伍 源，秦 鑫，董元洋，韓苗苗，苗志強(qiáng)，魏清宇，宋獻(xiàn)藝，申李琰，馮 焱，李慧鋒，李建慧

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

肉雞產(chǎn)業(yè)集約化養(yǎng)殖使得生產(chǎn)效率提高，但飼養(yǎng)密度的提高會導(dǎo)致肉雞健康出現(xiàn)各種問題從而影響經(jīng)濟(jì)效益[1-3]。有研究表明，當(dāng)肉雞飼養(yǎng)密度達(dá)到20只/m2時(shí)會使家禽產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，降低肉雞的采食量和體重[4]，導(dǎo)致體內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡，引起機(jī)體氧化損傷[5]。蛋氨酸作為合成谷胱甘肽的前體，是禽類的第一限制性氨基酸[6]。蛋氨酸可以通過減少線粒體活性氧產(chǎn)生，調(diào)控Nrf2、ATF4、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的關(guān)鍵信號通路等方式參與氧化應(yīng)激的調(diào)控[7]，改善氧化狀態(tài)并在一定程度上促進(jìn)機(jī)體健康。在飼糧中適量補(bǔ)充蛋氨酸可以顯著改善肉雞的生產(chǎn)性能[8-9]，提高雞肉品質(zhì)，增強(qiáng)肉雞肝臟、血清抗氧化能力[10]。而蛋氨酸缺乏(飼糧蛋氨酸水平為0.28%時(shí))則會影響肉雞的肝臟和腎臟功能[11]，但有研究表明，適量的蛋氨酸限制(飼糧蛋氨酸水平為NRC水平的60%～80%)能顯著提高肉雞腸道抗氧化能力，腸道先天性免疫系統(tǒng)基因表達(dá)，以及改善腸道菌群結(jié)構(gòu)[12]。鑒于已有研究中蛋氨酸添加水平結(jié)論的不一致性，本試驗(yàn)探究補(bǔ)充或限制蛋氨酸對高飼養(yǎng)密度誘導(dǎo)的肉雞氧化，應(yīng)激狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用，研究在高密度條件下適宜的蛋氨酸水平，為集約化生產(chǎn)實(shí)踐中蛋氨酸合理使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取1日齡AA肉雞396只，1～21日齡統(tǒng)一飼喂于籠位面積為0.7 m2的上層籠子中，飼養(yǎng)密度為14只/m2，21日齡末選取體重相近的肉雞隨機(jī)分為5個(gè)處理。對照組飼養(yǎng)密度為14只/m2，飼糧蛋氨酸水平為0.40%；4個(gè)試驗(yàn)組飼養(yǎng)密度均為20只/m2，蛋氨酸水平分別設(shè)置為0.35%、0.40%、0.45%、0.50%。每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1個(gè)籠位。試驗(yàn)分組見表1。

肉雞的飼養(yǎng)管理、免疫程序按常規(guī)進(jìn)行，自由飲水和采食。雞舍溫度在0～3日齡時(shí)為34 ℃，從4日齡后每周降低2～3 ℃，直至環(huán)境溫度保持在22 ℃。光照程序?yàn)槊刻旃庹?3 h，黑暗1 h。

1.2 飼糧組成與營養(yǎng)成分

試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧配制參照雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 33-2004)，肉雞基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2?；A(chǔ)飼糧中蛋氨酸水平為0.30%，對照組飼糧在基礎(chǔ)飼糧中添加0.10%DL-蛋氨酸(99%)，試驗(yàn)飼糧在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0.05%、0.10%、0.15%和0.20%的DL-蛋氨酸(99%)。

表1 試驗(yàn)處理及分組

表2 肉雞基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 生長性能 試驗(yàn)肉雞于21、42日齡空腹8 h后稱量體重，統(tǒng)計(jì)飼喂量和剩料重，計(jì)算22～42日齡的平均日采食量、平均日增重和料重比，同時(shí)統(tǒng)計(jì)死亡率。

1.3.2 血液指標(biāo) 在42日齡時(shí)，從每個(gè)重復(fù)選取1只接近平均體重的肉雞翅靜脈采血10 mL，抗凝處理，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，于-20 ℃保存待測以下指標(biāo):

血漿生化指標(biāo)：谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)；血漿抗氧化指標(biāo)：總抗氧化力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、蛋白質(zhì)羰基(PCO)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、還原/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)。以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。血漿應(yīng)激指標(biāo)：肌酸激酶(CK)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)，試劑盒購自南京建成生物工程研究所；皮質(zhì)酮(CORT),采用ELISA法測定，試劑盒購自德國DRG公司，所用儀器為SM-3全自動酶免儀。

1.3.3 肝臟SOD、GSH-Px、HMGCR和HSP70基因表達(dá) 取肝臟組織于無RNA酶管在液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩４郎y基因引物信息見表3，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用Trizol Reagent提取肝臟組織總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；使用SYBR?Premix ExTaqTMⅡ試劑盒(Tli RNaseH Plus)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。以上試劑盒均購自TaKaRa公司。以β-actin為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA相對表達(dá)量。

表3 引物信息

續(xù)表

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析相同蛋氨酸水平時(shí)高、低密度處理效應(yīng)；采用One-Way ANOVA分析所有處理間的差異，并對高密度處理下的4個(gè)蛋氨酸水平組做線性和二次曲線回歸統(tǒng)計(jì)，分析蛋氨酸劑量效應(yīng)對肉雞的影響。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。 當(dāng)方差分析顯著時(shí)，采用Tukey’s進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 肉雞生長性能

由表4可知，與正常密度組相比，高密度飼養(yǎng)顯著降低了肉雞42日齡體重、平均日采食量、平均日增重(P<0.05)，顯著提高了肉雞死亡率(P<0.05)，但對料重比無顯著影響(P=0.460)。而與正常密度組相比，0.35%蛋氨酸組料重比顯著提高(P<0.05)。在高密度飼養(yǎng)條件下，與0.40%蛋氨酸組相比，0.35%蛋氨酸組死亡率顯著增加(P<0.05)，補(bǔ)充添加蛋氨酸至0.45%、0.50%死亡率顯著降低(P<0.05)。

2.2 肉雞氧化應(yīng)激狀態(tài)

2.2.1 肉雞血漿生化指標(biāo) 由表5可知，與正常密度組相比，高密度飼養(yǎng)顯著提高了ALT活性(P<0.05)。在高密度飼養(yǎng)條件下，0.35%蛋氨酸組ALT活性顯著高于0.40%和0.45%蛋氨酸組(P<0.05)；AST活性隨著飼糧蛋氨酸水平的提高呈線性上升(P<0.05)；0.45%蛋氨酸組LDH活性顯著高于其他各組(P<0.05)。

表4 不同處理組肉雞生長性能(22～42日齡)

表5 不同處理組肉雞血漿生化指標(biāo)測定結(jié)果

2.2.2 肉雞血漿抗氧化指標(biāo) 由表6可知，與正常密度組相比，高密度組血漿T-AOC顯著降低(P<0.05)，而SOD活性及PCO水平顯著上升(P<0.05)。在高密度飼養(yǎng)條件下，隨著蛋氨酸水平上升，PCO水平線性降低(P<0.05)。

2.2.3 肉雞血漿應(yīng)激相關(guān)指標(biāo) 由表7可知，與正常密度飼養(yǎng)組相比，高密度飼養(yǎng)顯著降低了TP濃度(P<0.05)。在高密度飼養(yǎng)條件下，與0.4%蛋氨酸水平組相比，0.5%蛋氨酸水平組TP濃度顯著提高(P<0.05)；與0.40%和0.45%蛋氨酸水平組相比，0.35%水平蛋氨酸組血漿CK濃度顯著降低(P<0.05)。

2.2.4 肉雞肝臟抗氧化相關(guān)基因表達(dá) 由表8可知，與正常密度組相比，高密度飼養(yǎng)顯著提高了肝臟HSP70基因表達(dá)(P<0.05)。與高密度正常氨酸組相比，高密度+0.35%蛋氨酸組、高密度+蛋氨酸0.50%組HSP70表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，高密度+0.45%蛋氨酸組無顯著差異(P>0.05)。高密度+0.35%蛋氨酸組、高密度+0.50%蛋氨酸組HMGCR基因表達(dá)量均顯著高于正常密度組(P<0.05)；肝臟組織中SOD、GPX轉(zhuǎn)錄水平在不同處理間均無顯著差異(P>0.05)。

表6 不同處理組肉雞血漿抗氧化指標(biāo)測定結(jié)果

表7 不同處理組肉雞血漿應(yīng)激指標(biāo)測定結(jié)果

表8 不同處理組肉雞肝臟抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)量

3 討 論

3.1 飼養(yǎng)密度和不同蛋氨酸水平對肉雞生產(chǎn)性能的影響

大量研究表明，高飼養(yǎng)密度會降低肉雞體增重和采食量[13-14]，還會顯著提高肉雞死亡率[15-16]，本試驗(yàn)結(jié)果與之一致。原因可能是多方面的，高密度飼養(yǎng)條件下，空氣流動不良，單位面積雞群呼吸產(chǎn)熱增加[17]，雞舍在較高的溫度和濕度下不利于肉雞生長[18]，雞舍環(huán)境惡化極易增加肉雞胸囊腫和腿部疾病發(fā)生率[19]。已有研究表明，添加蛋氨酸可以降低動物死亡率[20]。在本試驗(yàn)中，高密度飼養(yǎng)組在額外補(bǔ)充蛋氨酸后顯著降低了肉雞死亡率，而高密度+蛋氨酸限制組的死亡率顯著高于其他組，這可能與蛋氨酸對禽類抗應(yīng)激和抗氧化的積極影響有關(guān)[21]。

3.2 飼養(yǎng)密度和不同蛋氨酸水平對肉雞血漿抗氧化指標(biāo)的影響

機(jī)體在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生過量自由基，具有強(qiáng)氧化性，可損害機(jī)體的組織和細(xì)胞[22]。而SOD和GSH-Px可以通過清除自由基防止細(xì)胞氧化損傷。SOD能夠催化自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，清除體內(nèi)過多的超氧陰離子(O2-)，抑制氧自由基級聯(lián)反應(yīng)[23]。GSH-Px是一種重要的過氧化物分解酶，能提高機(jī)體分解過氧化產(chǎn)物的能力，伴隨還原態(tài)GSH變?yōu)檠趸瘧B(tài)GSSG[24]。當(dāng)自由基未及時(shí)清除時(shí)，會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA和蛋白過氧化產(chǎn)物PCO的積累，這兩種產(chǎn)物可用于衡量機(jī)體被氧化的程度[25]。在本試驗(yàn)中，高密度飼養(yǎng)組血液T-AOC下降，同時(shí)PCO水平上升，表明肉雞產(chǎn)生了氧化應(yīng)激。蛋氨酸產(chǎn)物半胱氨酸作為谷胱甘肽的前體，在抗氧化過程中發(fā)揮重要作用。機(jī)體氧化應(yīng)激會產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，ROS經(jīng)過芬頓反應(yīng)形成的羥自由基可以通過攻擊多不飽和脂肪酸生成4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)和4-羥基己烯醛(4-hydroxyhexenal,4-HHE)。當(dāng)體內(nèi)4-HNE和4-HHE過多時(shí)，會使蛋白質(zhì)的半胱氨酸羰基化[26-27]，形成PCO。 當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，ROS產(chǎn)量增加，并激活A(yù)P1和核轉(zhuǎn)錄因子κB (nuclear transcription factor-κB,NF-κB)，增加SOD活性來抵抗細(xì)胞損傷[28]。但大量表達(dá)的SOD能表現(xiàn)出過氧化物酶活性，催化H2O2產(chǎn)生羥基自由基，對機(jī)體造成損害[29]。Sarah等[30]指出，蛋氨酸有明顯的抗氧化功能，可通過減少線粒體中ROS的產(chǎn)生而降低細(xì)胞氧化應(yīng)激。本試驗(yàn)中，高密度+蛋氨酸限制組PCO濃度最高，隨著蛋氨酸水平的提高，PCO濃度線性降低。蛋氨酸可能通過抑制蛋白質(zhì)羥基化而減輕機(jī)體氧化應(yīng)激程度[31]。有趣的是，在高密度飼養(yǎng)組，隨著飼糧蛋氨酸添加水平的上升，脂類過氧化產(chǎn)物MDA含量沒有顯著變化，GSH-Px作為清除脂類氫過氧化物的主要酶[32]，也沒有顯著變化，并且高密度飼養(yǎng)對GSH/GSSG也沒有任何影響。原因可能是SOD的高表達(dá)消耗了過多的H2O2，從而導(dǎo)致主要作用于H2O2的GSH-Px在高密度飼養(yǎng)組沒有產(chǎn)生顯著差異[33]。另一方面，密度應(yīng)激可能對蛋白質(zhì)過氧化更加敏感，而飼糧中的蛋氨酸大部分用于合成蛋白質(zhì)來滿足機(jī)體需要[34]。

3.3 飼養(yǎng)密度和不同蛋氨酸水平對肉雞血漿應(yīng)激指標(biāo)的影響

研究表明，應(yīng)激反應(yīng)主要是通過下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA)實(shí)現(xiàn)的，而CORT含量升高可作為應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志[35]。CK在細(xì)胞中的作用主要是生成ATP保證供能[36]，有研究表明，肉雞在應(yīng)激狀態(tài)時(shí)CK會從肌細(xì)胞逸入血液，血液中CK活性升高表示機(jī)體組織細(xì)胞發(fā)生損傷[37]。本試驗(yàn)中，高密度飼養(yǎng)可提高肉雞血液CORT濃度及CK活性，但沒有達(dá)到顯著水平。但當(dāng)限制飼糧蛋氨酸水平時(shí)，CK活性顯著低于0.40%、0.45%蛋氨酸組，說明限制飼糧蛋氨酸水平可以有效抑制高密度飼養(yǎng)下肉雞發(fā)生機(jī)體細(xì)胞損傷。血液TP含量受多種因素影響，其含量可以間接反映腸道對飼料蛋白質(zhì)的消化吸收程度以及利用率[38]。與正常組相比，高密度飼養(yǎng)顯著降低了TP濃度，而TP濃度隨著蛋氨酸水平的上升極顯著提高，PCO趨勢則與之相反。表明機(jī)體受到高密度氧化應(yīng)激的影響，對飼料蛋白質(zhì)的利用率下降，而蛋氨酸可以減輕過氧化的影響，提高蛋白質(zhì)利用率[39]。

3.4 飼養(yǎng)密度和不同蛋氨酸水平對肉雞肝臟損傷的影響

肝臟是重要的代謝和免疫器官，當(dāng)體內(nèi)過氧化反應(yīng)水平較高，會導(dǎo)致肝臟代謝出現(xiàn)異常，肝細(xì)胞受損后，主要存在于肝細(xì)胞中的ALT和AST會因細(xì)胞膜和線粒體結(jié)構(gòu)破壞而從細(xì)胞逸出，再進(jìn)入血液，使血清中ALT、AST活性升高[40]。LDH與肝臟衰竭有關(guān)，作為治療急性肝衰竭的靶點(diǎn)，可用于評估肝臟損傷程度[41]。HSP70作為主要的熱休克蛋白，可誘導(dǎo)性最強(qiáng)，它主要發(fā)揮分子伴侶功能，能夠結(jié)合錯誤折疊的蛋白質(zhì)并協(xié)助其正確折疊，從而快速適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化。在應(yīng)激條件下，其表達(dá)量會快速增加[42-43]。在本試驗(yàn)中，高密度飼養(yǎng)組的肝臟HSP70 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，血液中ALT活性顯著提高，表明肉雞肝臟受到應(yīng)激損傷，導(dǎo)致ALT從肝細(xì)胞逸出，而HSP70在應(yīng)激情況下被激活且高度表達(dá)，有益于抑制肝臟代謝的異常[44]。隨著飼糧中蛋氨酸水平的增加，血液AST和ALT活性呈顯著的線性提高，表明肝細(xì)胞受損程度加深。此外，肝臟HSP70的表達(dá)也隨著蛋氨酸水平的增加而顯著上調(diào)，這是機(jī)體抗損傷能力加強(qiáng)的表現(xiàn)[45]。高水平的膽固醇是心血管疾病、非酒精性脂肪肝、肥胖和糖尿病的主要危險(xiǎn)因素，HMGCR表達(dá)量則能代表體內(nèi)膽固醇合成速率[46]。HMGGR基因表達(dá)量在高密度飼養(yǎng)條件下無顯著差異，但是與正常密度對照組相比，飼糧蛋氨酸限制組和0.50%蛋氨酸組都提高了肝臟HMGGR表達(dá)，表明飼糧蛋氨酸水平過低或者過高可能都會導(dǎo)致體內(nèi)膽固醇代謝上升，對肉雞生產(chǎn)造成不利影響。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，飼養(yǎng)密度與蛋氨酸添加水平對肉雞的生產(chǎn)性能、應(yīng)激程度、抗氧化能力均產(chǎn)生了一定影響，高密度飼養(yǎng)可引起肉雞的應(yīng)激反應(yīng)和肝臟損傷。在高密度飼養(yǎng)條件下，限制飼糧蛋氨酸水平會降低肉雞對蛋白質(zhì)的利用，使料重比和死亡率升高；而蛋氨酸水平較高(0.50%)時(shí)也會產(chǎn)生一定的肝臟損傷；飼糧蛋氨酸水平在0.45%時(shí)有較好的抗應(yīng)激、抗氧化效果，有益于肉雞生長。