何獻(xiàn)銘，任廣彩，葉俊賢，蘭 虹，劉郁夫,2，熊 挺，楊澤坤，徐 婷，陳瑞愛,,

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室肇慶分中心，肇慶 526238；3.肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司，肇慶 526238；4.華農(nóng)(肇慶)生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，肇慶 526238)

傳染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的一種急性、高度接觸性免疫抑制疾病,其臨床癥狀表現(xiàn)為畏寒、精神沉郁、采食量減少、飲水增多、排出白色稀糞等；剖解病變表現(xiàn)為腎臟腫大出血、尿酸鹽沉積、呈花斑狀，腺胃與肌胃交界處出血，胸肌和腿肌出血，法氏囊萎縮出血、呈“紫葡萄”樣[1]。長(zhǎng)期免疫選擇壓力的作用導(dǎo)致IBDV變異株和超強(qiáng)毒株(vvIBDV)的出現(xiàn)，使之流行情況越來(lái)越復(fù)雜，防控越來(lái)越困難，造成重大經(jīng)濟(jì)損失[2]。

IBDV屬雙股RNA病毒科禽雙RNA病毒屬,其基因組由A、B 2個(gè)片段組成，編碼VP1、VP2、VP3、VP4和VP5 5種病毒蛋白[3]，其中A片段編碼的VP2蛋白是主要的宿主保護(hù)性抗原，可誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，并具有血清型特異性[4-5]。韓玉婷等[6]研究發(fā)現(xiàn)，IBDV各毒株間的變異主要集中在VP2區(qū)域的第206-350位氨基酸殘基之間，被稱為高變區(qū)(highlyvariableregion,HVR)。血清Ⅰ型IBDV根據(jù)毒力差異分為經(jīng)典株(cIBDV)、超強(qiáng)毒株(vvIBDV)、致弱株(atvIBDV)和變異株(vIBDV)四大類[4]。cIBDV具有富含絲氨酸的七肽區(qū)(SWSASGS)及279D和284A 2個(gè)特征性氨基酸，它們決定了病毒的毒力；vvIBDV在保留cIBDV特征的基礎(chǔ)上具有222A、256I、294I和299S 4個(gè)特征性氨基酸；而弱毒株則缺乏七肽區(qū)，且2個(gè)決定毒力的特征性氨基酸也發(fā)生了變化，即D279N和A284T[7]。本研究以從廣西壯族自治區(qū)某養(yǎng)雞場(chǎng)分離到的IBDV毒株為研究主體，RT-PCR擴(kuò)增分離株的VP2基因序列，并進(jìn)行測(cè)序和流行變異分析，最后再通過SPF雞致病性試驗(yàn)研究該毒株的致病力，以期為IBDV的分子流行病學(xué)研究和臨床防控措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

病料來(lái)源于廣西某養(yǎng)殖場(chǎng)的法氏囊有出血及炎性滲出物等病變的病雞。SPF雞胚和SPF雞均購(gòu)自新興大華農(nóng)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。DF1細(xì)胞(編號(hào)：ATCC?43209TM)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院分子免疫實(shí)驗(yàn)室保存；IBDV標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；4%多聚甲醛組織固定液購(gòu)自Biosharp公司；TRIzol?Reagent(15596-026)購(gòu)自Invitrogen公司；凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；無(wú)水乙醇、氯仿等生物化學(xué)試劑均購(gòu)自浙江寧波萃英化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 病毒分離與鑒定

1.2.1 病料處理 隨機(jī)取法氏囊組織用研缽磨成勻漿后，加入1 mL滅菌生理鹽水制成懸液，-80 ℃反復(fù)凍融3次，離心取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后按100 μL/枚經(jīng)絨毛尿囊膜接種9 d 齡雞胚。

1.2.2 IBDV PCR鑒定及其他外源病原體檢測(cè) 收獲雞胚尿囊液，按照TRIzol?Reagent說(shuō)明書提取病毒RNA，提取的RNA樣品按照PrimeScriptTMRT MasterMix說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 以cDNA為模板PCR鑒定IBDV，同時(shí)進(jìn)行其他外源病原體檢測(cè)，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。檢測(cè)的其他病原體包括DNA病毒傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)和雞傳染性貧血病毒(Chicken anemia virus,CIAV)，RNA病毒傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)、呼腸孤病毒(Reovirus,REOV)和新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)，還有雞滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae,MS)和雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum,MG)。引物序列信息見表1，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 用生理鹽水配制含1.0%瓊脂糖的溶液，加熱溶化后倒入滅菌平皿中，冷卻凝固。用打孔器在平皿上打孔，挑出孔內(nèi)瓊脂，酒精燈加熱封底。以微量移液器吸取IBDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清加入中間孔，外周孔依次加入IBDV陽(yáng)性抗原對(duì)照、PBS陰性對(duì)照及待檢雞胚尿囊液,37 ℃溫箱中放置24 h后觀察結(jié)果。

表1 引物信息

1.3 雞胚傳代培養(yǎng)與雞胚半數(shù)感染量(EID50)測(cè)定

取法氏囊病料研磨液上清按100 μL/枚經(jīng)尿囊腔接種5枚9日齡雞胚，于37 ℃孵育，每12 h照蛋檢查一次，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚。24 h后死亡的雞胚在無(wú)菌條件下剖解，觀察雞胚有無(wú)病變。收集尿囊液，連續(xù)傳代培養(yǎng)。收獲第10代雞胚尿囊液，用生理鹽水將病毒作10倍倍比稀釋,分別接種雞胚,0.1 mL/胚,同時(shí)設(shè)正常對(duì)照,共6組,每組5胚。37 ℃孵育，雞胚死亡后置于4 ℃冰箱過夜,收集尿囊液進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，同時(shí)觀察雞胚病變情況，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算分離病毒的EID50。

1.4 DF-1細(xì)胞的適應(yīng)培養(yǎng)與細(xì)胞半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID50)的測(cè)定

將收獲的第10代雞胚尿囊液感染DF1細(xì)胞，觀察72 h，若無(wú)明顯細(xì)胞病變，則將細(xì)胞培養(yǎng)物-80 ℃反復(fù)凍融3次后，繼續(xù)盲傳。若出現(xiàn)細(xì)胞病變，則取DF-1細(xì)胞匯合度達(dá)60%且均勻貼壁的96孔板，按10-1至10-10倍比稀釋病毒液，逐列加入96孔板中，并設(shè)置2列正常細(xì)胞作為對(duì)照，逐日觀察5～7 d并記錄結(jié)果，按Reed-Muench法計(jì)算分離病毒的TCID50。

1.5 分離株VP2基因序列測(cè)定與分析

取1.2.2獲得的分離株VP2基因的PCR產(chǎn)物，采用凝膠回收試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物純化。純化后產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。采用MegAlign軟件比對(duì)序列相似性。應(yīng)用Mega 7.0軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建該分離株與其他參考毒株的VP2基因的遺傳進(jìn)化樹，Bootstrap值重復(fù)1 000次。

1.6 SPF雞致病性試驗(yàn)

1.6.1 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將20只8日齡SPF雞隨機(jī)分為2組:對(duì)照組和感染組，每組10只。感染組經(jīng)點(diǎn)眼、滴鼻途徑接種IBDV第10代雞胚尿囊液，0.5 mL/只，對(duì)照組以同樣途徑接種等量生理鹽水，隔離飼養(yǎng)。 定期觀察2周，記錄發(fā)病、死亡情況和剖檢變化，并從發(fā)病雞的組織器官中進(jìn)行病毒分離。

1.6.2 法氏囊指數(shù)測(cè)定 對(duì)攻毒感染2周后未死亡的SPF雞進(jìn)行集體剖殺，并稱量體重和法氏囊重量。囊重比=(法氏囊重/體重)×1 000。囊指數(shù)(BBIX)=試驗(yàn)組雞囊重比/空白對(duì)照組雞囊重比,當(dāng)BBIX<0.7時(shí)，判為法氏囊萎縮；當(dāng)BBIX>0.7時(shí)，判為法氏囊正常。采集各病變的組織器官包括法氏囊、胸腺、肝臟、腎臟，固定于4%多聚甲醛中，制備成石蠟切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理組織學(xué)變化，并采集圖片。

1.6.3 法氏囊病毒拷貝數(shù)測(cè)定 將40只8日齡 SPF 雞隨機(jī)分為2組：對(duì)照組和感染組，每組20只。攻毒方法同1.6.1。攻毒后分別在感染后1、5、8、14 d，每組隨機(jī)剖殺5只，快速采集法氏囊，置于-80 ℃保存。按照1.2.1方法對(duì)法氏囊進(jìn)行處理后，提取RNA、反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。參照何秀苗等[8]方法對(duì)法氏囊中IBDV拷貝數(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)。構(gòu)建VP2基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD18T-VP2，引物序列為：qPCR-VP2-F:5′-ACCGGCACCGACAACCT-TA-3′；qPCR-VP2-R:5′-CCCTGCCTGACCACC-ACTT-3′，建立基于IBDV-VP2基因的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié) 果

2.1 IBDV PCR鑒定結(jié)果及外源病原體檢測(cè)

雞胚尿囊液經(jīng)PCR/RT-PCR 檢測(cè)顯示,可擴(kuò)增出大小為714 bp的IBDV 特異性目的條帶，且經(jīng)檢測(cè)ILTV、CIAV、IBV、AIV、REV、REOV、NDV、MS和MG均為陰性(圖1)。

M，Trans2K DNA Marker;1，IBDV；2，A型AIV；3，H5亞型AIV；4，H9亞型AIV；5，IBV (740 bp)；6，IBV(290 bp)；7，NDV；8，REOV；9，REV；10，MS；11，MG；12，CIAV；13，ILTVM，Trans2K DNA Marker;1，IBDV；2，Avian influenza A virus；3，H5 subtype AIV；4，H9 subtype AIV；5，IBV (740 bp)；6，IBV (290 bp)；7，NDV；8，REOV；9，REV；10，MS；11，MG；12，CIAV；13，ILTV圖1 病原體PCR/RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR/RT-PCR results of pathogens

2.2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果顯示，IBDV抗原陽(yáng)性對(duì)照、分離株感染雞胚的尿囊液與抗IBDV陽(yáng)性血清之間均形成一條明顯的白色沉淀線，PBS陰性對(duì)照與IBDV陽(yáng)性血清之間無(wú)沉淀線(圖2)。

2.3 雞胚傳代培養(yǎng)與EID50測(cè)定

雞胚接種病毒濾液上清，盲傳3～4代后，可在48～36 h后致死雞胚，死胚的尿囊膜增厚，膜上出現(xiàn)白色斑點(diǎn)，雞胚出現(xiàn)出血、水腫、發(fā)育停滯；尤其頭部和四肢末端出血嚴(yán)重，肝臟發(fā)黃、出現(xiàn)多處出血，有針尖狀壞死。表明通過SPF雞胚成功分離到1株IBDV毒株，命名為GX20210126。收獲第10代尿囊液，測(cè)得雞胚EID50為10-3.8/0.1 mL。

2.4 DF1細(xì)胞病變與TCID50測(cè)定

以第10代雞胚尿囊液感染DF1細(xì)胞，24 h內(nèi)即發(fā)生病變， 細(xì)胞圓縮、脫落、間隙變寬(圖3)， 同時(shí)測(cè)得病毒的TCID50為10-3.5/0.1 mL。

1,陽(yáng)性對(duì)照；2，陰性對(duì)照；3、4，F(xiàn)10代雞胚尿囊液；5，IBDV陽(yáng)性血清1,Positive control;2,Negative control;3 and 4,F10 generation chicken embryo allantoic fluid;5,IBDV positive serum圖2 病毒分離株瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Agar diffusion test results of virus isolate

A，對(duì)照組；B，試驗(yàn)組A,Control group;B,Experimental group圖3 感染IBDV后DF1細(xì)胞病變情況(100×)Fig.3 Cytopathic effect of DF1 cells after infection with IBDV (100×)

2.5 分離株VP2基因核苷酸和氨基酸序列測(cè)定及比對(duì)分析

2.5.1VP2基因核苷酸序列測(cè)定及比對(duì)分析 對(duì)分離株GX20210126的VP2基因進(jìn)行序列測(cè)定，獲得了其核苷酸序列(1 450 bp)。將獲得的序列與國(guó)內(nèi)外IBDV參考毒株進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，相似性均在81.2%～98.8%之間。 GX20210126分離株與標(biāo)準(zhǔn)超強(qiáng)毒株UK661的相似性最高，為98.8%；與變異毒株、弱毒株的相似性則較低。根據(jù)GX20210126分離毒株序列分析可知，其含有SpeⅠ、TaqⅠ和SspⅠ位點(diǎn)，但無(wú)BstNⅠ、StyⅠ和SacⅠ位點(diǎn)，初步判斷其含有IBDV強(qiáng)毒株特征，而非弱毒株和經(jīng)典毒株。

2.5.2VP2基因推導(dǎo)的氨基酸序列及比對(duì)分析 根據(jù)測(cè)定的GX20210126株VP2基因核苷酸序列推導(dǎo)出其氨基酸序列并與參考毒株序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相似性均在86.8%～99.6%之間，GX20210126株與HK46、GX、OKYM、UK661、SD10LY01和HuB-1等標(biāo)準(zhǔn)超強(qiáng)毒株的相似性最高，為99.6%(圖4)。

GX20210126分離毒株有七肽區(qū)。其vVP2內(nèi)毒力相關(guān)位點(diǎn)的特征性氨基酸為222A、249Q、254G、256I、284A、294I、299S，符合vvIBDV的特征；而279N符合弱毒株特征。D279N與近年來(lái)國(guó)內(nèi)IBDV毒株氨基酸位點(diǎn)進(jìn)化趨勢(shì)相一致，且符合廣西IBDV進(jìn)化地域特點(diǎn)。GX20210126分離株的VP2高變區(qū)特征氨基酸位點(diǎn)具體信息見表2。

2.5.3 遺傳進(jìn)化樹分析 將GX20210126株與其他IBDV毒株VP2氨基酸序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，GX20210126株偏向于vvIBDV毒株分支，與超強(qiáng)毒株親緣關(guān)系最近，屬于超強(qiáng)毒株進(jìn)化譜系(圖5)。

圖4 GX20210126分離毒株與參考毒株VP2氨基酸序列相似性比對(duì)Fig.4 Similarity alignment of VP2 amino acid sequence between GX20210126 isolate and reference strains

表2 vVP2特征氨基酸位點(diǎn)

圖5 基于IBDV VP2氨基酸序列的遺傳進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on IBDV VP2 amino acid sequence

2.6 SPF雞致病性試驗(yàn)

2.6.1 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將第10代雞胚尿囊液以點(diǎn)眼滴鼻的途徑接種8日齡SPF雞，雞群出現(xiàn)羽毛蓬松、精神萎靡、食欲減退或廢絕、拉白綠色水樣糞便等表觀癥狀。觀察2周后，未發(fā)現(xiàn)雞死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)雞的法氏囊萎縮，腎臟尿酸鹽沉積，肝臟出血，胸肌和腿肌有片狀出血或出血點(diǎn)。

2.6.2 法氏囊指數(shù)測(cè)定 由表3可知，BBIX為0.244。攻毒組雞法氏囊嚴(yán)重萎縮，部分法氏囊有出血，成膠狀樣與對(duì)照組結(jié)果相比差異極顯著，且可從發(fā)病雞法氏囊中重新分離到IBDV。

2.6.3 病理組織學(xué)檢查 感染組SPF雞的法氏囊、胸腺、肝臟、腎臟出現(xiàn)了明顯的病理變化。法氏囊濾泡萎縮變小，皮質(zhì)變薄，皮髓質(zhì)淋巴細(xì)胞大量減少，濾泡間質(zhì)結(jié)締組織增生，伴少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖6A′)；胸腺皮質(zhì)含大量小淋巴細(xì)胞，髓質(zhì)小范圍見出血，髓質(zhì)還見較多淋巴細(xì)胞損傷，核固縮深染(圖6B′)；肝臟血管及小葉內(nèi)可見多處炎性細(xì)胞灶性浸潤(rùn)(圖6C′)；腎臟可見局部腎小管間質(zhì)較多炎性細(xì)胞灶性浸潤(rùn)，較多腎小管上皮損傷，上皮細(xì)胞排列疏松，胞核固縮深染，胞漿嗜酸性增強(qiáng)(圖6D′)。 對(duì)照組SPF雞法氏囊、胸腺、肝臟、腎臟的組織結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，未見明顯病理變化(圖6A～6D)。

2.6.4 法氏囊病毒拷貝數(shù)測(cè)定結(jié)果 由圖7可知，法氏囊中IBDV拷貝數(shù)在感染后第5天達(dá)到最高，為34 911拷貝/μL。

表3 IBDV攻毒后囊重比測(cè)定結(jié)果

A～D，分別為對(duì)照組的法氏囊、胸腺、肝臟和腎臟；A′～D′，分別為感染組的法氏囊、胸腺、肝臟和腎臟A-D,Bursa,thymus,liver and kidney of control group，respectively;A′-D′,Bursa,thymus,liver and kidney of infection group，respectively圖6 SPF雞感染GX20210126株后的病理變化(HE，200×)Fig.6 Pathological changes of SPF chickens infected with GX20210126 strain (HE，200×)

圖7 法氏囊中IBDV拷貝數(shù)變化Fig.7 Change of IBDV copy number in bursa

3 討 論

本研究對(duì)IBDV流行毒株進(jìn)行分離鑒定、VP2基因序列分析及SPF雞致病性試驗(yàn)。VP2基因核苷酸序列分析顯示本研究分離株GX20210126與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)超強(qiáng)毒株UK661高度相似，核苷酸序列相似性為98.8%。目前，對(duì)于IBDV的關(guān)鍵毒力特征尚無(wú)明確定論。前人研究表明，IBDV經(jīng)典毒株含BstNⅠ位點(diǎn)(CCWGG)和StyⅠ位點(diǎn)(CCWWGG)，弱毒株無(wú)SpeⅠ位點(diǎn)(ACTAGT)，強(qiáng)毒株含有TaqⅠ位點(diǎn)(TCGA)和SspⅠ位點(diǎn)(AATATT)[9-10]。本研究分離株GX20210126株含有SspⅠ和TaqⅠ酶切位點(diǎn)，且不具有經(jīng)典毒株、弱毒株特征性酶切位點(diǎn)。一般認(rèn)為IBDV的293-294位氨基酸突變具有分型意義，可根據(jù)SspⅠ(AATATT、NI)、SacⅠ (GAGCTC、EL)酶切位點(diǎn)來(lái)鑒定是否為vvIBDV。Juneja等[11]認(rèn)同此觀點(diǎn)，但Banda等[12]則不認(rèn)同，因?yàn)橛幸恍┰谂R床上并不表現(xiàn)超強(qiáng)毒株癥狀的毒株卻含有SspⅠ酶切位點(diǎn)。因此，GX20210126株是否屬于超強(qiáng)毒株還需進(jìn)一步證實(shí)。

VP2氨基酸序列分析顯示，GX20210126株與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)超強(qiáng)毒株UK661親緣關(guān)系較近，氨基酸較相似性為99.6%。本試驗(yàn)測(cè)得的GX20210126株氨基酸序列具備了vvIBDV VP2高變區(qū)中的以下幾個(gè)特征：①GX20210126株高變區(qū)內(nèi)2個(gè)大親水區(qū)的氨基酸序列未發(fā)生改變，說(shuō)明抗原性未發(fā)生變異。②GX20210126株249、253、254、256、284位氨基酸位點(diǎn)分別為Q、 Q、 G、 I、 A， 均符合超強(qiáng)毒株的特征，這些氨基酸位點(diǎn)聯(lián)合作用影響病毒毒力[13]。③GX20210126株222、294和299位氨基酸位點(diǎn)分別為A、I和S，這3個(gè)氨基酸可使得超強(qiáng)毒株的親和性發(fā)生變化，從而導(dǎo)致毒力大大增強(qiáng)[14-15]。祁小樂等[16]研究也表明，VP2的222位氨基酸對(duì)體外復(fù)制效率有影響。 ④GX20210126株具有七肽區(qū)(326-332位氨基酸殘基)保守的326SWSASGS332序列，七肽區(qū)是否保守對(duì)毒力強(qiáng)弱的影響尚存爭(zhēng)議。⑤沈巍巍等[2]研究表明，廣西梧州地區(qū)氨基酸近年來(lái)的變化具有地域特點(diǎn)，如D279N和R338H，GX20210126株符合這個(gè)變化趨勢(shì)。⑥GX20210126株與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)超強(qiáng)毒株UK661的VP2序列比對(duì)，僅有2處氨基酸位點(diǎn)發(fā)生改變，即D279N、I272T。其中D279N的變化位點(diǎn)位于小親水區(qū)(mh)，且被普遍認(rèn)為與毒株毒力及細(xì)胞適應(yīng)性有關(guān)[17-19]，但其多與253、284等位點(diǎn)聯(lián)合作用[20-21]，單獨(dú)位點(diǎn)的改變是否影響毒株特性仍有待進(jìn)一步研究。I272T引起的生物學(xué)意義尚不清楚，需進(jìn)一步探討。

除此之外，本研究的毒力試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)了GX20210126株能使雞群發(fā)生明顯的感染癥狀和病變，法氏囊嚴(yán)重萎縮，發(fā)病率為100%，但未發(fā)生雞死亡。其原因可能是病毒滴度較低(TCID50為10-3.5)，272、279位氨基酸的改變，或B片段對(duì)IBDV毒力的影響，或其他原因造成的。綜上所述，在VP2基因的核苷酸和氨基酸水平，該分離株的分子特征均偏向?yàn)槌瑥?qiáng)毒株，但毒株毒力和發(fā)病模型建立仍需更多詳細(xì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。

近年來(lái)，IBD免疫失敗的現(xiàn)象不斷增多，除了疫苗運(yùn)輸保存不當(dāng)、疫苗接種不規(guī)范、免疫程序不合理等人為因素之外[22-23]，IBDV變異和毒力增強(qiáng)可能是免疫無(wú)效的原因之一[24]。

4 結(jié) 論

本研究分離到的IBDV GX20210126株顯示超強(qiáng)毒株的VP2基因序列特征，不屬于經(jīng)典毒株和變異株，與歐洲標(biāo)準(zhǔn)超強(qiáng)毒株UK661相似性最高，核苷酸序列相似性為98.8%，氨基酸序列相似性為99.6%，僅有D279N、I272T 2處氨基酸位點(diǎn)發(fā)生改變，這些位點(diǎn)的改變可能影響病毒毒力和細(xì)胞適應(yīng)性，與中國(guó)IBDV毒株進(jìn)化有關(guān)。