朱 翠，黃凱勇，李麗娜，吳愛基，吳 鵬，符芳苗，羅苑華，張輝華

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，佛山 528225)

長期使用抗生素會導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加、藥物殘留和環(huán)境污染等問題，最終危害動物和人類健康，因此尋找合適的抗生素替代品迫在眉睫。中草藥與植物提取物被認(rèn)為是綠色、安全、無污染的飼料添加劑，具有促進(jìn)畜禽生長、改善腸道健康、提高繁殖性能和調(diào)節(jié)免疫功能等作用[1]。小檗堿(berberine，BBR)又稱黃連素，是黃連、黃柏、三顆針等傳統(tǒng)中藥的主要有效成分，具有抗菌、抗氧化、抑菌、消炎、降血糖、降脂和抗凋亡等生理功效，在臨床上已廣泛用于治療腹瀉、胃腸炎與心血管疾病等[2-3]。研究表明，三顆針提取物(主要成分為小檗堿)可代替阿維拉霉素促進(jìn)肉仔雞生長發(fā)育，提高肉仔雞機(jī)體的抗氧化能力和抗體水平[4-5]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加250 mg/kg的小檗堿可顯著提高黃羽肉雞的生長性能，調(diào)節(jié)盲腸微生物結(jié)構(gòu)和多樣性[6]。此外，在小鼠的研究表明，小檗堿具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，可以減少機(jī)體炎性因子的表達(dá)，從而減輕腸道和肺部炎癥損傷[7]。但是，小檗堿作為抗生素替代品在改善黃羽肉雞的器官發(fā)育、腸道抗氧化和免疫功能的作用研究相對較少。本研究在研究飼糧中添加小檗堿對黃羽肉雞器官指數(shù)、抗氧化能力和腸道免疫功能的影響，以期為小檗堿在肉雞生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計與飼糧

試驗(yàn)選取1日齡健康快大型嶺南黃羽肉雞 360只，按單因子隨機(jī)分組設(shè)計分為3組，即對照組(NC)、抗生素組(PC)和小檗堿組(BBR)，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)20只雞。試驗(yàn)采用玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，根據(jù)《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T33-2004)[8]和《中國飼料成分及營養(yǎng)價值表》(2019年第30版)進(jìn)行配制[9]。 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。 對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧；抗生素組飼喂基礎(chǔ)飼糧+200 mg/kg土霉素鈣和250 mg/kg那西肽(土霉素鈣和那西肽由佛山市廣牧興飼料有限公司提供)；小檗堿組飼喂基礎(chǔ)飼糧+250 mg/kg小檗堿(購自陜西森弗天然制品有限公司)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成與營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 主要試劑和儀器

總抗氧能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；PrimerScriptTMRT Reagent Kit購自TaKaRA公司；熒光定量PCR mix試劑盒購自Bio-Rad公司。酶標(biāo)儀(INFINITE M PLEX)購自TACAN公司；核酸蛋白檢測儀(Nanodrop ND-1000)購自Thermos Scientific公司；實(shí)時熒光定量PCR儀(CFX96 Real-time PCR System)購自Bio-Rad公司。

1.3 飼養(yǎng)管理與屠宰采樣

飼養(yǎng)試驗(yàn)共63 d，分為小雞(1～21 d)、中雞(22～42 d)和大雞(43～63 d)3個階段。試驗(yàn)雞籠養(yǎng)，試驗(yàn)期間自由采食與飲水。在試驗(yàn)第21、42和63天，每個重復(fù)挑選1只接近平均體重的雞屠宰，采集其空腸中段組織，用玻片在冰上輕輕刮取空腸黏膜，分裝于1.5 mL離心管中，速凍于液氮，然后轉(zhuǎn)置于-80 ℃保存待測。

1.4 器官指數(shù)

肉雞21、42和63日齡屠宰后測定屠體重，采集心臟、肝臟、脾臟和法氏囊分別稱重，計算其器官指數(shù)，具體公式為：器官指數(shù)(%)=(器官重量/屠體重)×100。

1.5 抗氧化指標(biāo)

取63日齡時的空腸黏膜樣品1 g，加入0.9%生理鹽水，用組織搗碎機(jī)研磨制成10%空腸黏膜勻漿液，3 500 r/min離心15 min，取上清。測定空腸黏膜勻漿液的抗氧化指標(biāo)，包括總抗氧能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量，具體步驟按照相應(yīng)試劑盒方法進(jìn)行。

1.6 腸道緊密連接蛋白和腸道免疫相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量

1.6.1 空腸黏膜總RNA的提取和cDNA合成 取21、42和63日齡黃羽肉雞的空腸黏膜組織各0.1 g，按Trizol法提取總RNA，用NanoDrop ND-1000核酸蛋白檢測儀測定樣品在260和280 nm處的吸光值，檢測樣品濃度和純度；通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳(150 V，20 min)檢測其完整性。以總RNA濃度為1 μg/mL進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄參考反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒的使用說明進(jìn)行，cDNA樣品置于-20 ℃保存。

1.6.2 引物設(shè)計與合成 參照NCBI網(wǎng)站GenBank中跨膜蛋白-1(Claudin-1)、閉合蛋白(Occludin)、閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、IL-8、IL-10、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白1(NOD1)、Toll樣受體4(TLR4)、分泌型IgA(sIgA)、肌動蛋白(β-actin)基因的序列，使用Prime Premier 5.0軟件，設(shè)計目的基因上、下游引物(表2)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。合成后的引物用0.1%的DEPC水稀釋到100 μmol/L，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 引物信息

1.6.3 實(shí)時熒光定量PCR 以合成的cDNA為模板，將各組分按總體系20 μL加入到96孔板中：SYBR Green (2×) 10 μL、上、下游引物 (終濃度為10 μmol/L) 各1 μL、cDNA模板1 μL、DEPC水8 μL；封膜，3 000 r/min快速離心1 min，使各組分集于孔底，置于熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。熔解曲線的反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 s，65 ℃ 60 s，95 ℃ 30 s，每個樣品3個重復(fù)，采用2-ΔΔCt方法計算目的基因相對表達(dá)量，即ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(β-actin)，ΔΔCt=ΔCt(處理組)-ΔCt(對照組)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan氏多重比較檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著，0.05

2 結(jié) 果

2.1 飼糧添加小檗堿對黃羽肉雞器官指數(shù)的影響

由表3可知，在飼糧中添加小檗堿或抗生素對21、42和63日齡黃羽肉雞的法氏囊指數(shù)、脾臟指數(shù)、心臟指數(shù)與肝臟指數(shù)均無顯著影響(P>0.05)。與對照組和小檗堿組相比，抗生素組63日齡黃羽肉雞的脾臟指數(shù)有提高趨勢(0.05

表3 各組黃羽肉雞器官指數(shù)測定結(jié)果

2.2 小檗堿對黃羽肉雞腸道抗氧化能力的影響

由表4可知，與對照組比較，在飼糧添加小檗堿顯著提高了63日齡黃羽肉雞空腸黏膜的總抗氧化能力(T-AOC)(P<0.05)，并與抗生素效果相當(dāng)。 此外，與對照組和抗生素組相比，添加小檗堿顯著降低了63日齡黃羽肉雞空腸黏膜的丙二醛(MDA)含量(P<0.05)。

2.3 小檗堿對黃羽肉雞腸道緊密連接蛋白基因mRNA表達(dá)量的影響

由表5可知，21日齡時，抗生素組黃羽肉雞空腸黏膜Occludin和ZO-1基因mRNA表達(dá)量顯著高于對照組和小檗堿組(P<0.05)，而各組間空腸黏膜Claudin-1基因的表達(dá)量無顯著差異。42日齡時，與對照組相比，抗生素和小檗堿組黃羽肉雞空腸黏膜Claudin-1、Occludin和ZO-1基因mRNA表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05)。但63日齡時，與對照組和抗生素組相比，小檗堿組黃羽肉雞空腸黏膜Claudin-1基因mRNA表達(dá)量顯著提高(P<0.05)。

表4 各組63日齡黃羽肉雞空腸黏膜抗氧化能力測定結(jié)果

表5 各組黃羽肉雞腸道黏膜緊密連接蛋白基因的相對表達(dá)量

2.4 小檗堿對黃羽肉雞腸道黏膜免疫相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

由表6可知，21日齡時，與對照組和抗生素組相比，小檗堿顯著降低了黃羽肉雞空腸黏膜NOD1基因的mRNA表達(dá)量(P<0.05)；與對照組相比，抗生素處理顯著提高了黃羽肉雞空腸黏膜TLR4基因的mRNA表達(dá)量(P<0.05)；各組間空腸黏膜TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10和sIgA基因的mRNA表達(dá)量差異均不顯著(P>0.05)。

42日齡時，小檗堿組與抗生素組黃羽肉雞空腸黏膜IL-1β和IL-8基因的mRNA表達(dá)量均顯著低于對照組(P<0.05)；小檗堿組NOD1的mRNA表達(dá)量顯著低于抗生素組(P<0.05)，但與對照組無顯著差異(P>0.05)；各組間空腸黏膜TNF-α、IL-10、TLR4和sIgA基因的mRNA表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05)。

63日齡時，與對照組相比，小檗堿顯著降低了TNF-α、IL-1β、IL-8基因mRNA表達(dá)量(P<0.05)；與抗生素組相比，小檗堿顯著降低了TNF-α和NOD1基因mRNA表達(dá)量(P<0.05)；各組間空腸黏膜IL-10、TLR4和sIgA基因mRNA表達(dá)量差異均不顯著(P>0.05)。

表6 各組黃羽肉雞腸道黏膜免疫相關(guān)基因的相對表達(dá)量

續(xù)表

3 討 論

中草藥添加劑是一種綠色、安全、毒副作用小、無污染的飼料添加劑，可作為畜禽機(jī)體免疫增強(qiáng)劑，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)[1]。小檗堿亦稱黃連素，是從黃連等中藥中分離的一種季銨生物堿成分[10]。本課題組前期研究表明，飼糧中添加小檗堿提高了黃羽肉雞的生長性能，且可以調(diào)控黃羽肉雞盲腸菌群結(jié)構(gòu)和多樣性[6]，但對器官指數(shù)、腸道抗氧化功能和黏膜免疫功能影響尚不清楚。器官的正常發(fā)育是動物體內(nèi)生理功能發(fā)揮的基礎(chǔ)，為了滿足動物機(jī)體的生理變化，動物的內(nèi)臟器官與其體重會保持相對穩(wěn)定的比例關(guān)系，反映器官功能與代謝強(qiáng)弱和免疫性能情況。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中單獨(dú)添加小檗堿或同時添加連翹提取物和小檗堿，均可以顯著提高白羽肉雞的法氏囊重量及法氏囊指數(shù)[11]。而本研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿或抗生素處理對21、42和63日齡黃羽肉雞的法氏囊、脾臟、肝臟和心臟指數(shù)的影響均無顯著差異，說明在本試驗(yàn)條件下添加小檗堿對黃羽肉雞的器官發(fā)育無負(fù)面影響。

氧化應(yīng)激是由動物機(jī)體內(nèi)羥基自由基和超氧陰離子等自由基產(chǎn)生的一種負(fù)面影響，過量的活性氧會損傷蛋白質(zhì)和核酸，并產(chǎn)生大量的MDA損傷組織，容易引起機(jī)體炎癥與疾病。研究表明，小檗堿具有很強(qiáng)的清除自由基的作用，可以降低MDA含量，提高SOD和GSH-Px的活性，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)[12-13]。王志祥等[14]研究發(fā)現(xiàn)，三顆針提取物(主要成分小檗堿)可以提高仔豬的抗氧化功能，與土霉素處理相比，添加不同水平(200、500和1 000 mg/kg)三顆針提取物均顯著提高了仔豬血清 GSH-Px和SOD活性，并顯著降低了仔豬血清中MDA含量。研究還表明，小檗堿顯著抑制了因高脂飼糧誘導(dǎo)的團(tuán)頭魴機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高SOD活性，同時減少細(xì)胞凋亡[15]。此外，在白羽肉雞上的研究也顯示，小檗堿組血清的T-AOC和SOD活力顯著提高，而血清MDA含量則顯著降低[13]。本研究在黃羽肉雞上得到的結(jié)果與前人研究結(jié)果[11,14]一致，即飼糧中添加小檗堿能顯著提高63日齡黃羽肉雞空腸黏膜的T-AOC活力，并降低MDA含量，說明小檗堿可有效增強(qiáng)黃羽肉雞的腸道抗氧化能力。

緊密連接蛋白(如Claudin-1、Occludin和ZO-1等)是腸道屏障的重要組成部分，對于維護(hù)動物腸道健康和保障機(jī)體的正常生長發(fā)育非常重要[16]。促生長類抗生素已被證實(shí)對畜禽生產(chǎn)性能的改善作用與其增強(qiáng)腸道屏障功能有關(guān)[17]。研究還顯示，植物生物活性物質(zhì)可通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá)量、杯狀細(xì)胞數(shù)量、黏蛋白(MUC)表達(dá)量以及腸上皮通透性的變化，從而增強(qiáng)家禽的腸道屏障功能[18]。而本研究也表明，抗生素處理顯著提高了21日齡黃羽肉雞空腸黏膜Occludin和ZO-1基因的mRNA表達(dá)量。研究還發(fā)現(xiàn)，小檗堿對緊密連接蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用可能與激活磷肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)信號通路有關(guān)[19-20]。本試驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)，飼糧添加小檗堿顯著提高了63日齡黃羽肉雞空腸黏膜Claudin-1基因mRNA表達(dá)量，說明小檗堿在改善腸道機(jī)械屏障方面具有良好作用，但是否通過激活MLCK信號通路仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

研究表明，富含小檗堿的三顆針提取物具有和抗生素相似的抗菌和抗炎功效[21]。在斷奶仔豬上的研究也顯示，三顆針提取物在提高仔豬的非特異性免疫機(jī)能方面的效果要優(yōu)于土霉素[13]。此外，土霉素鈣與那西肽以往是肉雞生產(chǎn)中常用的飼用抗生素之一，具有很好的抗菌活性[22]，可有效促進(jìn)肉仔雞的生長和增強(qiáng)肉仔雞免疫機(jī)能[23]。本研究也發(fā)現(xiàn)，小檗堿組和抗生素組(含土霉素鈣和那西肽)42日齡黃羽肉雞空腸黏膜中炎性因子IL-1β和IL-8基因的表達(dá)量均顯著降低。有研究表明，小檗堿顯著降低了脂多糖(LPS)刺激的肉雞血漿中IL-6含量，抑制了LPS刺激所引起的白細(xì)胞和淋巴數(shù)量數(shù)量增加[24]，并顯著下調(diào)肉雞肝臟中炎性因子的表達(dá)[25]，從而緩解了肉雞的炎癥反應(yīng)。張光輝等[5]研究也認(rèn)為，同時添加γ-氨基丁酸和三顆針提取物可以顯著提高肉仔雞的T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)細(xì)胞免疫功能發(fā)育。此外，給5周齡小鼠連續(xù)8周每天灌服200 mg/kg小檗堿，其肝臟IL-1β、IL-6和TNF-α基因的表達(dá)量顯著下調(diào)[26]。本研究也發(fā)現(xiàn)，小檗堿有效抑制了63日齡黃羽肉雞腸道黏膜促炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-8基因的表達(dá)，這與前人研究結(jié)果[25-26]一致。

Toll樣受體和NOD樣受體作為病原識別受體(PRRs)在調(diào)節(jié)家禽免疫反應(yīng)和疾病防治過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[27-28]。研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿或二甲雙胍(治療糖尿病藥物)能通過抑制TLRs/NF-κB信號通路相關(guān)基因(TLR2、TLR4、IKKα、IKBα和NF-κB)的表達(dá)，顯著降低腸黏膜TNF-α的表達(dá)和血液內(nèi)毒素的含量，從而緩解小鼠腸道炎癥反應(yīng)，保護(hù)腸道上皮完整性[29]。在大鼠上的研究也顯示，小檗堿處理顯著降低了回腸組織中TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-6等基因的表達(dá)量，并提高了回腸MUC2和sIgA基因的表達(dá)量，從而有效緩解壞死性腸炎的損傷程度[30]。Chu等[31]也認(rèn)為小檗堿通過阻斷LPS與TLR4/MD2受體結(jié)合，從而抑制了下游炎癥因子TNF-α、IL-8和IFN-β的表達(dá)。此外，NOD信號通路對于維持免疫穩(wěn)態(tài)也具有重要作用，NOD1表達(dá)量升高已被證實(shí)與許多炎癥反應(yīng)及疾病密切相關(guān)[32]。 本研究也發(fā)現(xiàn)小檗堿顯著降低了腸道黏膜中TLR4和NOD1基因的表達(dá)量，進(jìn)而降低TNF-α、IL-1β和IL-8基因的表達(dá)量?？梢姡￠迚A具有較強(qiáng)的抗炎作用，可能通過抑制TLR4和NOD1信號通路下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，從而減少黃羽肉雞腸道炎癥的發(fā)生。

4 結(jié) 論

本研究表明，在無抗飼糧中添加250 mg/kg小檗堿顯著提高了63日齡黃羽肉雞腸道的抗氧化能力，并可能通過抑制腸黏膜TLR4和NOD1基因的表達(dá)，從而有效降低TNF-α、IL-1β和IL-8基因的表達(dá)，有助于減少腸道炎癥的發(fā)生，維護(hù)黃羽肉雞的腸道健康。本試驗(yàn)結(jié)果將為小檗堿作為抗生素替代品在改善黃羽肉雞氧化應(yīng)激和腸道健康方面的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。