白培鈿，孔佳美，裴 婷，程志學(xué)，任玉紅

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

隨著中國(guó)集約化、規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，仔豬采取早期斷奶已成為提高母豬生產(chǎn)效率的一種常用手段。因仔豬腸道和免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，斷奶后仔豬受心理、環(huán)境改變和運(yùn)輸?shù)纫幌盗袘?yīng)激，容易引起仔豬早期斷奶綜合征，導(dǎo)致仔豬生長(zhǎng)性能和免疫性能下降，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[1-2]。飼糧中添加抗生素可以減緩仔豬早期斷奶綜合征[3]，但抗生素的濫用導(dǎo)致耐藥菌大量產(chǎn)生、藥物在畜禽產(chǎn)品中大量殘留，危害人類(lèi)身體健康[4]。益生菌能改善腸道菌群穩(wěn)態(tài)[5]、恢復(fù)腸道上皮黏膜的完整性[6]，提高機(jī)體免疫機(jī)能[7]，從而改善機(jī)體健康水平。酶制劑能補(bǔ)充仔豬機(jī)體內(nèi)消化酶分泌的不足，降解飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料轉(zhuǎn)化率[8]。作者所在研究團(tuán)隊(duì)研制出一種酶與益生菌配伍的復(fù)合微生態(tài)制劑(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺?02110593392.7)，以期應(yīng)用于養(yǎng)豬生產(chǎn)中，為養(yǎng)殖業(yè)“減抗禁抗”提供新的飼料添加劑。前期研究表明，該復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)BALB/c小鼠的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，且能增強(qiáng)小鼠免疫功能[9]。本試驗(yàn)進(jìn)一步探究飼料中添加不同濃度的復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能、免疫功能以及盲腸菌群豐度變化的影響，為復(fù)合微生態(tài)制劑的使用及替代抗生素應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料方法

1.1 材料

復(fù)合微生態(tài)制劑(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺?02110593392.7)：枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、啤酒酵母菌、中性蛋白酶和纖維素酶的混合產(chǎn)品。 其中啤酒酵母菌(LA9380)、枯草芽孢桿菌(LA9480)、中性蛋白酶、纖維素酶購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；嗜酸乳桿菌(BNCC186469)購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物有限公司；3種菌的活性比為1∶1∶1， 總活菌數(shù)為1.0×1011CFU/g； 中性蛋白酶的活性為1 840 U/g，纖維素酶的活性為3 220 U/g。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)選用80頭(28±2)日齡、體重相近(9.31 kg±0.52 kg)的斷奶仔豬，隨機(jī)分為5組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭仔豬(公母各半)。 5組飼糧分別為：對(duì)照組(CON)，基礎(chǔ)飼糧；低、中、高劑量復(fù)合微生態(tài)制劑組(LOW、MED、HIG)，在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0.1%、0.2%和0.3%復(fù)合微生態(tài)制劑(活菌數(shù)分別為1×1011、2×1011、3×1011CFU/kg)；抗生素組(ANT)，在基礎(chǔ)飼糧中添加75 mg/kg金霉素(金霉素預(yù)混劑購(gòu)自河南正大有限公司，含量為20%)。試驗(yàn)預(yù)飼期為7 d，正試期為28 d。 自由采食和飲水，舍內(nèi)溫度24～28 ℃，相對(duì)濕度60%～70%?；A(chǔ)飼糧由山西某農(nóng)牧集團(tuán)有限公司提供，且不含任何微生態(tài)制劑等添加劑成分，其組成和營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

續(xù)表

1.3 樣品采集

試驗(yàn)第28天早飼前，每重復(fù)隨機(jī)選取1頭體重接近平均值的仔豬，采集前腔靜脈血液5 mL，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min后取上清液；采用頸動(dòng)脈放血法處死采血后的仔豬，打開(kāi)胸腔和腹腔，取出胸腺和脾臟。于回盲瓣結(jié)扎盲腸，快速收集仔豬盲腸內(nèi)容物于無(wú)菌凍存管中，液氮速凍后-80 ℃冰箱保存。

1.4 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能與腹瀉率 于試驗(yàn)開(kāi)始和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)所有仔豬空腹稱(chēng)重。試驗(yàn)期每天記錄仔豬采食量。計(jì)算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。每日09：00、12：00、18：00觀察仔豬糞便,以重復(fù)為單位計(jì)算仔豬腹瀉率[10]。

1.4.2 免疫器官指數(shù) 胸腺和脾臟稱(chēng)重，計(jì)算免疫器官指數(shù)。免疫器官指數(shù)=免疫器官重(g)/活體重(kg)

1.4.3 血清生化指標(biāo) 利用全自動(dòng)血液生化分析儀(Chearay 800，深圳雷杜生命科技)測(cè)定血清中血糖(GLU)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)和尿素氮(BUN)含量/活性。

1.4.4 血清免疫指標(biāo) 免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)采用ELISA法測(cè)定，檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.4.5 盲腸菌群16S rRNA基因測(cè)序 用DNA抽提試劑盒提取盲腸內(nèi)容物中細(xì)菌總DNA后，采用細(xì)菌通用引物：343F(5′-TACGGRAGGCAG-CAG-3′)和798R(5′-AGGGTATCTAATCCT-3′)，擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的V3-V4可變區(qū)，PCR產(chǎn)物由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)為FASTQ格式，使用Trimmomatic軟件對(duì)原始雙端序列進(jìn)行去雜。去雜后的雙端序列利用FLASH軟件進(jìn)行拼接。采用Vsearch軟件，根據(jù)序列的相似性(序列相似度≥97%被歸為1個(gè)OTU)將序列歸為多個(gè)OTU。使用QIIME軟件包挑選出各個(gè)OTU的代表序列，進(jìn)行菌群Alpha多樣性分析，計(jì)算不同隨機(jī)抽樣下多樣性指數(shù)。 并基于Silva(version 123)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行比對(duì)注釋?zhuān)玫矫總€(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類(lèi)信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，在門(mén)、科、屬水平上統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的腸道群落組成，并利用歐易云平臺(tái)(https:∥cloud.oebiotech.cn/task/)繪制物種累計(jì)柱狀圖。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 生長(zhǎng)性能和腹瀉率

由表2可知，各組仔豬初始體重均無(wú)顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比，MED和ANT組仔豬終末體重、ADG和ADFI顯著升高(P<0.05)；MED、HIG和ANT組的F/G顯著降低(P<0.05)；LOW、MED和ANT組的腹瀉率顯著降低(P<0.05)。與抗生素組相比，MED組仔豬ADG和ADFI、MED和HIG組F/G以及LOW和MED組仔豬腹瀉率均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 不同處理組仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉率

2.2 免疫器官指數(shù)

由表3可知，MED和HIG組仔豬胸腺指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；MED組脾臟指數(shù)顯著高于對(duì)照組和抗生素組(P<0.05)，胸腺指數(shù)顯著高于抗生素組(P<0.05)。

2.3 血清生化指標(biāo)

由表4可知，與對(duì)照組相比，LOW、MED和HIG組血清HDL含量顯著上升(P<0.05)；LOW、HIG和ANT組BUN水平顯著下降(P<0.05)；MED和ANT組ALB含量顯著上升(P<0.05)；LOW、MED和ANT組AST活性顯著下降(P<0.05)。抗生素組LDH活性相較于其他處理組顯著升高(P<0.05)。

2.4 血清免疫指標(biāo)

由表5可知，與對(duì)照組相比，LOW、MED和ANT組血清IgG含量顯著升高(P<0.05)；MED和ANT組血清IgA與IgM含量顯著升高(P<0.05)。HIG組血清IgG含量顯著低于抗生素組(P<0.05)，LOW和MED組血清IgG含量、MED組血清IgA與IgM含量均與抗生素組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 不同處理組仔豬免疫器官指數(shù)

表4 不同處理組仔豬血清生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

表5 不同處理組仔豬血清免疫指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.5 盲腸菌群結(jié)構(gòu)

2.5.1 Alpha多樣性 復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)仔豬盲腸菌群Alpha多樣性的影響見(jiàn)表6。由表6可知，5個(gè)處理組間的Coverage和Simpson指數(shù)沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；LOW和HIG組的Chao1指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；LOW組的Shannon指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表6 不同處理組仔豬盲腸內(nèi)容物菌群Alpha多樣性指數(shù)

2.5.2 盲腸菌群豐度 由圖1A可知，在門(mén)水平上，擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)是5個(gè)處理組的優(yōu)勢(shì)菌群。由表7可知，與對(duì)照組相比，LOW、MED和ANT組厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)，LOW和MED組擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度顯著下降(P<0.05)；HIG和ANT組變形菌門(mén)相對(duì)豐度顯著下降(P<0.05)；LOW、MED、HIG和ANT組柔壁菌門(mén)(Tenericutes)相對(duì)豐度顯著下降(P<0.05)。由圖1B可知，在科水平上，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、韋榮氏菌科(Veillonellaceae)及Muribaculaceae是各組仔豬盲腸的優(yōu)勢(shì)菌群。由表7可知，相較于對(duì)照組，HIG組普雷沃氏菌科、LOW組瘤胃菌科及LOW、MED、HIG和ANT組乳桿菌科相對(duì)豐度均顯著上升(P<0.05)，同時(shí)這4組盲腸理研菌科(Rikenellaceae)與Tannerellaceae相對(duì)豐度均顯著下降(P<0.05)；相較于對(duì)照組和抗生素組，LOW和HIG組假單胞菌科(Pseudomonadaceae)相對(duì)豐度顯著下降(P<0.05)，相較于抗生素組，LOW組瘤胃菌科相對(duì)豐度顯著上升(P<0.05)。由圖1C可知，在屬水平上，普氏菌屬_9(Prevotella_9)、Agathobacter、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)是5個(gè)處理組的優(yōu)勢(shì)菌群。由表7可知，與對(duì)照組相比，HIG組擬普雷沃菌屬相對(duì)豐度顯著上升(P<0.05)；LOW和ANT組普雷沃氏菌屬_1(Prevotella_1)相對(duì)豐度顯著下降(P<0.05)；LOW、MED、HIG和ANT組乳桿菌屬相對(duì)豐度顯著上升(P<0.05)，而Prevotellaceae_UCG-001和彎曲桿菌屬(Campylobacter)相對(duì)豐度顯著下降(P<0.05)；MED、HIG和ANT組毛螺菌屬(Lachnospira)相對(duì)豐度顯著下降(P<0.05)；LOW、HIG和ANT組糞桿菌屬相對(duì)豐度顯著上升(P<0.05)；LOW組Subdoligranulum相對(duì)豐度顯著上升(P<0.05)。

A～C，分別表示仔豬盲腸菌群門(mén)水平、科水平和屬水平相對(duì)豐度A-C，The relative abundance of piglet caecal flora at phylum level,family level and genus level,respectively圖1 不同處理組仔豬盲腸菌群相對(duì)豐度Fig.1 The relative abundance of cecal flora of piglets in different groups

表7 不同處理組仔豬盲腸內(nèi)容物差異菌相對(duì)豐度

續(xù)表

3 討 論

益生菌能通過(guò)改善仔豬腸道消化吸收能力、提高養(yǎng)分利用率、抑制腸道中病原菌的生長(zhǎng)而改善腸道健康，從而提高仔豬生長(zhǎng)性能，降低腹瀉率[5-7,11]。酶制劑能加快消化道內(nèi)養(yǎng)分的消化、吸收和利用，并且可以消除飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子，從而改善仔豬的生長(zhǎng)性能[8,12]。飼糧中添加復(fù)合微生態(tài)制劑可以提高仔豬ADG和ADFI，降低F/G和腹瀉率[13-14]。本研究結(jié)果表明，MED和ANT組均顯著提高了仔豬終末體重、ADG和ADFI，降低F/G和腹瀉率，這表明適宜添加量的益生菌和酶制劑可共同作用提高仔豬生長(zhǎng)性能。而本研究中，飼糧中添加0.1%或0.3%復(fù)合微生態(tài)制劑，仔豬終末體重、ADG和ADFI相較于對(duì)照組均差異不顯著，未達(dá)到預(yù)期效果，其原因可能是復(fù)合微生態(tài)制劑添加量未達(dá)到適合濃度時(shí)，對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能影響較小，而添加量過(guò)高可能會(huì)降低飼糧的pH[15]，從而影響飼糧適口性[16-17]，導(dǎo)致仔豬采食量下降。

免疫器官指數(shù)是反映機(jī)體免疫力的重要指標(biāo)。胸腺、脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，參與機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫[18]。陳振等[19]研究表明，飼糧中添加復(fù)合益生菌可提高仔豬免疫器官指數(shù)，提高免疫力。本試驗(yàn)中飼糧添加不同劑量的復(fù)合微生態(tài)制劑均可提高仔豬免疫器官指數(shù)，且MED組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)相較于對(duì)照組與ANT組均顯著上升，表明飼糧中添加0.2%復(fù)合微生態(tài)制劑可以促進(jìn)仔豬免疫器官的生長(zhǎng)和發(fā)育，增強(qiáng)仔豬的免疫機(jī)能。

研究表明，飼糧中添加益生菌可顯著降低仔豬血清中ALT和AST活性[20-21]，與本研究結(jié)果一致。在本研究中，添加不同濃度復(fù)合微生態(tài)制劑后，仔豬血清中AST、ALT和ALP活性均有不同程度降低，其中MED和ANT組血清中AST活性顯著降低。ALB的含量可反映肝臟合成蛋白質(zhì)的能力[22]，同時(shí)ALB作為血液中重要組成部分，在轉(zhuǎn)運(yùn)代謝物、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和維持膠體滲透壓方面有重要作用[23]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，MED與ANT組血清ALB含量顯著提高，與賀長(zhǎng)青等[22]研究結(jié)果基本一致。血清TC、TG、LDL和HDL含量變化能反映機(jī)體脂質(zhì)代謝情況[24]。本研究結(jié)果表明，復(fù)合微生態(tài)制劑添加組血清HDL含量顯著高于對(duì)照組與抗生素組，表明復(fù)合微生態(tài)制劑能改善仔豬血液脂質(zhì)代謝，與任紅立等[25]結(jié)果基本一致。

免疫球蛋白是淋巴細(xì)胞受到抗原刺激產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，血清中IgG、IgM、IgA能夠與抗原特異性結(jié)合，其在血清中的含量可以衡量機(jī)體的免疫功能[26]。飼糧中添加復(fù)合微生態(tài)制劑能提高仔豬血清中IgG、IgM和IgA的含量，增強(qiáng)仔豬免疫力[26-27]。本研究結(jié)果顯示，飼糧添加不同濃度復(fù)合微生態(tài)制劑均能提高仔豬血清IgG、IgM和IgA的含量，與謝大識(shí)等[14]結(jié)果一致，其中，MED和ANT組IgG、IgM和IgA的含量上升幅度較高。以上結(jié)果表明，復(fù)合微生態(tài)制劑能提高仔豬的血清免疫球蛋白含量，改善仔豬免疫功能。

動(dòng)物腸道中有數(shù)量龐大且復(fù)雜多樣的菌群，腸道菌群的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)宿主營(yíng)養(yǎng)消化和健康起著重要作用[28-29]。在菌群多樣性分析過(guò)程中，Coverage指數(shù)值越高，序列被測(cè)出的概率越高；Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)值越大，群落豐度和多樣性越高[28]。在本試驗(yàn)中，LOW組Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著高于對(duì)照組，表明LOW組盲腸菌群多樣性顯著高于對(duì)照組，與王四新等[28]研究結(jié)果一致。厚壁菌門(mén)具有降解多糖和促進(jìn)機(jī)體能量吸收的作用[30-31]，在斷奶仔豬腸道中起重要作用。本研究結(jié)果表明，仔豬盲腸菌群以厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)為主，與對(duì)照組和抗生素組相比，LOW、MED和ANT組厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度顯著升高。變形菌門(mén)中如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等都有可能引起仔豬腹瀉，該菌門(mén)的豐度下降通常被認(rèn)為有利于腸道健康[30]。本研究中，HIG與ANT組變形菌門(mén)在盲腸中的相對(duì)豐度相較于對(duì)照組顯著降低，且二者的降低程度相似。與對(duì)照組相比，LOW組瘤胃菌科和HIG組擬普雷沃菌屬相對(duì)豐度顯著上升。瘤胃菌科細(xì)菌能夠發(fā)酵腸道內(nèi)的纖維素[32]，產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFAs)，擬普雷沃菌屬屬于擬桿菌門(mén)，在腸道內(nèi)可以產(chǎn)生SCFAs[33]，SCFAs含量增加有利于仔豬腸道健康，降低仔豬腹瀉率[34]。仔豬斷奶后，腸道內(nèi)乳酸菌的比例迅速降低[35]。乳酸菌可通過(guò)自身及生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，抑制致病菌的繁殖，對(duì)改善腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)具有一定作用[36]。本研究中，相較于對(duì)照組，飼糧中添加復(fù)合微生態(tài)制劑后盲腸乳桿菌科與乳桿菌屬菌群相對(duì)豐度上升，與朱佳文等[33]研究結(jié)果相似。糞桿菌屬細(xì)菌能降解膳食纖維產(chǎn)生丁酸鹽，緩解組織炎癥，增加腸道完整性[37-38]。本試驗(yàn)中，LOW、HIG和ANT組糞桿菌屬相對(duì)豐度相較于對(duì)照組均顯著上升，有利于仔豬腸道健康；同時(shí)，飼喂復(fù)合微生態(tài)制劑后盲腸中彎曲桿菌屬和毛螺菌屬相對(duì)豐度降低，并且LOW和HIG組盲腸中假單胞菌科菌群相對(duì)豐度降低。彎曲桿菌[39]和毛螺菌屬[40]的上調(diào)均能引起仔豬腹瀉，假單胞菌是引起急性和慢性感染的主要病原體，尤其是在免疫功能低下的人群中較為常見(jiàn)[41]。綜上所述，飼糧中添加復(fù)合微生態(tài)制劑可改善仔豬盲腸菌群結(jié)構(gòu)。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加0.2%復(fù)合微生態(tài)制劑(活菌數(shù)為2×1011CFU/kg)能夠一定程度上提高斷奶仔豬的ADG和ADFI，降低F/G和腹瀉率；提高免疫器官指數(shù)和血清中ALB、HDL、IgG、IgA和IgM的含量，降低AST活性；改善盲腸微生物群落結(jié)構(gòu)，其作用效果與抗生素相似，具有替抗?jié)摿Α?/p>