羊露露，李安琪，袁 生，黃良宗，黃淑堅，溫 峰，郭錦玥

(佛山科學技術學院生命科學與工程學院，佛山 528231)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的成員，為單鏈環(huán)狀DNA病毒[1]。該病毒無囊膜、呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，直徑為12～23 nm，是目前已知最小的病毒[2]。目前發(fā)現(xiàn)PCV有4種基因型：PCV1、PCV2、PCV3和PCV4[3-4]。PCV1最先在豬腎細胞系中發(fā)現(xiàn)，對豬是無致病性的[5]；PCV2臨床上可引起豬皮炎腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、急性肺水腫(acute pulmonary edema,APE)及斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)等[6-7]；PCV3也可引起PDNS、母豬繁殖障礙和多系統(tǒng)炎癥等臨床癥狀[8-9]；PCV4是2019年從中國湖南幾頭患有嚴重臨床疾病的豬中發(fā)現(xiàn)的，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)疾病、腹瀉和PDNS等[4]，該病毒的致病機理還有待進一步研究。

PCV2于1991年在加拿大首次發(fā)現(xiàn)，在全球有很高的患病率，給養(yǎng)豬業(yè)造成相當大的經(jīng)濟損失[7]。PCV2基因組長度約為1 767 bp，編碼11個開放閱讀框(open reading frame 1～11,ORF1～11)，包含2個主要的開放閱讀框：ORF1和ORF2，ORF1編碼2個與復制相關的蛋白，分別為Rep和Rep′，ORF2編碼Cap蛋白，Cap蛋白是PCV2中唯一含有與病毒中和相關重要免疫表位的結(jié)構(gòu)蛋白[10-11]。根據(jù)全基因組和Cap基因的系統(tǒng)進化樹分型可將PCV2分為8個基因型，即PCV2a～PCV2h[12]，其中PCV2a、PCV2b和PCV2d是目前中國流行株的3種主要基因型[13-14]。由于PCV2基因組易發(fā)生點突變和基因重組現(xiàn)象，因此導致PCV2具有遺傳多樣性，使得PCV2流行株呈現(xiàn)復雜化和多元化現(xiàn)象[15]。

本研究于2020-2021年從廣東省幾個疑似PCV2感染發(fā)病的豬場中檢測到4株PCV2毒株，并與GenBank中公布的PCV2參考毒株進行相似性比對和遺傳進化分析，對了解廣東省近幾年PCV2流行情況及遺傳進化特征具有重要意義，也為PCV2疾病防控及疫苗毒株的選用和研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 4株PCV2廣東分離株GD-1、GD-2、GD-3和GD-4的病料分別來源于2020-2021年廣東省韶關、茂名、佛山、云浮4個地區(qū)，采集臨床癥狀呈現(xiàn)PMWS特征的發(fā)病豬的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 病毒DNA提取試劑盒購自艾瑞科生物科技有限公司；2×TransTaqHiFi PCR SuperMix均購自北京全式金生物技術有限公司；pMD18-T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、DL2000 DNA Marker均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank中公布的PCV2全基因組序列(登錄號：KT719404)，利用Primer Premier 5.0軟件設計1對引物，引物序列為：F：5′-ACCAGCGCACTTCGGCAGCG-3′；R：5′-AATACTTACAGCGCACTTCTTTCG-3′。引物由生工生物(上海)工程股份有限公司合成。

1.2.2 病料DNA提取 取適量肝臟、脾臟、淋巴結(jié)病料，加入適量的PBS后用組織研磨器進行研磨，5 000 r/min離心2 min，取上清液，根據(jù)病毒DNA提取試劑盒說明書提取病毒DNA，選取PCV2檢測為陽性的樣品DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCV2全基因擴增及克隆 PCR反應體系50 μL：2×TransTaqHiFi PCR SuperMix 25 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板4 μL，ddH2O補足體系。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，根據(jù)膠回收試劑盒說明書回收目的片段。回收的目的片段與pMD18-T載體連接，連接體系15 μL：pMD18-T載體0.5 μL，Solution Ⅰ 5 μL，回收產(chǎn)物9.5 μL。4 ℃連接12～16 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，取200 μL菌液均勻涂布在含氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，挑取單克隆菌落接種到含氨芐青霉素的LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)12 h，進行菌液PCR鑒定，將鑒定為陽性的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.4 PCV2全基因核苷酸序列比對與遺傳進化分析 從GenBank中選取不同國家和地區(qū)的不同基因型的PCV2毒株全基因組序列(表1)，利用DNAStar中的MegAlign軟件對本研究的4株PCV2毒株與GenBank中PCV2參考毒株進行核苷酸和氨基酸序列相似性比對；利用Mega 5.0軟件進行遺傳進化分析，采用Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

表1 PCV2參考毒株全基因組序列信息

續(xù)表

1.2.5 PCV2 ORF2氨基酸序列比對及Cap蛋白抗原指數(shù)分析 使用DNAStar中MegAlign軟件將GD-1、GD-2、GD-3和GD-4毒株ORF2基因編碼的氨基酸序列與國內(nèi)外17株參考毒株進行比對，分析氨基酸序列相似性；使用DNAStar中Protean軟件的Anligenicily Jameson-Wolf方法，預測4株PCV2毒株Cap蛋白抗原指數(shù)，并與4株疫苗株(ZJ、SH、LG和DBN-SX07-02)的Cap蛋白抗原指數(shù)進行比對分析。

2 結(jié) 果

2.1 PCV2全基因組擴增結(jié)果

以PCV2陽性病料基因組為模板進行PCV2全基因擴增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約1 770 bp處出現(xiàn)特異性目的條帶(圖1)，與預期結(jié)果相符。膠回收目的條帶，連接到pMD18-T載體后，陽性菌液測序結(jié)果顯示，4株PCV2全基因組序列長度均為1 767 bp。

2.2 PCV2全基因核苷酸序列比對與遺傳進化分析

運用DNAStar和Mega 5.0等生物信息學軟件，將獲得的4株PCV2分離株與國內(nèi)外54株PCV2參考毒株進行核苷酸序列比對及遺傳進化分析，結(jié)果顯示，4株PCV2廣東分離株之間的核苷酸相似性為97.7%～99.1%，與國內(nèi)外54株參考毒株的相似性為91.7%～99.8%，其中與PhuTho/G40312/2018株(Viet Nam，登錄號：LC602996)、QZ1410株(江蘇，登錄號：MG732832)和GXBB1501211株(廣西，登錄號：MH756609)等親緣關系最近；經(jīng)遺傳進化分析顯示，4株分離株均屬于PCV2d基因型(圖2)。

2.3 PCV2 ORF2氨基酸序列比對分析

GD-1、GD-2、GD-3和GD-4的ORF2均編碼233個氨基酸。利用Mega 7.0將4株PCV2分離株Cap蛋白與國內(nèi)外17個參考毒株進行氨基酸序列比對，結(jié)果顯示，4株PCV2分離株Cap蛋白氨基酸序列相似性為97.0%～99.6%；與參考毒株ORF2編碼氨基酸序列的相似性為81.5%～100%(圖3)。對廣東分離株ORF2氨基酸位點分析發(fā)現(xiàn)，部分分離株發(fā)生了氨基酸位點的變化(圖4)。在Cap蛋白B細胞表位區(qū)發(fā)現(xiàn)7個特異性突變位點：Y3C、F8Y、T56S、R116K、V123I、K164E及R169G；在T細胞表位區(qū)發(fā)現(xiàn)1個特異性突變位點：T216A。唯一的1個糖基化位點(143-145位氨基酸處)相對保守，均為NYS。

M，DL2000 DNA Marker；1，陰性對照；2～5，GD-1、GD-2、GD-3、GD-4株全基因組PCR擴增產(chǎn)物M，DL2000 DNA Marker;1，Negative control;2-5，PCR amplification products of whole genome of GD-1，GD-2，GD-3 and GD-4 strains，respectively圖1 PCV2全基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of PCV2 whole gene

2.4 PCV2 Cap蛋白抗原指數(shù)分析

應用Protean軟件中的Anligenicily Jameson-Wolf方法對廣東分離株的Cap蛋白與4株疫苗株進行抗原指數(shù)分析，結(jié)果顯示，廣東分離株的Cap蛋白抗原指數(shù)與4株疫苗株的抗原指數(shù)差異較大，其部分分離株的抗原指數(shù)明顯高于疫苗株，主要集中在C-端，在7-12、47-53、80-90、160-170和205-213位氨基酸處與疫苗株存在差異，與ZJ疫苗株差異較小(圖5)。

圖2 PCV2核苷酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of nucleic acid sequences of PCV2

圖3 PCV2 Cap蛋白氨基酸序列相似性比對Fig.3 Similarity alignment of amino acid sequence of PCV2 Cap protein

圖4 PCV2 Cap蛋白氨基酸序列分析Fig.4 Amino acid sequence analysis of PCV2 Cap protein

圖5 PCV2 Cap蛋白抗原指數(shù)預測Fig.5 Prediction of PCV2 Cap protein antigen index

3 討 論

1998年首次在患PMWS的病豬身上分離出PCV2，其臨床癥狀表現(xiàn)為體重減輕、呼吸困難、肉芽腫性間質(zhì)性肺炎、肝炎和腎炎等[16-17]。PCV2可導致豬的免疫抑制作用，降低免疫力，在臨床中常與其他病毒或細菌混合感染[18]，被稱為最具破壞性的病毒性疾病之一[19]。2000年，PCV2首次在中國被報道[20]，隨后，Liu等[21]綜合整理2015-2019年間已報道的各地區(qū)PCV2流行情況，發(fā)現(xiàn)PCV2總流行率為46.0%，其中東北地區(qū)最高；PCV2流行率最高的是保育豬(50.9%)；集約型農(nóng)場和粗放型農(nóng)場PCV2感染率分別為50.1%和37.5%，這些結(jié)果表明PCV2在中國豬群中有較高的感染率，必須采取有效的防控措施。

PCV2具有較高的基因突變率，從而造成該病毒基因型的多樣性[22]，其中，PCV2a、PCV2b和PCV2d在世界各地均有較高的患病率，并常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒和豬瘟病毒混合感染[23-24]；PCV2c、PCV2e和PCV2f的患病率較低，且被認為無致病性；中國對PCV2g和PCV2h這2種基因型研究甚少[25-26]。21世紀初，PCV2a是臨床感染豬中最流行的基因型，之后發(fā)生了2次基因型轉(zhuǎn)移，即從PCV2a到PCV2b的轉(zhuǎn)移及PCV2b到PCV2d的轉(zhuǎn)移[27]，而PCV2d已成為中國近年來流行的主要基因型[25-28]。本試驗采集2020-2021年廣東省部分地區(qū)臨床癥狀呈現(xiàn)PMWS特征的發(fā)病豬的病變組織，最終分離到4株PCV2，分別來自韶關市(GD-1)、茂名市(GD-2)、佛山市(GD-3)和江門市(GD-4)，通過全基因組遺傳進化分析顯示，4株分離株均為PCV2d型，說明廣東省部分地區(qū)主要流行亞型為PCV2d型，提示廣東省應加強對PCV2d基因型病毒的防控。

PCV2d基因型Cap蛋白序列中含有7個獨特的氨基酸(53I、59K、68N、89L、90T、134N及169R)，這些氨基酸大多沿病毒Cap表面分布。研究發(fā)現(xiàn)，如果表位中有1個氨基酸發(fā)生突變，那么突變后的病毒將不能被表位s抗體識別[29]。對PCV2 ORF2氨基酸分析顯示，4株分離株Cap蛋白氨基酸序列的相似性為97.0%～99.6%；與參考毒株ORF2編碼氨基酸序列的相似性為81.5%～100%。在Cap蛋白B細胞表位區(qū)發(fā)現(xiàn)7個特異性突變(Y3C、F8Y、T56S、R116K、V123I、K164E、R169G)，T細胞表位區(qū)發(fā)現(xiàn)1個特異性突變(T216A)，這些突變位點可能是病毒致病性改變的原因，也可能是目前疫苗免疫效果不佳的原因之一。由于Cap蛋白是PCV2重要的結(jié)構(gòu)蛋白，能刺激機體產(chǎn)生中和抗體，同時也與致病性有關[11]。因此，這些氨基酸的變異是否會造成這4株PCV2d的抗原性和致病力的增強，有待進一步研究。

本研究將分離到的4株PCV2的Cap蛋白與4株疫苗株進行抗原指數(shù)分析，結(jié)果顯示，與SH、LG和DBN-SX07-2疫苗株相比，4株廣東分離株在7-12、47-53、80-90、160-170和205-213位氨基酸處差異較大，可能會影響疫苗對動物的保護效果，而與ZJ疫苗株差異較小。因此，廣東地區(qū)可考慮選用ZJ疫苗株進行接種，免疫效果可能比其他疫苗株更好，從而降低PCV2給養(yǎng)豬業(yè)帶來的經(jīng)濟損失。PCV2在中國養(yǎng)豬業(yè)危害較廣，且具有較高的基因突變率，因此，對PCV2流行情況進行持續(xù)性監(jiān)測變得十分重要。本研究對廣東省部分地區(qū)PCV2全基因進行遺傳進化分析，為廣東省PCV2疾病防控及疫苗毒株的篩選和研發(fā)提供了參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

從廣東省部分地區(qū)分離的4株PCV2均為2d亞型，其Cap蛋白氨基酸序列存在多個突變位點，抗原指數(shù)與疫苗株差異較大，提示廣東省PCV2的流行趨勢逐漸以2d亞型為主。