李玉龍，呂世杰，翟亞瑩，張志杰，朱肖亭，張子敬，陳付英，施巧婷，王二耀

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南省畜禽繁育與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

郟縣紅牛雖然具有耐粗飼等特點(diǎn)，但其與國(guó)外專(zhuān)門(mén)化的肉牛品種相比，其生長(zhǎng)發(fā)育速度緩慢、肉用性能低[1]。隨著消費(fèi)者對(duì)牛肉需求量的增加，提高中國(guó)本土良種肉牛的生產(chǎn)力迫在眉睫。因此，為提高郟縣紅牛的生長(zhǎng)潛能，呂世杰等[2-3]利用選擇性清除方法發(fā)現(xiàn)，DNA聚合酶β(DNA polymerase beta，POLB)基因位于郟縣紅牛和安格斯牛兩品種間差異的基因組區(qū)域中，并位于牛日增重相關(guān)QTL(QTL 69373)內(nèi)[4-5]，推測(cè)POLB基因可能與牛肌肉發(fā)育相關(guān)。

POLB基因是1971年Weissbach等[6]首次從牛胸腺中分離出的一種DNA聚合酶，該基因是真核細(xì)胞中最小的DNA多聚酶，其蛋白分子質(zhì)量?jī)H為39 ku[7]。POLB屬于DNA聚合酶X家族中的一員，這些DNA聚合酶的家族成員在DNA復(fù)制、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控中起重要作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，降低食管癌細(xì)胞(EC9706)中POLB基因的表達(dá)量，會(huì)導(dǎo)致該細(xì)胞生物學(xué)特性發(fā)生改變，從而抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。采用RNA干擾技術(shù)抑制乳癌細(xì)胞(MCF-7)中POLB基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的增殖也受到顯著抑制[10]。沈亮[11]研究發(fā)現(xiàn)，POLB基因可能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)MCF-7的增殖和遷移進(jìn)行調(diào)控。朱艷艷[12]利用甲基芐基亞硝胺(N-nitrosomethylbenzylamine，NMBA)分別誘導(dǎo)POLB基因敲除的小鼠食管上皮組織，經(jīng)mRNA轉(zhuǎn)錄組芯片及差異表達(dá)基因GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，有33個(gè)差異表達(dá)的基因與細(xì)胞增殖調(diào)控相關(guān)，有27個(gè)差異表達(dá)的基因與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)，其中涉及到PI3K-Akt、MAPK-ERK、PLK1/CENP-A[13-14]等信號(hào)通路。以上報(bào)道表明，POLB基因表達(dá)量的變化與細(xì)胞的增殖、凋亡、周期調(diào)控等活動(dòng)關(guān)系密切。因此，本研究通過(guò)克隆牛POLB基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為進(jìn)一步探究POLB基因生物學(xué)功能與調(diào)控機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 5頭18月齡郟縣紅牛來(lái)源于河南省平頂山市郟縣紅牛良種繁育中心。在屠宰場(chǎng)處死后，采集其背最長(zhǎng)肌組織，立即放入液氮中冷凍，帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 載體和感受態(tài)細(xì)胞 pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 主要試劑及儀器 TRIzol試劑和Trans2K?DNA Marker均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；KOD OneTMPCR Master Mix-Blue購(gòu)自東洋紡(上海)生物科技有限公司。PCR擴(kuò)增儀(6325ZO810735)和微量移液槍均購(gòu)自Eppendorf公司；微量紫外分光度計(jì)(NanoDrop 2000)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；電泳儀(DYY-6C)購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)、合成及反轉(zhuǎn)錄 參考GenBank中公布的牛(Bostaurus)POLB基因序列(登錄號(hào)：NC_037354.1)，利用Oligo 7.0設(shè)計(jì)普通PCR引物。上游引物序列：5′-ATGAGCAAACGG-AAGGCGCCGCAGGAGA-3′；下游引物序列：5′-GTGAGCCCAAGGACCGAAGCGAG-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用TRIzol提取郟縣紅牛背最長(zhǎng)肌組織總RNA，利用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量，要求A260 nm/A280 nm值介于1.8～2.0、A260 nm/A230 nm值介于2.0～2.3，-80 ℃保存?zhèn)溆谩＠梅崔D(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增及克隆 以郟縣紅牛背最長(zhǎng)肌cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系50 μL：上、下游引物各1.5 μL，KOD OneTMPCR Master Mix-Blue 25 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性15 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的片段后連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在LB固體培養(yǎng)基上涂板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)(12 h)，挑選陽(yáng)性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 通過(guò)NCBI在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)查找基因序列和氨基酸序列信息；利用Mega 7.0軟件和BLAST(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)程序進(jìn)行遺傳距離分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，各物種POLB蛋白具體登錄信息見(jiàn)表1；利用ExPASy(http:∥web.expasy.org/tools)在線(xiàn)軟件進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)和疏水性分析；利用NetPhos 3.1 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)POLB蛋白磷酸化位點(diǎn)；利用TMHMM(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)POLB蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；利用SignaIP(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)在線(xiàn)軟件分析POLB蛋白信號(hào)肽；利用SOPMA(http:∥npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html)在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)POLB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODE(swissmodel.expasy.org)在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)POLB蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SMART(smart.embl-heidelberg.de)在線(xiàn)軟件分析POLB蛋白功能結(jié)構(gòu)域；利用STRING(version11.string-db.org)在線(xiàn)軟件分析POLB蛋白的互作蛋白(設(shè)定最小所需相互作用評(píng)分>0.4)。

表1 13個(gè)不同物種POLB蛋白登錄信息

2 結(jié) 果

2.1 POLB基因克隆結(jié)果

以郟縣紅牛背最長(zhǎng)肌cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，產(chǎn)物大小在1 008 bp左右(圖1)，與預(yù)期片段大小相符。單克隆抗體菌液目的條帶單一且清晰，克隆測(cè)序得到的郟縣紅牛POLB基因CDS區(qū)長(zhǎng)度為1 008 bp，測(cè)序結(jié)果與NCBI上POLB基因的序列相似性為100%。

圖1 郟縣紅牛POLB基因CDS區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of CDS region of POLB gene in Jiaxian Red cattle

2.2 遺傳距離分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

將郟縣紅牛POLB氨基酸序列與綿羊、中國(guó)水牛等12個(gè)物種的氨基酸序列進(jìn)行遺傳距離分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。結(jié)果顯示，郟縣紅牛與綿羊等反芻動(dòng)物的遺傳距離最近，與其他哺乳類(lèi)動(dòng)物和禽類(lèi)次之，與斑馬魚(yú)最遠(yuǎn)(表2)；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，郟縣紅牛與綿羊等反芻動(dòng)物的親緣關(guān)系最近，與其他哺乳類(lèi)動(dòng)物和禽類(lèi)次之，與斑馬魚(yú)(魚(yú)類(lèi))最遠(yuǎn)(圖2)。

表2 POLB基因氨基酸序列遺傳距離分析

圖2 POLB氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of POLB amino acid sequences

2.3 理化性質(zhì)分析

利用ProtParam在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)郟縣紅牛POLB基因CDS區(qū)發(fā)現(xiàn)，其編碼335個(gè)氨基酸，由20種氨基酸組成，其中賴(lài)氨酸(Lys)所占比例最大，為10.7%，色氨酸(Trp)所占比例最小為0.3%，不含吡咯賴(lài)氨酸(Ply)和硒半胱氨酸(Sec)(表3)，負(fù)電荷殘基總數(shù)天冬氨酸(Asp)+谷氨酸(Glu)為49，正電荷殘基總數(shù)精氨酸(Arg)+賴(lài)氨酸(Lys)為57。 郟縣紅牛POLB蛋白分子式為C1699H2721N475O509S10，分子質(zhì)量為38.26 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為9.10，半衰期為30 h；肽鏈N-端為甲硫氨酸(Met)，不穩(wěn)定系數(shù)為31.06(<40)，屬于穩(wěn)定蛋白，脂溶指數(shù)為78.30(<80)，為非脂溶性蛋白。

2.4 疏水性預(yù)測(cè)

利用ProtScale在線(xiàn)軟件對(duì)郟縣紅牛POLB蛋白進(jìn)行疏水性分析發(fā)現(xiàn)，在第177位氨基酸處出現(xiàn)最高值1.400，在第403位氨基酸處出現(xiàn)最低值-3.278，總平均親水系數(shù)為-0.659，為親水性蛋白(圖3)。

2.5 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用NetPhos 3.1 Server在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)郟縣紅牛POLB蛋白磷酸化位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，POLB蛋白含17個(gè)絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)、12個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)和4個(gè)酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)(圖4)。

2.6 POLB蛋白跨膜區(qū)及信號(hào)肽預(yù)測(cè)

利用TMHMM在線(xiàn)軟件對(duì)郟縣紅牛POLB蛋白跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，POLB蛋白不存在跨膜螺旋結(jié)構(gòu)(圖5)；采用SignalP在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)信號(hào)肽發(fā)現(xiàn)，該蛋白沒(méi)有信號(hào)肽(圖6)。 表明郟縣紅牛POLB蛋白不屬于跨膜蛋白和分泌型蛋白。

表3 郟縣紅牛POLB蛋白氨基酸組成

圖3 郟縣紅牛POLB蛋白疏水性分析Fig.3 Hydrophobicity analysis of POLB protein in Jiaxian Red cattle

圖4 郟縣紅牛POLB蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.4 Phosphorylation site prediction of POLB protein in Jiaxian Red cattle

圖5 郟縣紅牛POLB蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)Fig.5 Transmembrane structure prediction of POLB protein in Jiaxian Red cattle

圖6 郟縣紅牛POLB蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.6 Signal peptide prediction of POLB protein in Jiaxian Red cattle

2.7 二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

運(yùn)用SOPMA在線(xiàn)軟件對(duì)郟縣紅牛POLB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，POLB蛋白主要包含α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲4種結(jié)構(gòu)，分別占48.96%、2.99%、12.84%和35.22%(圖7)。通過(guò)SWISS-MODE在線(xiàn)軟件對(duì)郟縣紅牛POLB蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，其與人POLB蛋白序列的一致性高達(dá)98.21%(>30%)，預(yù)測(cè)結(jié)果可用；GMQE值為0.92，QMEAN4值為1.07，模型準(zhǔn)確度可信(圖8)。

①h，α-螺旋；t，β-轉(zhuǎn)角；c，無(wú)規(guī)則卷曲；e，延伸鏈。②線(xiàn)條按照從長(zhǎng)到短依次代表α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲① h,Alpha helix;t,Beta turn;c,Random coil;e,Extended chain.②The lines represent alpha helix,extended chain,beta turn and random coil by the length,respectively圖7 郟縣紅牛POLB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Secondary structure prediction of POLB protein in Jiaxian Red cattle

圖8 郟縣紅牛POLB蛋白三級(jí)結(jié)預(yù)測(cè)Fig.8 Tertiary structure prediction of POLB protein in Jiaxian Red cattle

2.8 功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)及蛋白互作分析

運(yùn)用SMART在線(xiàn)軟件對(duì)郟縣紅牛POLB進(jìn)行蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，POLB蛋白由335個(gè)氨基酸構(gòu)成，包括2個(gè)螺旋-發(fā)卡-螺旋(helix-hairpin-helix,HhH)重復(fù)結(jié)構(gòu)基序(圖9)。利用STRING在線(xiàn)軟件進(jìn)行互作蛋白分析結(jié)果表明，X-射線(xiàn)修復(fù)交聯(lián)-補(bǔ)充基因1(X-rayrepair cross-complementing gene 1，XRCC1)、瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶1(FEN1)、多聚ADP-核糖聚合酶1(poly ADP-ribose polymerase 1，PARP1)和DNA連接酶Ⅲ(LIG3)等與POLB蛋白具有強(qiáng)相關(guān)性(評(píng)分>0.900)，其中與XRCC1蛋白互作程度最高，評(píng)分為0.995(圖10)。

圖9 郟縣紅牛POLB蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.9 Functional domain prediction of POLB protein in Jiaxian Red cattle

圖10 與郟縣紅牛POLB蛋白互作的蛋白預(yù)測(cè)Fig.10 Protein prediction of interaction with POLB protein in Jiaxian Red cattle

3 討 論

POLB基因所在的DNA修復(fù)基因與癌基因、抑癌基因、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因以及細(xì)胞凋亡基因共同維持著細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性和完整性。POLB主要功能是通過(guò)參與堿基切除修復(fù)(base excision repair,BER)系統(tǒng)對(duì)DNA損傷進(jìn)行修復(fù)。DNA損傷在細(xì)胞中如不能得到有效修復(fù)，易導(dǎo)致細(xì)胞的衰老、凋亡和癌變[15]。在小鼠食管癌細(xì)胞和人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中，沉默或降低POLB基因的表達(dá)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，導(dǎo)致有絲分裂異常，促進(jìn)細(xì)胞增殖[16-17]。Baguma-Nibasheka等[18]研究發(fā)現(xiàn)，POLB基因在成肌調(diào)節(jié)因子(MyoD)基因缺失小鼠肌肉中比在正常小鼠顯著高表達(dá)；POLB蛋白R(shí)137Q位點(diǎn)突變導(dǎo)致POLB結(jié)構(gòu)變化并引起蛋白功能受損，可造成小鼠胎兒在15.5、17.5和19.5 d的體重顯著降低[19]，表明POLB基因可能參與肌肉的發(fā)育過(guò)程。

本研究克隆了郟縣紅牛POLB基因CDS區(qū)，結(jié)果顯示，POLB基因蛋白編碼區(qū)堿基序列長(zhǎng)1 008 bp,共編碼335個(gè)氨基酸，與人的POLB蛋白氨基酸組成一致[20]。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，郟縣紅牛與綿羊的親緣關(guān)系最近，與哺乳動(dòng)物的親緣關(guān)系較雞和斑馬魚(yú)更近，推測(cè)POLB基因在哺乳動(dòng)物中可能具有相似的功能。Chang等[21]也研究發(fā)現(xiàn)POLB在哺乳類(lèi)動(dòng)物中的同源性以及在結(jié)構(gòu)進(jìn)化過(guò)程中相當(dāng)保守，說(shuō)明其在哺乳類(lèi)動(dòng)物中功能相似。理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，POLB蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為31.06，脂溶指數(shù)為78.30，親水系數(shù)為―0.659，屬于穩(wěn)定的親水性蛋白。其蛋白分子質(zhì)量為38.26 ku，與人POLB蛋白的分子質(zhì)量(39 ku)接近[7]。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，郟縣紅牛POLB蛋白具有33個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中17個(gè)為絲氨酸磷酸化位點(diǎn)和12個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)。Tokui等[22]研究發(fā)現(xiàn)，POLB被蛋白激酶C磷酸化會(huì)造成POLB活性喪失。蛋白激酶C通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的蘇氨酸和絲氨酸羥基進(jìn)行磷酸化來(lái)調(diào)控蛋白活性[23]，其是否影響牛POLB蛋白磷酸化需要進(jìn)一步驗(yàn)證研究。對(duì)郟縣紅牛POLB蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)表明，POLB蛋白不是分泌蛋白。在細(xì)胞內(nèi)定位研究發(fā)現(xiàn)，POLB蛋白主要在細(xì)胞核中發(fā)揮BER功能[24-25]，這與本研究預(yù)測(cè)結(jié)果是一致的。

郟縣紅牛POLB蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最高，說(shuō)明該結(jié)構(gòu)為POLB蛋白的重要構(gòu)件。蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，郟縣紅牛POLB蛋白與人POLB蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的相似度高達(dá)98.21%。Tanabe等[26]從多種哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞中提取POLB蛋白并測(cè)定其分子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)POLB蛋白的分子結(jié)構(gòu)大致相同，表明POLB蛋白在哺乳動(dòng)物中發(fā)揮可能類(lèi)似生物學(xué)功能。郟縣紅牛POLB蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其包括2個(gè)螺旋-發(fā)卡-螺旋重復(fù)結(jié)構(gòu)基序。Beard[27]結(jié)果表明，在人體中POLB蛋白的螺旋-發(fā)卡-螺旋結(jié)構(gòu)是參與DNA作用的重要區(qū)域，表明POLB蛋白在哺乳動(dòng)物中發(fā)揮類(lèi)似的生物學(xué)功能。

有研究表明，在BER途徑中XRCC1和PARP1這2種蛋白都可以與POLB蛋白結(jié)合[21]。POLB和XRCC1蛋白結(jié)合過(guò)程中，XRCC1還可與PARP1形成二聚體包裹DNA損傷的斷裂位點(diǎn)，進(jìn)而防止核酸酶消化，增強(qiáng)細(xì)胞抗凋亡的能力[28]。此外，在小鼠中敲除POLB和XRCC1基因均會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡[29-30]。本研究對(duì)郟縣紅牛POLB蛋白的互作蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，XRCC1、FEN1、PARP1和LIG3與POLB蛋白具有強(qiáng)相關(guān)性，其中與XRCC1蛋白互作程度最高。因此，在深入研究牛POLB蛋白功能時(shí)應(yīng)重視XRCC1蛋白的影響。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆了郟縣紅牛POLB基因，其全長(zhǎng)為1 008 bp，編碼335個(gè)氨基酸，其氨基酸序列與綿羊等反芻動(dòng)物的親緣關(guān)系最近，與其他哺乳類(lèi)動(dòng)物和禽類(lèi)次之，與斑馬魚(yú)(魚(yú)類(lèi))最遠(yuǎn)；郟縣紅牛POLB蛋白穩(wěn)定、不存在跨膜螺旋結(jié)構(gòu)、沒(méi)有信號(hào)肽；與XRCC1蛋白互作程度最高，結(jié)果可為進(jìn)一步研究牛POLB基因的生物學(xué)功能與調(diào)控機(jī)理提供參考。