方錢海，陳洪波，畢延震

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物胚胎工程與分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；2.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，湖北省家畜種業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，武漢 430023)

長(zhǎng)期以來(lái)，畜禽優(yōu)良性狀的調(diào)控機(jī)制一直是遺傳育種領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)。隨著基因組學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)、基因分型技術(shù)和基因編輯技術(shù)等的廣泛應(yīng)用，以及豬全基因組測(cè)序及單倍型計(jì)劃的實(shí)施和完成，極大地推動(dòng)了豬重大育種價(jià)值基因的鑒定[1-2]。作者就與豬肉質(zhì)、抗病及繁殖性狀相關(guān)的基因和挖掘技術(shù)進(jìn)行綜述，并對(duì)這些具有重大育種價(jià)值基因的利用提出相關(guān)建議和思考，供讀者參考。

1 豬重大育種價(jià)值基因

1.1 肉質(zhì)性狀相關(guān)基因

豬肉作為世界上最大的肉類消費(fèi)品類，其產(chǎn)量及品質(zhì)是豬育種工作中的關(guān)鍵指標(biāo)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，高密度SNP芯片、基因分型、豬的全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association studies，GWAS)等多種技術(shù)得以快速發(fā)展和應(yīng)用，通過(guò)對(duì)豬重要經(jīng)濟(jì)性狀的分析發(fā)現(xiàn)了大量與豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的基因，其不同的基因型或表達(dá)量能夠直接或間接影響豬背膘厚、肌內(nèi)脂肪含量及眼肌面積等重要的豬肉質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.1.1 胰島素樣生長(zhǎng)因子 胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factors，IGFs)家族成員IGF1和IGF2主要在肝臟中表達(dá)合成，對(duì)肌肉細(xì)胞的生長(zhǎng)分化具有重要的影響，且IGF2能夠影響豬的肌纖維面積、肌內(nèi)脂肪含量和背膘厚等肉質(zhì)相關(guān)的重要性狀[3-6]。IGF1和IGF2活化后與其相關(guān)受體如IGF-IR結(jié)合使Shc或IRS-1磷酸化，Shc可以磷酸化Sos蛋白，并在多種蛋白的參與下激活Ras-Raf-MEKs通路，IRS-1通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)刺激細(xì)胞分裂或通過(guò)PI-3K激活A(yù)kt通路，進(jìn)而在mTOR和p70S6K作用下刺激蛋白質(zhì)合成，且通過(guò)磷酸化叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FKHR)抑制其介導(dǎo)的對(duì)編碼刺激肌肉分解代謝相關(guān)蛋白的刺激作用，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成和肌肉細(xì)胞的分化[3,7-9]，對(duì)肌肉質(zhì)量平衡的維持具有重要的影響。研究發(fā)現(xiàn)，IGF2基因A3072G位點(diǎn)的突變能夠顯著影響波蘭豬腰肉重量(WL)、火腿重量(WH)、胴體肉百分比(CP)等，還會(huì)影響其平均日增重(ADG)和采食量(DF)，且該位點(diǎn)的突變能夠影響鋅指蛋白6(ZBED6)與其的結(jié)合，消除二者間的相互作用，影響豬肌肉的發(fā)育[10-11]。

1.1.2 肌肉生長(zhǎng)抑制素 肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin，MSTN)，又稱生長(zhǎng)分化因子8(growth and differentiation factor 8，GDF-8)，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族的重要成員。作為肌細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控基因，MSTN能夠抑制骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育，并影響動(dòng)物脂肪沉積，是導(dǎo)致動(dòng)物“雙肌”表型的關(guān)鍵因素[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，MSTN能夠通過(guò)阻斷AMPK/mTOR通路、抑制miR-128的表達(dá)，進(jìn)而抑制其靶向的PPARγ/NF-κB信號(hào)通路，共同參與心肌調(diào)節(jié)[14]；還能夠通過(guò)SMAD2/SMAD3調(diào)節(jié)TET1的活性，進(jìn)而影響肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分化[15]。通過(guò)激活SMAD4，MSTN能夠增強(qiáng)miR124-3p的表達(dá)，抑制糖皮質(zhì)激素受體，從而抑制3T3-L1細(xì)胞的脂肪分化[16]。但是其如何調(diào)節(jié)脂肪生成的分子機(jī)制仍存在爭(zhēng)議，最近研究表明，MSTN通過(guò)SMAD2/SMAD3調(diào)節(jié)Jmjd3的表達(dá)影響肌細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化[17]；MSTN能夠影響與豬脂肪酸代謝相關(guān)基因MEF2C和SCD5的表達(dá)，并通過(guò)MEF2C/miR222/SCD5級(jí)聯(lián)信號(hào)影響脂肪酸去飽和，從而調(diào)節(jié)脂肪沉積[18]。

1.1.3 長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶 長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶(Acyl-CoA synthetase，ACSL)參與脂肪酸代謝過(guò)程，將其活化以進(jìn)入包括脂肪酸β-氧化在內(nèi)的各種代謝途徑。在已知的5種ACSL基因亞型中，ACSL1基因在不同豬的肝臟、背最長(zhǎng)肌和背部脂肪中均存在豐富的多態(tài)性，且其表達(dá)量及多態(tài)性在脂肪型與瘦肉型豬間存在顯著差異[19]。ACSL1基因上游調(diào)控區(qū)c.-33 A>G位點(diǎn)不同基因型對(duì)二花臉豬活體背膘厚具有顯著影響，證明ACSL1基因可以影響二花臉豬的皮下脂肪沉積[20]。ACSL3基因與肌內(nèi)脂肪含量存在顯著的相關(guān)性，且下調(diào)ACSL3基因mRNA的表達(dá)量會(huì)減少肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中甘油三酯的合成[21]。ACSL4基因與脂肪沉積、背膘厚和火腿重量等存在顯著相關(guān)[22]，且敲低ACSL4基因會(huì)減少豬脂肪細(xì)胞中脂滴的積累[23]。

1.1.4 肥胖基因 肥胖基因(obsese，OB)表達(dá)產(chǎn)物為瘦素(leptin，LEP)蛋白，LEP是脂肪細(xì)胞響應(yīng)體重或能量變化而分泌的蛋白類激素，與嚙齒動(dòng)物的攝食量有關(guān)[24]。研究發(fā)現(xiàn)，MC4基因能夠影響動(dòng)物體的脂肪儲(chǔ)量，而LEP能夠通過(guò)控制MC4受體的分泌量來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)物體的體重[25]；在肥胖型豬3個(gè)脂肪區(qū)域中LEP轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平顯著上調(diào)[26]；在槐豬、杜洛克豬、江香豬的脂肪組織中LEP基因在背部脂肪、腹部皮下脂肪和板油中具有高表達(dá)量，過(guò)表達(dá)OB基因后，脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，如GPAM、ACACA、NPY等轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)，而DGAT、LPL、PPARγ等基因均極顯著下調(diào)，其中PPARγ基因能增加高脂血癥大鼠肝臟中甘油三酯的濃度[27-28]；在LEP過(guò)表達(dá)的豬皮下脂肪組織中SCAP、SREPB1、PPARγ、PLIN2基因的表達(dá)發(fā)生顯著下調(diào)，且其前脂肪細(xì)胞脂滴數(shù)量和甘油三酯含量也顯著降低[29]。

1.1.5 解偶聯(lián)蛋白 解偶聯(lián)蛋白(uncoupling protein，UCP)基因編碼的解偶聯(lián)蛋白家族位于線粒體內(nèi)膜，包括6個(gè)成員。Zheng等[30]利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的非同源重組技術(shù)將外源UCP1基因定點(diǎn)敲入豬后發(fā)現(xiàn)，UCP1基因在豬白色脂肪組織中特異表達(dá)，能夠減少脂肪沉積、增加瘦肉率、提高豬的抗寒能力。UCP2基因在豬背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量及肉品質(zhì)呈極顯著相關(guān)[31]。UCP3主要在骨骼肌和脂肪中表達(dá)，參與機(jī)體產(chǎn)熱、能量和脂質(zhì)代謝、脂肪酸氧化、脂肪沉積等，與豬背膘厚呈顯著相關(guān)[32]。與UCP2不同，UCP3基因表達(dá)量的提高有利于肌內(nèi)脂肪沉積[33]，但與豬眼肌面積呈極顯著負(fù)相關(guān)[34]。

1.1.6 其他相關(guān)基因 目前，與肉品質(zhì)相關(guān)的研究報(bào)道已有很多，且通過(guò)對(duì)不同豬種的脂肪組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析已經(jīng)得到了大量的數(shù)據(jù)，其中一些基因?qū)ζは轮窘M織發(fā)育、背膘厚、脂肪沉積、肌內(nèi)脂肪含量等具有顯著影響，如PPARγ作為一種核激素受體和轉(zhuǎn)錄因子被證明在調(diào)節(jié)脂肪組織發(fā)育中起著重要作用，其啟動(dòng)子活性與瘦肉型和肥胖型2個(gè)品種豬皮下脂肪組織的發(fā)育有關(guān)[35]。生肌決定因子(MyoD)家族成員Myf5和MyoD1基因的多態(tài)性與豬背最長(zhǎng)肌中的脂肪含量、水分含量及pH等顯著相關(guān)[36]。作為構(gòu)成骨骼肌和心肌主要結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，肌球蛋白重鏈(MYH)亞型MYH3基因與豬背最長(zhǎng)肌和肌內(nèi)脂肪含量具有極顯著相關(guān)，且能夠顯著影響豬成纖維細(xì)胞肌內(nèi)脂肪含量[37]。在對(duì)妊娠后期豬肌肉發(fā)育的全基因組交互分析中發(fā)現(xiàn)，MYH3與IGF2以及DLK1/MEG3基因間都存在顯著關(guān)聯(lián)，并參與肌肉發(fā)育[38]。Tao等[39]通過(guò)對(duì)7個(gè)中國(guó)地方豬種(包括藏豬、榮昌豬、成化豬等)和約克夏豬的脂肪和肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析得到了大量與豬經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的候選基因，包括LEP、SERINC5、CCDC88B、NUDT22、SCPEP1、KIF3C、WZSP016177、FAM151B和LBH等。Pokluhar等[40]通過(guò)比較松遼黑豬和長(zhǎng)白豬的生產(chǎn)與肉質(zhì)性狀(包括脂肪和肌肉生長(zhǎng))間的差異，共檢測(cè)到877個(gè)差異表達(dá)基因，包括LCN2、CES3、DGKB、OLR1、PGM1、PCK1、ACACB、FADS1、FADS2、MOGAT2、SREBF1，以及已知的對(duì)脂肪性狀有顯著影響的LEP和PPARGC1B等，并鑒定出1 071個(gè)具有相關(guān)性的lncRNAs，其中85個(gè)lncRNAs被差異表達(dá)，包括53個(gè)上調(diào)和32個(gè)下調(diào)。研究證實(shí)，miRNA和lncRNA參與機(jī)體的脂類代謝和脂肪生成通路[41-42]，二者可通過(guò)互作影響肌肉發(fā)育，如linc-MD1可分別與miR-135及miR-133特異性結(jié)合，進(jìn)而保證這二者的靶基因，即肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C(MEF2C)及決定因子樣蛋白1(MAML1)的表達(dá)[43]。

1.2 抗病相關(guān)基因

非洲豬瘟的暴發(fā)，使養(yǎng)豬業(yè)遭受到了嚴(yán)重的打擊，對(duì)豬抗病相關(guān)的研究再次成為了熱點(diǎn)，而在豬養(yǎng)殖過(guò)程中不僅存在非洲豬瘟病毒(ASFV)的影響，還有很多其他病原體如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PPRSV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬三角冠狀病毒(PDCoV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)等高致病率病毒與致死率的細(xì)菌(如豬鏈球菌(SS)、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)、豬副嗜血桿菌(GPS)等)同樣影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前，已找到了很多與豬抗病相關(guān)的基因，參與病原體的感染或在感染過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

1.2.1CD163基因 CD163是位于單核巨噬細(xì)胞表面的一類富含半胱氨酸重復(fù)序列的跨膜蛋白，在細(xì)胞外具有9個(gè)清道夫受體半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域(SRCR)[44]。CD163作為巨噬細(xì)胞表面受體能夠與多種細(xì)菌的菌毛或細(xì)胞壁的脂多糖結(jié)合，研究發(fā)現(xiàn)，CD163與硫酸肝素(HS)和唾液酸黏蛋白(Sn)相似，均能夠作為豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)表面的受體參與PPRSV對(duì)機(jī)體的侵襲作用，且越來(lái)越多的研究證實(shí)CD163是PPRSV感染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵受體，其SRCR5結(jié)構(gòu)域作為病毒識(shí)別的核心結(jié)構(gòu)域與PPRSV的感染直接相關(guān)[45]，敲除SRCR5 LBP區(qū)域可得到對(duì)PRRSV基因型2具有完全抗性的豬[46]。據(jù)報(bào)道，將CD163 SRCR5結(jié)構(gòu)域替換為人CD163的SRCR8結(jié)構(gòu)域后，基因編輯豬獲得了PRRSV基因型1的抗性[47]。綜上所述，CD163的缺失能夠賦予豬對(duì)PRRSV的完全抵抗能力。

1.2.2 豬氨肽酶N 氨肽酶N(APN，又稱為CD13)是一種胞外酶，豬氨肽酶N(pAPN)通過(guò)其N-末端與膜結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)新生仔豬致死率可達(dá)100%的TGEV在豬中會(huì)引起嚴(yán)重的腸炎、嘔吐和水樣腹瀉等癥狀，其感染機(jī)制即通過(guò)其糖蛋白(S蛋白)與宿主細(xì)胞表面受體pAPN結(jié)合而進(jìn)入宿主[48]。敲除豬pAPN基因后能夠極大地降低TGEV的感染[49]。在易感細(xì)胞IPI-2I中，pAPN的缺失能夠完全阻止TGEV的感染，且pAPN還參與了腸道致病性PDCoV的感染過(guò)程，PDCoV的可溶性S1蛋白同TGEV-S1一樣能夠與表達(dá)pAPN的目標(biāo)豬細(xì)胞系表面發(fā)生有效結(jié)合，而通過(guò)可溶性的pAPN預(yù)處理能夠阻斷這種結(jié)合作用，且在非易感的細(xì)胞表面外源表達(dá)pAPN后賦予了PDCoV-S1的結(jié)合及PDCoV進(jìn)入細(xì)胞的易感性[50]。除此之外，pAPN還對(duì)PEDV的增殖具有促進(jìn)作用[51]。

1.2.3FUT1基因FUT1基因最初是在研究引起仔豬腹瀉的病原體中一個(gè)最主要的致病菌——產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)F18受體基因座的候選基因中分離得到的，是一種含有α(1,2)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的黏?；?，該基因能夠促進(jìn)2種產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC和VTEC)通過(guò)菌毛發(fā)揮作用[52]。Wang等[53]對(duì)中西方豬的FUT1基因進(jìn)行PCR-RFLP分析發(fā)現(xiàn)，相比西方豬品種，中國(guó)地方豬品種缺乏對(duì)ECF18細(xì)菌產(chǎn)生抗性的基因型，且在自然感染PRRSV和副豬嗜血桿菌后，中國(guó)地方豬發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)更高。在歐洲野豬FUT1基因型中，法國(guó)野豬中的抗性等位基因僅以非常低的頻率出現(xiàn)，該豬種也具有更高易感性[54]。 此外，F(xiàn)UT1不同基因型在維持豬腸道穩(wěn)態(tài)中也具有一定的作用[55]。

1.2.4 豬白細(xì)胞抗原 白細(xì)胞抗原(SLA)是主要組織相容性復(fù)合體(MHC)在豬中的另一種名稱，具有3種基因型，SLA-Ⅰ在不同品種豬間存在顯著的遺傳差異，而這種高度遺傳多態(tài)性正是豬對(duì)傳染性疾病、疫苗和移植后的免疫反應(yīng)最重要的因素之一[56]。研究發(fā)現(xiàn)，豬SLA-Ⅰ類分子的表達(dá)與豬偽狂犬病病毒(PRV)感染引起的豬偽狂犬病(PR)有關(guān)，PRV可利用其pUS3及pUL56等蛋白通過(guò)溶酶體途徑下調(diào)PK-15細(xì)胞中SLA-Ⅰ類分子重鏈(HC)的表達(dá)而產(chǎn)生免疫逃逸，進(jìn)而導(dǎo)致PRV的持續(xù)性感染且難以被根除，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害[57]。Yang等[58]利用PCR-SSCP對(duì)290頭中國(guó)煙臺(tái)黑豬仔豬進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SLA-Ⅱ 2條鏈上的主要基因DQA和DRA外顯子2的多態(tài)性與仔豬腹瀉之間存在顯著相關(guān)。在SLA-Ⅱ的基因簇中，SLA-DOB主要參與抗原遞呈，并在PRV感染豬宿主細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，且SLA-DOB突變體和單倍型顯著影響妊娠母豬的IgG和PRRSV特異性抗體水平[59]。SLA-Ⅲ位于靠近著絲粒區(qū)域，目前關(guān)于其在豬免疫力等方面的研究報(bào)道較少。

1.2.5 其他關(guān)鍵基因 除上述各大類基因外，還有很多基因與豬的各種疾病間存在重要的聯(lián)系。劉晨曦等[60]對(duì)引起仔豬腹瀉的致病菌研究發(fā)現(xiàn)，除FUT1基因外，MUC基因也可作為ETEC F4受體參與感染作用。ARFGAP1是COP Ⅰ系統(tǒng)相關(guān)蛋白的一員，COP Ⅰ的相關(guān)蛋白GBF1和ARF1參與了經(jīng)典豬瘟病毒(CSFV)感染后在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，且CSFV NS5A可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)，而ARFGAP1作為一種NS5A結(jié)合蛋白能夠抑制CSFV NS5A誘導(dǎo)的ERS，表明其在介導(dǎo)CSFV感染細(xì)胞造成的細(xì)胞損傷中起重要作用[61-62]。研究表明，作為一種小型Rab GTPase的Rab18是CSFV RNA復(fù)制和病毒粒子組裝所需的新型宿主因子，主要通過(guò)與病毒蛋白NS5A相互作用發(fā)揮其功能[63]。除各種通路相關(guān)的蛋白之外，細(xì)胞內(nèi)的各種炎癥反應(yīng)因子如白細(xì)胞介素(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10)、干擾素(IFN-α、IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF-α)等也在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，IL-10介導(dǎo)的免疫抑制被認(rèn)為可能在豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)感染和斷奶后多系統(tǒng)消耗綜合征(PMWS)的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[64]。

1.3 繁殖性狀相關(guān)基因

豬的繁殖性狀包括很多，如產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、窩重及初產(chǎn)仔數(shù)、經(jīng)產(chǎn)仔數(shù)等，目前已篩選到許多與豬繁殖性狀相關(guān)的重要基因。

1.3.1 雌激素受體 雌激素受體(estrogen receptor，ESR)介導(dǎo)雌激素影響相關(guān)基因表達(dá)，從而調(diào)控哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)和繁殖機(jī)能。1996年，Rothschild等[65]首次提出ESR基因座的特定等位基因與窩產(chǎn)仔數(shù)增加有關(guān)，這也是首次發(fā)現(xiàn)的與豬產(chǎn)仔數(shù)密切相關(guān)的有效基因。研究發(fā)現(xiàn)，清平豬與大白豬雜交的F1和F2代黑豬群體ESR基因AB基因型個(gè)體的妊娠期更短[66]；嘉興黑豬ESR2基因外顯子1的A221G位點(diǎn)與總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、死胎數(shù)等顯著相關(guān)[67]；但在二花臉豬[68]、蘇淮豬[69]、環(huán)江香豬等其他地方豬種中并未發(fā)現(xiàn)這種關(guān)聯(lián)性[70]。

1.3.2 血清視黃醇結(jié)合蛋白 血清視黃醇結(jié)合蛋白(retinol-binding proteins，RBP)主要指RBP4，它是目前已證實(shí)的唯一一類可在血液中轉(zhuǎn)運(yùn)維生素A的蛋白，可以維持子宮內(nèi)環(huán)境、調(diào)節(jié)卵泡和胚胎發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，RBP4基因不同基因型能夠顯著影響豬總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)[71]，這與Tang等[72]利用EigenGWAS和Fst技術(shù)對(duì)3個(gè)典型商業(yè)豬品種(杜洛克豬、長(zhǎng)白豬和約克夏豬)的測(cè)序數(shù)據(jù)相一致。王萬(wàn)興等[73]采用PCR-HRM分析與PCR產(chǎn)物直接測(cè)序相結(jié)合的方法分析發(fā)現(xiàn)，RBP4基因G45A位點(diǎn)能夠顯著影響松遼黑豬產(chǎn)仔數(shù)。劉乙等[74]利用PCR-RFLP技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，RBP4基因顯著影響大白豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、健仔數(shù)及窩重性狀。但目前關(guān)于RBP4的研究仍相對(duì)較少，已知的功能作用即通過(guò)在體內(nèi)協(xié)助維生素A轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)而影響豬繁殖性能、胚胎生長(zhǎng)發(fā)育和肉品質(zhì)性狀[75]。

1.3.3 骨橋蛋白 骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種磷酸化的糖蛋白。羅仍卓么等[76]對(duì)長(zhǎng)白豬、大白豬和北京黑豬OPN基因多態(tài)性及其與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，OPN基因表現(xiàn)出AA、AB和BB 3種基因型，在長(zhǎng)白豬中初產(chǎn)母豬AA基因型和經(jīng)產(chǎn)母豬AB基因型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)顯著高于AA、BB基因型；在大白豬中這種優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在BB和AB基因型個(gè)體中，且A和B等位基因分別為長(zhǎng)白豬和大白豬的優(yōu)勢(shì)等位基因，這與馬力鵬等[77]研究結(jié)果相同，這種單等位基因的優(yōu)勢(shì)同樣分別體現(xiàn)在皮特蘭豬和杜洛克豬中，但是這種現(xiàn)象在北京黑豬中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，其基因型全部為BB基因型，而在具有高繁殖力的小梅山豬中卻只有AA和AB 2種基因型，且AA基因型占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[78]。OPN基因在公豬生殖細(xì)胞各階段的表達(dá)量不同可能直接影響公豬受精力[79]。

1.3.4 催乳素受體 催乳素受體(prolactin receptor，PRLR)作為靶細(xì)胞上的受體傳遞催乳素(prolactin，PRL)信號(hào)，促進(jìn)動(dòng)物乳腺和性腺的發(fā)育。張淑君等[80]研究發(fā)現(xiàn)，PRLR基因與母豬窩產(chǎn)仔數(shù)有關(guān)，不同基因型能夠顯著影響大白豬、長(zhǎng)白豬、梅山豬的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)，其AA基因型個(gè)體的生殖器官相比BB基因型更大，且產(chǎn)仔數(shù)也顯著高于BB基因型。劉慶雨等[81]對(duì)中國(guó)地方豬種PRLR基因多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，AA基因型個(gè)體頭胎產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均顯著高于AB基因型，在松遼黑豬和長(zhǎng)白豬中也發(fā)現(xiàn)AA基因型個(gè)體的斷奶仔豬數(shù)、乳頭數(shù)均顯著高于AB和BB基因型；在初產(chǎn)松遼黑豬中AA基因型個(gè)體總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)及其他性狀也具有顯著優(yōu)勢(shì)。這種基因優(yōu)勢(shì)同樣表現(xiàn)在圩豬、定遠(yuǎn)豬和保山豬中[82]，而在大白豬和長(zhǎng)白豬中的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锽，且大白豬BB基因型個(gè)體總產(chǎn)仔數(shù)顯著高于AA基因型，長(zhǎng)白豬BB基因型個(gè)體斷奶仔豬窩重顯著高于AB基因型[83]。

1.3.5 其他關(guān)鍵基因 目前，促卵泡素β亞基(FSHβ)基因、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族主要成員之一的GDF9、BMP家族中骨形成蛋白(BMP7、BMP15)及其受體BMPR1B等均被發(fā)現(xiàn)在豬的繁殖性能中發(fā)揮著重要的作用，極大地影響著豬的生產(chǎn)效率[84]。除此之外，還有許多基因也被發(fā)現(xiàn)對(duì)豬的繁殖性能有著顯著影響，如NCOA1、FUT1基因與豬總產(chǎn)仔數(shù)、總活仔數(shù)、健仔數(shù)和初生窩重等顯著相關(guān)，且NCOA1和FUT1基因合并基因型中AAAA基因型經(jīng)產(chǎn)母豬的繁殖性狀顯著優(yōu)于AAAG和AAGG基因型[85-86]；定位在豬7號(hào)染色體上的視黃酸X受體β(RXRB)基因不僅與大白豬活體背膘厚、眼肌面積及初生重等性狀呈極顯著或顯著相關(guān)，還與繁殖性狀如乳頭數(shù)間存在極顯著相關(guān)[87]；作為核受體5A亞家族(又稱FTZ-F1家族)成員之一，NR5A2基因多態(tài)性與松遼黑豬繁殖性狀(總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)及斷奶仔豬數(shù)等)相關(guān)[88]；與齲齒發(fā)育相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶-20(MMP20)、Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子DKK(Dickkopf)蛋白家族成員之一的DKK2、促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞配體A1(ephrin A1)等也可能與豬繁殖性狀相關(guān)，仍有待進(jìn)一步研究。

2 育種價(jià)值基因挖掘技術(shù)

2.1 數(shù)量性狀定位

豬的肉質(zhì)、抗病和繁殖性狀等幾種重要的經(jīng)濟(jì)性狀均為數(shù)量性狀，且重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)主效基因的尋找需先進(jìn)行數(shù)量性狀定位(QTL)。QTL往往是與遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建同時(shí)進(jìn)行的，主要方法有候選基因途徑、基因組掃描法、比較基因組學(xué)及分子遺傳標(biāo)記[89]。候選基因途徑主要是通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行研究，以確定其中的關(guān)鍵因子?；蚪M掃描法主要是利用研究物種已有的遺傳連鎖圖譜對(duì)其染色體進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記，再通過(guò)全基因組掃描獲得其QTL進(jìn)而得到與其表型相關(guān)的重要等位基因位點(diǎn)[90]。比較基因組學(xué)是基于基因組圖譜和測(cè)序結(jié)果對(duì)基因及基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，進(jìn)而得到差異基因并了解相關(guān)基因功能。分子標(biāo)記在以上眾多方法中均有應(yīng)用，如對(duì)候選基因進(jìn)行篩選、利用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行基因組掃描及對(duì)特定基因進(jìn)行遺傳標(biāo)記等。

2.2 分子標(biāo)記技術(shù)與全基因組選擇

在人類基因組計(jì)劃及豬基因組計(jì)劃的推動(dòng)下，分子標(biāo)記技術(shù)在實(shí)際研究中得以快速發(fā)展與廣泛應(yīng)用，按檢測(cè)手段不同可分為4類：①基于分子雜交基礎(chǔ)的分子標(biāo)記(如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)、原位雜交(ISH)技術(shù))；②基于簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)或短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的分子標(biāo)記；③基于PCR技術(shù)(如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)及插入/缺失多態(tài)性(InDel)檢測(cè))；④基于單核苷酸多態(tài)性(SNP)的分子標(biāo)記[91]。近年來(lái)，基于SNP的分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用較為普遍，特別是隨著新一代DNA測(cè)序技術(shù)及DNA芯片技術(shù)的發(fā)展，SNP檢測(cè)技術(shù)也得到了進(jìn)一步的完善，現(xiàn)已大量用于畜禽遺傳育種研究，如將高通量測(cè)序獲取的高密度SNP遺傳標(biāo)記應(yīng)用于構(gòu)建動(dòng)物遺傳圖譜、將SNP用于具有復(fù)雜遺傳機(jī)制的數(shù)量性狀的標(biāo)記輔助選擇，以及利用GWAS鑒定具有復(fù)雜性狀的主效基因[92]。這種利用覆蓋整個(gè)基因組的高密度SNP計(jì)算個(gè)體的基因組估計(jì)育種值(GEBV)的全基因組選擇法(GS)也成為了動(dòng)物育種中的熱門技術(shù)，其比常規(guī)育種的準(zhǔn)確性更高，且這種方法已為很多公司和機(jī)構(gòu)所采用，如DanBred、TOPIGS、PIC及國(guó)內(nèi)的溫氏集團(tuán)等。也有研究利用引物競(jìng)爭(zhēng)性PCR與高分辨熔解曲線(HRM)分析相結(jié)合的基因分型方法鑒定動(dòng)物模型中的點(diǎn)突變，進(jìn)而對(duì)疾病病理機(jī)制相關(guān)的候選基因進(jìn)行篩選[93]，以及HRM結(jié)合實(shí)時(shí)熒光PCR法(HRM-qRT PCR)對(duì)致病菌進(jìn)行檢測(cè)分析[94]。在前述研究中即涉及到了眾多相關(guān)的技術(shù)，如GWAS、PCR-HRM、PCR-RFLP、PCR-SSCP等。

2.3 基因編輯技術(shù)

在生命科學(xué)鄰域廣泛應(yīng)用的基因編輯技術(shù)也隨著人們對(duì)解釋生命現(xiàn)象研究的逐漸深入得到了不斷地發(fā)展，特別是進(jìn)入21世紀(jì)后，從鋅指核酸酶(ZFN)技術(shù)到轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)技術(shù)，再到現(xiàn)在剛獲得諾貝爾獎(jiǎng)的成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)技術(shù)，使得基因編輯技術(shù)的運(yùn)用越來(lái)越簡(jiǎn)便，應(yīng)用范圍也越來(lái)越廣泛，除了對(duì)已知的基因進(jìn)行編輯以獲得其編碼功能與作用外，在重要性狀但功能未知基因的篩選上也有了很多的應(yīng)用[95]。其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)以其構(gòu)建突變體文庫(kù)速度快，針對(duì)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)脫穎而出，在基因組水平上的突變體及關(guān)鍵基因上的篩選得到了廣泛的應(yīng)用[96]。Wei等[97]通過(guò)全基因組CRISPR/Cas9文庫(kù)篩選，確定了絲氨酸合成途徑(SSP)中的第一個(gè)定型酶(磷酸甘油酸脫氫酶(PHGDH))是晚期肝細(xì)胞癌(HCC)標(biāo)準(zhǔn)治療方法索拉菲尼(sorafenib)耐藥性的關(guān)鍵因素，為肝癌的晚期治療提供了新的方向，以及將基于CRISPR/Cas9技術(shù)的基因篩查手段用于識(shí)別對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要的功能缺失突變基因等在疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用[98]。在豬上，孫慧敏[99]利用基于CRISPR/Cas9技術(shù)的篩選平臺(tái)對(duì)CSFV侵入機(jī)制中的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行篩選，成功得到了12個(gè)候選基因，且該平臺(tái)還可以用于其他病毒的入侵機(jī)制關(guān)鍵作用蛋白及編碼基因的篩選。

2.4 功能基因組篩選

隨著基因組學(xué)的發(fā)展，各種測(cè)序技術(shù)也得到了快速的發(fā)展與應(yīng)用，利用前期通過(guò)各種測(cè)序技術(shù)得到的大量基因組數(shù)據(jù)，研究人員開始對(duì)基因型和表型之間的關(guān)系進(jìn)行大量研究，而其中最關(guān)鍵的是在基因組規(guī)模上進(jìn)行分析[100]。目前已獲得了大量通過(guò)系統(tǒng)性功能喪失進(jìn)行全基因組正向篩選所需的遺傳信息，且CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)現(xiàn)及其作為全基因組篩選工具的成功應(yīng)用為全基因組功能喪失研究提供了方法[101-102]。在后基因組或功能基因組時(shí)代，利用這種功能喪失后給予各種條件處理，如利用病毒或細(xì)菌感染、改變生存環(huán)境、施加藥物等，進(jìn)而識(shí)別得到突出的具有某些抗性或敏感性的基因，這種功能基因組篩選可以突出某些基因?qū)ο嚓P(guān)表型的影響，且能夠解決細(xì)胞通路、疾病狀態(tài)和藥物靶標(biāo)識(shí)別等的復(fù)雜性[103]。特別是將多種基因組進(jìn)行聯(lián)合分析，能夠更加深入全面地分析數(shù)千個(gè)與復(fù)雜性狀相關(guān)的基因位點(diǎn)，促進(jìn)對(duì)復(fù)雜性狀的理解[104]。這在動(dòng)植物中都有了較多的應(yīng)用，如將BSA和RNA-Seq技術(shù)結(jié)合，整合DNA和RNA組學(xué)成功縮小了候選基因的篩選范圍，并高效鎖定了目標(biāo)基因[105]；將基因組與轉(zhuǎn)錄組即多組學(xué)結(jié)合進(jìn)行分析，揭示了與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)的性狀的潛在遺傳性，且提供了精準(zhǔn)治療的新靶點(diǎn)[106]；為了解決同一個(gè)體不同時(shí)間的差異變化問(wèn)題將轉(zhuǎn)錄組、代謝組、脂質(zhì)組、免疫細(xì)胞組及腸道微生物組進(jìn)行結(jié)合檢測(cè)分析，得到更為全面深入的數(shù)據(jù)[107]。在豬中，也有將代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)綜合分析以尋找其飼料效率的生物學(xué)途徑[108]。而隨著測(cè)序數(shù)據(jù)的不斷豐富，越來(lái)越多新的基因組數(shù)據(jù)被發(fā)現(xiàn)，單一參考基因組已經(jīng)無(wú)法滿足科學(xué)研究對(duì)某一物種進(jìn)行全面分析的要求，繼而泛基因組——一個(gè)物種中所有的DNA序列的集合也得到了發(fā)展[109-110]。隨著畜牧業(yè)的發(fā)展及對(duì)豬產(chǎn)業(yè)的重視，或許這些技術(shù)將會(huì)在豬的肉質(zhì)、繁殖、抗病等優(yōu)勢(shì)性狀及其關(guān)聯(lián)的價(jià)值基因的功能作用研究中得到更多的應(yīng)用。

3 展 望

在對(duì)上述重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因總結(jié)時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)前多基因聯(lián)合研究成為了許多學(xué)者關(guān)注的方向，如Xu等[110]通過(guò)對(duì)PRRSV和TGEV 2種高致病率病毒的已知受體進(jìn)行雙基因敲除(DKO)，成功獲得對(duì)2種病毒均具有完全抗性的DKO豬，同時(shí)降低了另一種高致病性病毒PDCoV的易感性；李濤等[86]將NCOA1和FUT1的合并基因型與經(jīng)產(chǎn)母豬的繁殖性狀進(jìn)行分析，這種將育種價(jià)值基因聯(lián)合分析的方法可以充分利用它們之間的協(xié)同作用進(jìn)而提高育種效率，且這種多基因聯(lián)合分析的思路可能會(huì)在今后研究中得到廣泛的應(yīng)用與發(fā)展。目前，人們對(duì)于豬重要性狀相關(guān)基因的研究從未間斷，作者通過(guò)系統(tǒng)總結(jié)豬肉質(zhì)、抗病及繁殖性狀相關(guān)的重要育種價(jià)值基因及其挖掘技術(shù)，以期為豬的遺傳改良提供指導(dǎo)性建議，以及為養(yǎng)豬業(yè)提高經(jīng)濟(jì)效益和遺傳選育研究提供參考。