梁家充，呂春榮，洪瓊花，吳國權(quán)，權(quán)國波

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224)

精液冷凍保存技術(shù)大大提高了人工授精技術(shù)的效率，充分發(fā)揮了優(yōu)秀種公畜的繁殖潛能，大大加快了畜禽品種改良進(jìn)程。此外，精液冷凍保存對(duì)于優(yōu)秀畜禽種質(zhì)資源保護(hù)具有非常重要的意義[1-3]。哺乳動(dòng)物精子對(duì)冷凍損傷非常敏感，冷凍過程中，由冰晶形成引起的物理性損傷、化學(xué)毒性以及氧化損傷等直接破壞精子的結(jié)構(gòu)功能和抗氧化能力，導(dǎo)致精子受精能力下降，并可能影響胚胎質(zhì)量[4]。

云南半細(xì)毛羊是中國自主培育的第一個(gè)粗檔半細(xì)毛羊新品種，填補(bǔ)了中國無粗檔半細(xì)毛羊新品種的空白。開展精液冷凍保存研究對(duì)于其種質(zhì)資源保護(hù)和加快育種改良速度具有重要意義。然而，對(duì)于綿羊精子冷凍損傷機(jī)制和低溫生物學(xué)特性研究方面仍滯后于其他家畜，如牛、豬等。目前，影響哺乳動(dòng)物凍精存活能力的遺傳機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。精子細(xì)胞中RNA表達(dá)譜變化可能與精子冷凍損傷存在一定關(guān)聯(lián)，這也成為目前精子冷凍保存研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。有研究發(fā)現(xiàn)，外界環(huán)境應(yīng)激可以引起成熟精子轉(zhuǎn)錄組發(fā)生變化[5]。而且，mRNA表達(dá)水平與精子生育力具有一定相關(guān)性。當(dāng)前，公牛精子和人精子的轉(zhuǎn)錄組分析已經(jīng)應(yīng)用于精子質(zhì)量的評(píng)判[6]。Ashish等[7]研究表明，微球蛋白(B2M)、溶質(zhì)載體家族2成員5(GLUT5)、蘋果酸脫氫酶1(MDH1)和三磷酸腺苷酶質(zhì)膜Ca2+運(yùn)輸4(ATP2B4)等基因的表達(dá)水平在水牛凍融精子中變化顯著。Kasimanickam等[8]研究發(fā)現(xiàn)，精子尾部的外層致密纖維(ODF2)和亮氨酸脫羧酶1(LDC1)的表達(dá)水平在高生育力荷斯坦牛精子比低生育力個(gè)體高2倍，而且，金屬肽酶抑制劑(TIMP)、磷脂酶Cζ1(PLCz1)、腺苷酸激酶1(AK1)、小核核糖核蛋白多肽N 2(SNRPN2)和整合蛋白β5(IB5)表達(dá)水平在荷斯坦牛凍融精子中的表達(dá)量較高。Arangasamy等[9]證明荷斯坦牛精子的含伴侶蛋白的T-復(fù)合蛋白1和亞單位8(CCT8)表達(dá)水平與受胎率呈顯著負(fù)相關(guān)，而磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白1(PEBP1)和富含胱氨酸的分泌蛋白2(CRISP2)表達(dá)水平與受胎率呈正相關(guān)。此外，CDC28蛋白激酶調(diào)節(jié)亞單位2(CKS2)、真核翻譯延伸因子1γ(EEF1G)、真核翻譯起始因子1 (EIF1)、G2期/S期應(yīng)答相關(guān)蛋白1抗體(GTSE1)和魚精蛋白1(PRM1)的全長mRNA轉(zhuǎn)錄物可能被用來作為評(píng)價(jià)新鮮精子和冷凍精子功能的潛在標(biāo)記物[10]。

本研究以云南半細(xì)毛羊作為研究對(duì)象，使用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，對(duì)其精子冷凍前后mRNA差異表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究，從而為綿羊精子冷凍損傷機(jī)制研究和冷凍保存技術(shù)體系優(yōu)化提供必要的理論基礎(chǔ)和分子標(biāo)記物。

1 材料與方法

1.1 稀釋液

本試驗(yàn)所使用的精液基礎(chǔ)稀釋液主要成分包括：224.0 mmol/L Tris、66.6 mmol/L檸檬酸、55.5 mmol/L葡萄糖，均購自Sigma公司。冷凍稀釋液配方為在基礎(chǔ)稀釋液中添加10%新鮮蛋黃、5%甘油、100 000 IU青霉素和100 000 IU鏈霉素。冷凍稀釋液用Tris調(diào)整pH至7.0。將冷凍稀釋液于15 000×g下離心1 h，取上清用0.45 μm的一次性濾器過濾，最后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

RNA濃度檢測試劑盒(Qubit?3.0 Flurometer)購自賽默飛世爾科技公司；RNA樣品片段分布檢測試劑盒(Agilent 2100 High Sensitivity DNA Assay Kit)購自美國安捷倫科技有限公司。電刺激采精儀(EJ6CCGS)購自北京倍特雙科技有限公司；0.45 μm一次性過濾器購自密理博公司；0.25 mL塑料細(xì)管購自IMV卡蘇科技股份有限公司。

1.3 精液采集和處理

采用電刺激采精儀采集3只成年、健康云南半細(xì)毛羊公羊精液。采集后10 min內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。采集的精液質(zhì)量應(yīng)該滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：精液量0.75～2 mL，最低精子密度2×109/mL，精子活力在75%以上。將3份新鮮精液樣本各分成2份，一份直接用于RNA提取處理，分別編號(hào)為F1、F2和F3；另一份進(jìn)行冷凍保存，分別編號(hào)為T1、T2和T3。精液冷凍保存的處理方法：在精液中緩慢加入同溫度的冷凍稀釋液，將精子密度稀釋至2×108/mL，將稀釋后的精液分裝于0.25 mL塑料細(xì)管，然后以0.01 ℃/min的速度緩慢降溫至5 ℃，并于該溫度下平衡3 h，然后將冷凍細(xì)管于液氮蒸汽中預(yù)凍10 min，最后直接將冷凍細(xì)管投入液氮中保存7 d。解凍時(shí)，將冷凍細(xì)管投入37 ℃水浴中30 s,解凍后分別提取RNA。

1.4 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序及文庫構(gòu)建

為了純化精子細(xì)胞，根據(jù)Gandini等[11]描述的方法，通過Percoll密度梯度離心法去除精漿、未成熟生殖細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及相關(guān)的冷凍保護(hù)劑成分。最后將獲得的細(xì)胞沉淀保存于-80 ℃。

使用第二代RNA轉(zhuǎn)錄本5′-端的轉(zhuǎn)換機(jī)制(Smart-Seq2)方法直接進(jìn)行擴(kuò)增[12]，得到雙鏈cDNA產(chǎn)物。使用RNA濃度檢測試劑盒和RNA樣品片段分布檢測試劑盒，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。然后以cDNA作為起始原料進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫用Hiseq2500測序儀進(jìn)行測序。

1.5 測序數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

測序所得原始下機(jī)序列(Raw reads)，通過去除低質(zhì)量序列、去除接頭污染等過程完成數(shù)據(jù)處理，得到可用于后續(xù)分析的高質(zhì)量序列(Clean reads)。 后續(xù)所有分析都是基于Clean reads。 本研究采用DE Seq進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，并選取差異率(|log2Ratio|≥1)和P<0.05的基因作為差異表達(dá)基因。使用GO數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋；使用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行信號(hào)通路分析。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序及基因區(qū)域分布

使用Illumina Hiseq2500高通量測序技術(shù)對(duì)6個(gè)云南半細(xì)毛羊精子樣本的cDNA文庫測序，共獲得623 399 754條原始測序序列(表1)。對(duì)原始序列進(jìn)行處理過濾得到514 313 802條高質(zhì)量的Clean reads，為原始數(shù)據(jù)量的82.50%。 將獲得的測序序列與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，共有401 795 877條(78.00%)的Reads可以與參考基因組匹配，112 517 925條(22.00%)的Reads與參考基因組不能匹配。 在匹配的Reads中，有349 923 779條(87.09%)的Reads是唯一匹配序列；有8 361 907條(2.08%)的Reads是匹配多個(gè)位置序列；有43 510 191條(10.83%)的Reads是錯(cuò)配序列(圖1)。唯一匹配序列中，有7 610 278條(2.17%)外顯子(圖2)。

表1 測序數(shù)據(jù)分析

圖1 比對(duì)序列分布Fig.1 Alignment sequence distribution

圖2 唯一比對(duì)序列在參考基因組區(qū)域分布統(tǒng)計(jì)Fig.2 Distribution statistics of unique alignment sequences in reference genome region

2.2 差異表達(dá)基因分析

新鮮組和冷凍組精子之間差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)為1 213個(gè)，其中冷凍精子上調(diào)基因5個(gè)，分別為：25線粒體運(yùn)載家族A48(SLC25A48)、心臟病相關(guān)轉(zhuǎn)錄本2(HEAT-2)、 136序列相似的家族成員A(FAM136A)、初級(jí)纖毛形成(PIFO)和3-羥基丁酸脫氫酶1(BDH1)；

下調(diào)基因1 208個(gè)，其中基因表達(dá)量差異最大的10個(gè)基因分別為：C-C基序趨化因子3(LOC101114535)、微球蛋白(B2M)、原癌基因AP-1轉(zhuǎn)錄因子亞單位(FOS)、生長停滯和DNA損傷誘導(dǎo)β(GADD45B)、亞精胺/亞精胺N1乙酰轉(zhuǎn)移酶1(SAT1)、Ⅰ類組織相容性抗原(MHCⅠ)、熱休克蛋白90α家族A類成員1(HSP90AA1)、羥基羧酸受體2(HCAR2)、纖溶酶原激活劑(PLAU)和ATP酶H+轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白1(ATP6AP1)。

2.3 差異表達(dá)基因的GO功能注釋

對(duì)2個(gè)處理組差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋分析，包括生物過程(biological processes,BP)、細(xì)胞組分(cellular components,CC)及分子功能(molecular functions,MF)3 大類。結(jié)果表明，冷凍前后差異表達(dá)基因中共有1 156個(gè)基因得到GO功能注釋，共涉及56個(gè)分類(圖3)。在3種GO分類中，分別富集22、17和17種生物功能。在生物過程分類中，763個(gè)基因參與細(xì)胞過程(cellular process)，709個(gè)基因參與生物調(diào)節(jié)(biological regulation)，647個(gè)基因參與單生物過程(single-organism process)，528個(gè)基因參與代謝過程(metabolic process)，375個(gè)基因參與應(yīng)激反應(yīng)(response to stimulus)，另外，分別有53和2個(gè)基因參與與精子相關(guān)的生殖過程(reproductive process)和生殖(reproduction)。在細(xì)胞組分分類中，1 018個(gè)基因來源于細(xì)胞部分(cell part)，661個(gè)基因分布于細(xì)胞器(organelle)，479個(gè)基因來源于細(xì)胞器部分(organelle part)，453個(gè)基因分布于質(zhì)膜(membrane)，432個(gè)基因參與質(zhì)膜部分(membrane part)。在分子功能分類中，696個(gè)基因參與結(jié)合(binding)，366個(gè)基因參與催化(catalytic)，106個(gè)基因參與分子傳感器(molecular transducer)，96個(gè)基因參與分子功能調(diào)控(molecular function regulator)，80個(gè)基因參與酶調(diào)控(enzyme regulator)。另外，11個(gè)基因參與包括精子冷凍損傷相關(guān)的氧化還原反應(yīng)。

①1～22，生物學(xué)過程；23～39，細(xì)胞組分；40～56，分子功能。②1，細(xì)胞過程；2，生物調(diào)節(jié)；3，單組織過程；4，代謝過程；5，應(yīng)激反應(yīng)；6，定位；7，細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生；8，發(fā)育過程；9，免疫系統(tǒng)過程；10，多細(xì)胞組織過程；11，多組織過程；12，生物黏附；13，運(yùn)輸；14，生殖過程；15，節(jié)律性過程；16，行為；17，信號(hào)；18，生長；19，細(xì)胞殺傷；20，激素分泌；21，生殖；22，生物相；23，細(xì)胞部分；24，細(xì)胞器；25，細(xì)胞器部分；26，膜；27，膜部分；28，大分子復(fù)合物；29，胞外區(qū)部分；30，細(xì)胞連接；31，胞外區(qū)；32，膜包腔；33，突觸部分；34，突觸；35，細(xì)胞外基質(zhì)；36，細(xì)胞；37，類核；38，病毒粒子部分；39，細(xì)胞外基質(zhì)部分；40，結(jié)合；41，催化；42，分子傳感器；43，分子功能調(diào)控；44，酶調(diào)控；45，轉(zhuǎn)運(yùn)體；46，核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子；47，蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子；48，結(jié)構(gòu)分子；49，鳥苷酸交換因子；50，氧化還原反應(yīng)；51，電子載體；52，化學(xué)引誘劑；53，通道調(diào)控；54，翻譯調(diào)控；55，受體調(diào)控；56，蛋白質(zhì)標(biāo)簽①1-22，Biological process;23-39，Cellular component;40-56，Molecular function.②1，Cellular process;2，Biological regulation;3，Single-organism process;4，Metabolic process;5，Response to stimulus;6，Localization;7，Cellular component organization or biogenesis;8，Developmental process;9，Immune system process;10，Multicellular organismal process;11，Multi-organism process;12，Biological adhesion;13，Locomotion;14，Reproductive process;15，Rhythmic process;16，Behavior;17，Signaling;18，Growth;19，Cell killing;20，Hormone secretion;21，Reproduction；22，Biological phase;23，Cell part;24，Organelle;25，Organelle part;26，Membrane;27，Membrane part;28，Macromolecular complex;29，Extracellular region part;30，Cell junction;31，Extracellular region;32，Membrane-enclosed lumen;33，Synapse part;34，Synapse;35，Extracellular matrix;36，Cell;37，Nucleoid;38，Virion part;39，Extracellular matrix part;40，Binding;41，Catalytic;42，Molecular transducer;43，Molecular function regulator;44，Enzyme regulator;45，Transporter;46，Nucleic acid binding transcription factor;47，Protein binding transcription factor;48，Structural molecule;49，Guanyl-nucleotide exchange factor;50，Antioxidant;51，Electron carrier;52，Chemoattractant;53，Channel regulator;54，Translation regulator;55，Receptor regulator;56，Protein tag圖3 差異表達(dá)基因GO功能注釋結(jié)果Fig.3 Go function annotation results of differentially expressed genes

2.4 差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果表明，差異表達(dá)基因富集于273個(gè)通路，其中，40個(gè)通路顯著富集(圖4)。與疾病相關(guān)有18個(gè)通路，與生物系統(tǒng)相關(guān)有12個(gè)通路，與細(xì)胞過程相關(guān)有5個(gè)通路，與環(huán)境信息處理相關(guān)有5個(gè)通路。

①1～18，疾病；19～30，生物系統(tǒng)；31～35，細(xì)胞過程；36～40，環(huán)境信息處理。②1，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；2，甲型流感；3，肺結(jié)核；4，沙門氏菌感染；5，麻疹；6，丙型肝炎；7，利什曼??；8，EB病毒感染；9，乙型肝炎；10，單純胞疹病毒感染；11，恰加斯病(美國錐蟲病)；12，軍團(tuán)菌?。?3，弓形蟲病；14，百日咳；15，炎癥性腸病；16，病毒致癌；17，HTLV-I感染；18，細(xì)菌侵入上皮細(xì)胞；19，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用；20，Toll受體信號(hào)通路；21，NF-κB信號(hào)通路；22，NOD樣受體信號(hào)通路；23，RIG-I樣受體信號(hào)通路；24，B細(xì)胞受體信號(hào)通路；25，T細(xì)胞受體信號(hào)通路；26，HIF-1信號(hào)通路；27，Jak-STAT信號(hào)通路；28，脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路；29，MAPK信號(hào)通路；30，胞漿DNA感應(yīng)途徑；31，破骨細(xì)胞分化；32，吞噬體；33，細(xì)胞凋亡；34，溶酶體；35，自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性；36，腫瘤壞死因子信號(hào)通路；37，趨化因子信號(hào)通路；38，集合管酸分泌；39，神經(jīng)營養(yǎng)素信號(hào)通路；40，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工①1-18，Diseases;19-30，Organismal systems;31-35，Cellular processes;36-40，Environmental information processing.②1，Rheumatoid arthritis;2，Influenza A;3，Tuberculosis;4，Salmonella infection;5，Measles;6，Hepatitis C;7，Leishmaniasis;8，Epstein-barr virus infection;9，Hepatitis B;10，Herpes simplex infection;11，Chagas disease (American trypanosomiasis);12，Legionellosis;13，Toxoplasmosis;14，Pertussis;15，Inflammatory bowel disease (IBD);16，Viral carcinogenesis;17，HTLV-I infection;8，Bacterial invasion of epithelial cells;19，Cytokine-cytokine receptor interaction;20，Toll-like receptor signaling pathway;21，NF-kappa B signaling pathway;22，NOD-like receptor signaling pathway;23，RIG-I-like receptor signaling pathway;24，B cell receptor signaling pathway;25，T cell receptor signaling pathway;26，HIF-1 signaling pathway;27，Jak-STAT signaling pathway;28，Adipocytokine signaling pathway;29，MAPK signaling pathway;30，Cytosolic DNA-sensing pathway;31，Osteoclast differentiation;32，Phagosome;33，Apoptosis;34，Lysosome;35，Natural killer cell mediated cytotoxicity;36，TNF signaling pathway;37，Chemokine signaling pathway;38，Collecting duct acid secretion;39，Neurotrophin signaling pathway;40，Protein processing in endoplasmic reticulum圖4 差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析Fig.4 Analysis of KEGG pathway enrichment of differentially expressed genes

3 討 論

相對(duì)于其他家畜而言，綿羊精子質(zhì)膜不飽和脂肪酸含量相對(duì)較高，這直接導(dǎo)致其對(duì)冷凍損傷高度敏感。冷凍-解凍過程可對(duì)精子結(jié)構(gòu)功能造成廣泛的損傷，包括質(zhì)膜流動(dòng)性降低、質(zhì)膜完整性喪失、膜蛋白功能受損、精子抗氧化活性降低、氧化應(yīng)激和活性氧水平升高、DNA損傷、線粒體損傷、磷脂酰絲氨酸分布改變等[13-16]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，精子自身攜帶的RNA在精子發(fā)生、運(yùn)動(dòng)、獲能、受精和早期胚胎發(fā)育等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[17]。目前，關(guān)于綿羊精子轉(zhuǎn)錄組分析的報(bào)道較少。為了研究冷凍-解凍過程對(duì)綿羊精子mRNA表達(dá)模式的影響，本研究采用高通量測序技術(shù)對(duì)綿羊新鮮精子和冷凍精子進(jìn)行系統(tǒng)的mRNA表達(dá)譜分析，共獲得了1 213個(gè)顯著差異表達(dá)基因。由于成熟精子細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄功能處于靜止?fàn)顟B(tài)，精子冷凍前后mRNA水平的差異可能是由于冷凍保存過程導(dǎo)致精子中mRNA的降解。有研究表明，冷凍可影響精子RNA轉(zhuǎn)錄組的完整性[18-19]。在本研究中，冷凍前后基因表達(dá)量差異最大的10個(gè)基因中，有5個(gè)基因參與免疫調(diào)節(jié):LOC101114535、B2M、FOS、MHCⅠ和HCAR2；有1個(gè)基因參與溫度信號(hào)刺激：HSP90AA1；有2個(gè)基因參與機(jī)體修復(fù)：GADD45B和PLAU，表明mRNA在精子中的差異表達(dá)與冷凍損傷存在一定關(guān)聯(lián)。

差異表達(dá)基因GO富集分析結(jié)果顯示，與精子功能密切相關(guān)的功能注釋主要包括生物過程中的細(xì)胞過程、代謝過程、對(duì)刺激的反應(yīng)、生殖過程和生殖等；細(xì)胞組分中的細(xì)胞部分、細(xì)胞器、細(xì)胞器部分、膜和膜部分；分子功能中的氧化還原反應(yīng)。Shangguan等[20]研究了荷斯坦牛精子冷凍前后基因的差異表達(dá)，結(jié)果表明，冷凍后精子差異表達(dá)基因主要參與DNA修復(fù)、精子細(xì)胞發(fā)育、溫度應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)、雙鏈斷裂修復(fù)、精子發(fā)生和生殖細(xì)胞發(fā)育等生物過程。該結(jié)論與本研究結(jié)果基本相同。

差異表達(dá)基因KEGG富集分析結(jié)果表明，冷凍前后差異表達(dá)基因參與40個(gè)通路，并且多富集于與炎癥以及疾病相關(guān)的通路。這些差異表達(dá)基因主要富集于由細(xì)菌、病毒和寄生蟲等生物病原體引發(fā)的炎癥相關(guān)通路，例如沙門氏菌感染、甲型流感和弓形蟲病等。此外，差異表達(dá)基因還顯著富集于趨化因子信號(hào)通路、Toll受體信號(hào)通路、吞噬體、NF-κB信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路。而這些通路都與免疫和炎癥相關(guān)通路密切相關(guān)，提示了免疫相關(guān)通路和炎癥通路可能在精子冷凍-解凍過程中發(fā)揮重要作用。本研究中，差異表達(dá)基因還富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和細(xì)胞凋亡通路。細(xì)胞因子是一種可溶性細(xì)胞外蛋白或糖蛋白，是細(xì)胞間重要的調(diào)節(jié)因子和動(dòng)員劑。它們參與先天性和適應(yīng)性炎癥宿主防御、細(xì)胞生長、分化以及細(xì)胞死亡等，并影響生殖生理學(xué)的各個(gè)方面[21]。有研究顯示，冷凍-解凍過程可引起水牛[22]、馬[23]和野豬[24]精子的凋亡樣變化，如線粒體膜電位降低、半胱氨酸蛋白酶激活、質(zhì)膜通透性增加和磷脂酰絲氨酸外化[25]。推測，凋亡樣改變是精子質(zhì)量參數(shù)(如精子活力、活力和頂體完整性)顯著下降的主要原因[26-28]。此外，Ran等[29]對(duì)豬和大熊貓冷凍精子的miRNA和mRNA表達(dá)譜進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明，細(xì)胞凋亡、能量代謝、嗅覺傳導(dǎo)途徑、炎癥反應(yīng)以及相關(guān)的細(xì)胞因子-細(xì)胞因子相互作用可能與精子冷凍損傷和冷凍耐受性有關(guān)，這與本研究結(jié)果基本一致。

4 結(jié) 論

本研究使用Smart-Seq2 RNA擴(kuò)增的方法對(duì)云南半細(xì)毛羊新鮮精子和凍融精子進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，共獲得1 213個(gè)差異表達(dá)顯著的基因，其中解凍后1 208個(gè)基因表達(dá)水平顯著下降。差異表達(dá)基因主要參與精子細(xì)胞過程、代謝過程、應(yīng)激反應(yīng)、生殖等生物學(xué)過程。而且，一些基因也參與了精子的氧化還原反應(yīng)。此外，差異表達(dá)基因顯著富集于與精子密切相關(guān)的炎癥、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和細(xì)胞凋亡等相關(guān)通路。本研究從轉(zhuǎn)錄組水平揭示了云南半細(xì)毛羊凍融精子基因的差異表達(dá)，對(duì)闡明綿羊精子冷凍損傷機(jī)制有重要的參考價(jià)值，同時(shí)也可以為綿羊凍精制作體系優(yōu)化和凍精質(zhì)量評(píng)級(jí)提供必要的分子標(biāo)記物。