張永浩，肖 逸，郭麗君，阿布都熱合曼·吐爾遜，王玉濤

(喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，喀什 844000)

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)是參與細(xì)胞表面轉(zhuǎn)膜蛋白的主要基因，其通過傳遞抗原給T淋巴細(xì)胞來激發(fā)免疫反應(yīng)，是基因組中多態(tài)性最為豐富的區(qū)域[1-3]，其產(chǎn)物MHC抗原在脊椎動物的免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要功能[4-7]。1906年，Tyzzer等進(jìn)行了有關(guān)小鼠腫瘤移植的試驗(yàn)，是對MHC的初步探索[8]；1956年，Snell等在移植小鼠皮膚時產(chǎn)生了供體組織與受體組織的排斥反應(yīng)，他率先對組織相容性基因進(jìn)行了定義[9]。小鼠MHC存在于H-2系統(tǒng)的17號染色體上，而人MHC簡稱為HLA(human leukocyte antigen)，位于6號染色體上[10]。大多數(shù)脊椎動物體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了MHC系統(tǒng)，且不同種類動物的組成、結(jié)構(gòu)和功能有較多相似的地方[11]。為便于區(qū)分，采用不同編碼的抗原系統(tǒng)來命名不同種屬動物的MHC，最早用血型系統(tǒng)來命名的是小鼠和雞[12]，該命名方法延用至今，對其他動物MHC的命名方式是保留該動物英文全稱的第一個字母，再在第一個字母后加上LA，這樣不同動物的MHC系統(tǒng)都有了相應(yīng)的簡寫，如人、大猩猩、犬、豬、馬、牛、綿羊、山羊和兔的MHC系統(tǒng)都是通過這種簡寫得到的[13-18]。

馬可·波羅盤羊分布于中國、巴基斯坦、阿富汗、塔吉克斯坦和吉爾吉斯斯坦五國接壤的邊境區(qū)域，并被列為一級保護(hù)動物[19]。王玉濤等[20]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，分布于東帕米爾高原的馬可·波羅盤羊的種群數(shù)量為3 000～3 500只；龔明昊等[21]研究表明，新疆塔什庫爾干野生動物自然保護(hù)區(qū)馬可·波羅盤羊的種群數(shù)量為1 500～1 700只[22]，該保護(hù)區(qū)是中國以馬可·波羅盤羊?yàn)槭滓Ｗo(hù)對象的最重要的自然保護(hù)區(qū)[23]。近幾年，關(guān)于MHC基因多態(tài)性的研究多集中在家畜中，有關(guān)珍稀瀕危動物的MHC研究相對較少[24-27]，而關(guān)于馬可·波羅盤羊MHC基因多態(tài)性的研究鮮見報道。綿羊MHC由Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類區(qū)域組成，其中在Ⅱ類區(qū)域的DQ和DR亞區(qū)多態(tài)性較為集中，其外顯子2為功能區(qū)，因此，MHC的研究主要集中在DRB3基因外顯子2上[28]。本研究采用PCR-SSCP和克隆測序技術(shù)對馬可·波羅盤羊和5種家綿羊MHC-DRB3基因第2外顯子的多態(tài)性和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析，確定馬可·波羅盤羊和5種家綿羊MHC-DRB3基因第2外顯子的等位基因數(shù)及核苷酸、氨基酸的多態(tài)位點(diǎn)，并對各等位基因的遺傳關(guān)系和進(jìn)化意義進(jìn)行了初步探討，以期為進(jìn)一步探究綿羊MHC-DRB3基因的調(diào)控機(jī)理及進(jìn)化關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集6種綿羊樣本共408份，其中馬可·波羅盤羊肌肉樣本采自帕米爾高原塔什庫爾干縣的卡拉其古、野生動物自然保護(hù)區(qū)管理局、紅其拉甫、薩熱吉力嘎、克孜勒蘇柯爾克孜自治州阿克陶縣木吉鄉(xiāng)以及喀什市動物園等地，共39份；藏綿羊血液樣本采自甘肅瑪曲縣，共72份；寧夏灘羊血液樣本采自寧夏鹽池縣，共76份；柯爾克孜羊血液樣本采自新疆喀什市，共36份；塔什庫爾干羊血液樣本采自新疆塔什庫爾干縣，共159份；多浪羊血液樣本采自新疆麥蓋提縣，共26份。以上樣本均-80 ℃保存于新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑及儀器

Tris飽和酚、蛋白酶K、DNA Marker、2×TaqPCR Mix、2×DNA Loading Buffer和質(zhì)粒小提試劑盒均購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自山東寶信生物科技有限公司。

冰凍離心機(jī)、立式超低溫保存箱和PCR儀均購自Eppendorf公司；冷藏箱購自青島海爾特種電器有限公司；電泳儀購自北京六一儀器廠；垂直電泳槽購自Bio-Rad公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 PCR擴(kuò)增及PCR-SSCP分型

參考Amills等[29]設(shè)計引物序列，上游引物：5′-TATCCCGTCTCTGCAGCACATTTC-3′；下游引物為：5′-TCGCCGCTGCACACTGAAACTCTC-3′，預(yù)計擴(kuò)增產(chǎn)物長度為285 bp。引物由金唯智生物科技有限公司合成。

盤羊基因組DNA提取方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第4版)，采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法，并進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)[30-31]。 PCR反應(yīng)體系20 μL：2×TaqPCR Mix 12 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.4 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 6.4 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取2.5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定正確后對其進(jìn)行分型。在電泳電壓和電泳時間恒定時，于Arc∶Bis=29∶1、膠濃度為12%、6 ℃條件下檢測，待垂直板22 h電泳結(jié)束后用簡易銀染法進(jìn)行染色，拍照保存。對MHC-DRB3基因第2外顯子不同基因型進(jìn)行基因型頻率分析。

1.4 克隆及測序

利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對不同基因型個體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行目的片段回收，回收產(chǎn)物連接pMD19-T克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，對鑒定正確的陽性菌落提取質(zhì)粒送金唯智生物科技有限公司測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

測序結(jié)果通過NCBI BLAST程序比對正確后，利用DnaSP 6.12.03軟件分析MHC-DRB3基因第2外顯子序列的堿基組成、單倍型及氨基酸變異位點(diǎn)。利用Mega 6.06軟件對馬可·波羅盤羊MHC-DRB3基因第2外顯子序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，所用序列為本研究獲得的66條綿羊的單倍型序列和1條鵝喉羚單倍型序列(E1)，采用Kimura-2模型，以鄰接法構(gòu)建綿羊MHC-DRB3基因第2外顯子序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，并對拓?fù)鋱D進(jìn)行自展檢驗(yàn)(bootstrap)，重復(fù)檢驗(yàn)次數(shù)為1 000。利用多種在線工具分析MHC-DRB3的結(jié)構(gòu)和功能，詳細(xì)信息見表1。

表1 生物信息學(xué)分析軟件

2 結(jié) 果

2.1 MHC-DRB3基因第2外顯子PCR擴(kuò)增

對馬可·波羅盤羊及家養(yǎng)綿羊MHC-DRB3基因第2外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到一條清晰、明亮、特異性高的條帶，大小為300 bp左右(圖1)，與預(yù)期相符，可進(jìn)行PCR-SSCP檢測。

2.2 MHC-DRB3基因第2外顯子PCR-SSCP檢測及基因型頻率分析

PCR-SSCP檢測結(jié)果共發(fā)現(xiàn)15種基因型，分別命名為A～O(圖2)。15種基因型中頻率最高的為H型(表2)，說明H型為馬可·波羅盤羊和5種家養(yǎng)綿羊品種的優(yōu)勢基因型。

1、2，馬可·波羅盤羊；3、4，塔什庫爾干羊；5、6，藏綿羊；7、8，寧夏灘羊；9、10，柯爾克孜羊；11、12，多浪羊；M，DNA Marker1 and 2，Ovis ammon polii;3 and 4，Taxkorgan sheep;5 and 6，Tibetan sheep;7 and 8，Ningxia Tan sheep;9 and 10，Kirgiz sheep;11 and 12，Duolang sheep；M，DNA Marker圖1 MHC-DRB3基因第2外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification products of MHC-DRB3 gene exon 2

圖2 MHC-DRB3基因第2外顯子PCR-SSCP檢測Fig.2 PCR-SSCP detection of MHC-DRB3 gene exon 2

表2 馬可·波羅盤羊和5種家養(yǎng)綿羊基因型頻率統(tǒng)計

2.3 MHC-DRB3基因第2外顯子等位基因氨基酸變異位點(diǎn)分析

通過Mega 6.06軟件對66個等位基因進(jìn)行氨基酸序列比對分析，共翻譯成79個氨基酸位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)為55個，占氨基酸位點(diǎn)總數(shù)目的69.6%(圖3)，略高于MHC-DRB3基因第2外顯子核苷酸多態(tài)位點(diǎn)占比(在去除引物序列的237 bp中發(fā)現(xiàn)107個多態(tài)位點(diǎn)，占比為45.1%)，充分印證了DRB3基因第2外顯子多態(tài)性較高。

2.4 MHC-DRB3基因第2外顯子堿基組成及單倍型分析

經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，MHC-DRB3基因第2外顯子長285 bp，A、T、C和G占比分別為23.38%、16.50%、23.07%和37.05%，其中CG含量(60.12%)明顯高于AT含量(39.88%)，說明存在一定的堿基偏倚性。對馬可·波羅盤羊和5種家養(yǎng)綿羊MHC-DRB3基因第2外顯子的不同基因型進(jìn)行克隆測序后發(fā)現(xiàn)66個單倍型，經(jīng)序列比對得出，本研究新發(fā)現(xiàn)了64條等位基因序列(表3)。

表3 綿羊MHC-DRB3基因第2外顯子單倍型比較

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

由圖4可知，馬可·波羅盤羊和塔什庫爾干羊MHC-DRB3基因第2外顯子序列系統(tǒng)進(jìn)化樹呈現(xiàn)兩支分化趨勢。馬可·波羅盤羊在Ⅰ支中有17個單倍型，在Ⅱ支中有6個單倍型；塔什庫爾干羊在Ⅰ支中有12個單倍型，在Ⅱ支中有2個單倍型，馬可·波羅盤羊和塔什庫爾干羊Ⅰ支中的單倍型明顯高于Ⅱ支中的單倍型。藏綿羊、寧夏灘羊、柯爾克孜羊和多浪羊并未出現(xiàn)兩支分化，單倍型分別為12、12、4及1個。鵝喉羚(E1)的單倍型呈獨(dú)立的分支，說明鵝喉羚的單倍型序列與馬可·波羅盤羊、塔什庫爾干羊、藏綿羊、寧夏灘羊、柯爾克孜羊和多浪羊6種綿羊的單倍型序列相似性較低。

圖4 馬可·波羅盤羊和5種家養(yǎng)綿羊品種MHC-DRB3基因第2外顯子系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on MHC-DRB3 gene exon 2 of Ovis ammon polii and five domestic sheep breeds

2.6 MHC-DRB3基因第2外顯子核苷酸多態(tài)性分析

用DnaSP 6.12.03軟件對馬可·波羅盤羊和家養(yǎng)綿羊MHC-DRB3基因第2外顯子單倍型的多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行分析，Pi1為馬可·波羅盤羊，其余Pi2為與之參考的藏綿羊、寧夏灘羊、柯爾克孜羊、塔什庫爾干羊。由圖5～8可知，藏綿羊、塔什庫爾干羊與馬可·波羅盤羊核苷酸多樣度變化趨勢最為相似，寧夏灘羊、柯爾克孜羊與馬可·波羅盤羊核苷酸多樣度變化趨勢相差較大。

圖5 馬可·波羅盤羊和藏綿羊MHC-DRB3基因第2外顯子核苷酸多樣度分布Fig.5 Nucleotide diversity distribution of MHC-DRB3 gene exon 2 in Ovis ammon polii and Tibetan sheep

圖6 馬可·波羅盤羊和寧夏灘羊MHC-DRB3基因第2外顯子核苷酸多樣度分布Fig.6 Nucleotide diversity distribution of MHC-DRB3 gene exon 2 in Ovis ammon polii and Ningxia Tan sheep

圖7 馬可·波羅盤羊和柯爾克孜羊MHC-DRB3基因第2外顯子核苷酸多樣度分布Fig.7 Nucleotide diversity distribution of MHC-DRB3 gene exon 2 in Ovis ammon polii and Kirgiz sheep

圖8 馬可·波羅盤羊和塔什庫爾干羊MHC-DRB3基因第2外顯子核苷酸多樣度分布Fig.8 Nucleotide diversity distribution of MHC-DRB3 gene exon 2 in Ovis ammon polii and Tashkurgan sheep

2.7 生物信息學(xué)分析

2.7.1 理化性質(zhì)預(yù)測 利用ExPASy中的在線工具ProtScale完成對馬可·波羅盤羊MHC-DRB3基因第2外顯子蛋白序列親/疏水性進(jìn)行性分析，結(jié)果顯示，馬可·波羅盤羊MHC-DRB3基因第2外顯子氨基酸序列絕大多數(shù)為親水性殘基(圖9)，推測馬可·波羅盤羊MHC-DRB3基因第2外顯子蛋白為水溶性蛋白。

圖9 馬可·波羅盤羊MHC-DRB3基因第2外顯子氨基酸序列親/疏水性分析結(jié)果Fig.9 Hydrophilic and hydrophobic prediction of amino acid sequence of MHC-DRB3 gene exon 2 in Ovis ammon polii

2.7.2 跨膜區(qū)預(yù)測 通過TMPRED在線軟件對馬可·波羅盤羊MHC-DRB3基因第2外顯子氨基酸序列進(jìn)行跨膜螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示，馬可·波羅盤羊MHC-DRB3基因第2外顯子中不存在跨膜螺旋結(jié)構(gòu)(圖10)。

2.7.3 亞細(xì)胞定位及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 采用Psort在線軟件對馬可·波羅盤羊MHC-DRB3基因第2外顯子編碼產(chǎn)物進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，馬可·波羅盤羊MHC-DRB3基因第2外顯子蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體和高爾基體中發(fā)揮生物學(xué)作用(表4)。采用SOPMA在線軟件預(yù)測馬可·波羅盤羊MHC-DRB3基因第2外顯子編碼產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，馬可·波羅盤羊MHC-DRB3基因第2外顯子編碼產(chǎn)物由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲組成，占比分別為30.53%、22.11%、11.58%和35.78%(表4)。

圖10 馬可·波羅盤羊MHC-DRB3基因第2外顯子氨基酸序列跨膜區(qū)預(yù)測Fig.10 Transmembrane region prediction of amino acid sequence of MHC-DRB3 gene exon 2 in Ovis ammon polii

表4 馬可·波羅盤羊MHC-DRB3基因第2外顯子亞細(xì)胞定位及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 討 論

本研究采用PCR-SSCP技術(shù)對綿羊MHC-DRB3基因第2外顯子進(jìn)行檢測，相較于PCR-RFLP方法，PCR-SSCP技術(shù)檢測得到的等位基因數(shù)量明顯較多[32]。本研究采用PCR-SSCP技術(shù)檢測了408只綿羊MHC-DRB3基因第2外顯子的多態(tài)性，共發(fā)現(xiàn)了66個等位基因，與GenBank中提交的3個等位基因都不相同，有2個等位基因與成述儒[33]發(fā)現(xiàn)的H14和H30等位基因相同，所以本研究共新發(fā)現(xiàn)了64個等位基因。39只馬可·波羅盤羊中發(fā)現(xiàn)了23個等位基因，說明馬可·波羅盤羊群體間等位基因出現(xiàn)的頻率比其他5種家養(yǎng)綿羊更高，其多態(tài)性可能更高，也表明馬可·波羅盤羊群體遺傳多樣性豐富，是彌足珍貴的遺傳資源。

6種綿羊的MHC-DRB3基因第2外顯子單倍型序列系統(tǒng)發(fā)生分析中，馬可·波羅盤羊和塔什庫爾干羊呈明顯的兩支分化，這與成述儒等[34]研究的藏綿羊MHC-DRB3基因單倍型呈兩支分化的情況相似。研究表明，MHC-DRB3基因的高度多態(tài)性與綿羊適應(yīng)高寒、高海拔的惡劣環(huán)境而產(chǎn)生的耐寒、耐粗、適應(yīng)能力較強(qiáng)的特性密切相關(guān)[34-35]。故推測馬可·波羅盤羊、藏綿羊和塔什庫爾干羊MHC-DRB3基因第2外顯子單倍型多態(tài)性和相似性較高且相互聚為一支的原因與這3種綿羊所處的高寒、高海拔的地理環(huán)境有關(guān)?？聽柨俗窝颉⒍嗬搜蚝蛯幭臑┭蛑慌c各自的單倍型聚為一支，說明這3種羊的單倍型相似性較低，可能與這3種綿羊所處的地理環(huán)境差別較大有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，H型為馬可波羅·盤羊和5種家養(yǎng)綿羊群體中的優(yōu)勢基因型，通過對優(yōu)勢基因型的篩選有利于后續(xù)的品種保護(hù)和遺傳育種。

本試驗(yàn)利用生物信息學(xué)方法對馬可·波羅盤羊MHC-DRB3基因第2外顯子以及編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)、序列特征和生物學(xué)功能進(jìn)行預(yù)測和分析，結(jié)果顯示，馬可·波羅盤羊MHC-DRB3基因第2外顯子主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮生物學(xué)作用，其編碼的氨基酸序列中有78個氨基酸為親水性殘基，推測馬可·波羅盤羊MHC-DRB3基因第2外顯子蛋白為水溶性蛋白；無規(guī)則卷曲為馬可·波羅盤羊MHC-DRB3基因第2外顯子中占比最大的蛋白二級結(jié)構(gòu)元件，α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則散在分布于整個蛋白質(zhì)中，與徐飛[14]、黃蘭[16]研究結(jié)果相一致。表明MHC-DRB3基因多態(tài)性與綿羊?qū)Νh(huán)境的適應(yīng)性密切相關(guān)，如抗病性、耐寒性發(fā)生變化，綿羊的基因頻率也會隨之改變，但馬可·波羅盤羊與5種家養(yǎng)綿羊MHC-DRB3基因的內(nèi)在分子調(diào)控機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

馬可·波羅盤羊MHC-DRB3基因第2外顯子共發(fā)現(xiàn)66個等位基因，其中64個為新發(fā)現(xiàn)的等位基因。馬可·波羅盤羊和塔什庫爾干羊MHC-DRB3基因第2外顯子的多態(tài)性更為豐富；馬可·波羅盤羊、塔什庫爾干羊和藏綿羊MHC-DRB3基因第2外顯子單倍型的相似性較高。馬可·波羅盤羊MHC-DRB3基因第2外顯子基因編碼產(chǎn)物為水溶性蛋白，不存在跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，其生物學(xué)作用主要在細(xì)胞質(zhì)中體現(xiàn)，二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主。