)肝臟輕微泛黃，組織病理學(xué)結(jié)果顯示存在包涵體肝炎，將FAdV-11毒株HBQ12和MX95的全基因組進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩者之間的核苷酸相似性較高(99.3%)，且突變大多在基因非編碼區(qū)[22]。本研究通過(guò)全基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，JSNT-1株與HBQ12兩者單純感染雞造成的死亡率相似，引起發(fā)病的癥狀相近，提示FAdV-11的國(guó)內(nèi)分離株高度相關(guān)，未發(fā)生明顯變異。

在自然條件下，IBH主要發(fā)生于3～6周齡的雞群，但臨床癥狀一般不明顯，有研究發(fā)現(xiàn)在人工感染情況下，小日齡比大日齡雞更易感，且感染后小日齡雞比大日齡雞病變情況更嚴(yán)重[23]。因此，本研究選擇用10日齡雛雞進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，旨在觀察JSNT-1株的主要病變情況。但為了更加接近自然條件下的感染情況，后續(xù)可進(jìn)一步研究毒株在3～6周齡雞群中的致病情況，進(jìn)一步豐富對(duì)該分離株的認(rèn)識(shí)。

本研究結(jié)果提示Ⅰ群FAdV血清11型與血清4型、血清8b型一樣對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)具有較大威脅，因此，對(duì)FAdV-11的防控也不容忽視，由于FAdV的血清型較多，且沒(méi)有特效藥物治療，主要還是通過(guò)疫苗接種預(yù)防[24-25]，因此，進(jìn)行有效地病原分離鑒定，能進(jìn)一步掌握FAdV的具體分型和生物學(xué)特性，以便盡早使用相對(duì)應(yīng)的疫苗進(jìn)行預(yù)防接種。

4 結(jié) 論

本研究成功分離到1株Ⅰ群FAdV，全基因組及Hexon基因測(cè)序分析表明該分離株為D種，血清型為11型，屬于國(guó)內(nèi)近幾年流行株。本研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了Ⅰ群FAdV流行病學(xué)資料，為FAdV疫病的防控提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)。