宮淑娟，史瑞軍，吳庭輝，李樹偉

(塔里木大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，阿拉爾 843300)

綿羊毛近年來被廣泛應(yīng)用于服裝、地毯等行業(yè)[1]。和田羊產(chǎn)于新疆南疆地區(qū)，其羊毛是制造各類和田地毯的最佳原料[2]，但和田手工地毯面臨的突出問題是優(yōu)質(zhì)半粗毛毛源不足[3]?？ɡ瓗鞝栄蚴且陨a(chǎn)羔皮為主的，其羊毛屬異質(zhì)粗毛，是生產(chǎn)各類紡織品的原料[4]。和田羊和卡拉庫爾羊?qū)δ辖锬镜貐^(qū)嚴(yán)酷的自然環(huán)境具有強(qiáng)大的適應(yīng)能力，是該地區(qū)不可替代的當(dāng)家綿羊品種[5]。因此，研究參與調(diào)控羊毛性狀的基因?qū)μ嵘吞镅蚝涂ɡ瓗鞝栄蜓蛎a(chǎn)量和品質(zhì)進(jìn)而推動(dòng)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要價(jià)值。

羊毛纖維主要由硬α-角蛋白組成，主要成分為角蛋白中間絲蛋白(keratin intermediate filament protein，KIF)和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(keratin-associated protein，KAP)[6]。KAP的特點(diǎn)是含有異常高的半胱氨酸或甘氨酸和酪氨酸殘基，根據(jù)其氨基酸組成可分為3類[7]。目前發(fā)現(xiàn)的所有KAPs都含有半胱氨酸，而半胱氨酸與角蛋白中間絲可形成二硫鍵交聯(lián)[8]。 李志剛等[9]成功克隆和田羊KAP6.1、KAP7、KAP8基因并在原核細(xì)胞中表達(dá)；余路菲等[10]成功構(gòu)建了山區(qū)型和田羊毛囊KAP1.1基因真核表達(dá)載體，并獲得基因與蛋白序列；武振輝等[11]克隆了山區(qū)型和田羊毛囊KIF2.9基因，發(fā)現(xiàn)山區(qū)型和田羊與美利奴羊的羊毛類型存在差異；金梅等[12]研究發(fā)現(xiàn)，KAP7.1、KAP8.2基因在興盛期遼寧絨山羊次級(jí)毛囊中的表達(dá)量高于初級(jí)毛囊，而在退行期則相反；Sulayman等[13]研究表明，KIF基因是影響羊毛性狀的重要候選基因，為綿羊育種和羊毛品質(zhì)改良提供了分子基礎(chǔ)；Shanaz等[14]報(bào)道，KIF基因變異會(huì)影響KAP的結(jié)構(gòu)，從而影響纖維特性。KAP11.1是唯一表現(xiàn)出強(qiáng)表達(dá)且在晚期基質(zhì)和整個(gè)皮層中表達(dá)的基因，是KAP11家族中唯一已知的基因成員[15]，它的蛋白可能無結(jié)構(gòu)或部分無結(jié)構(gòu)[16]。朱建勛等[17]認(rèn)為，KAP11.1是影響羊毛經(jīng)濟(jì)性狀的主要候選基因，可能會(huì)影響羊毛纖維結(jié)構(gòu)。KAP11.1屬于高硫蛋白，序列高度保守，高硫KAP通過與角蛋白豐富的半胱氨酸殘基的二硫鍵交聯(lián)或與角蛋白的疏水區(qū)相互作用，對(duì)毛干的形成至關(guān)重要[18]。綜上，KAP基因可影響毛發(fā)品質(zhì)，是提高羊毛經(jīng)濟(jì)性狀的重要基因，因此，研究KAP11.1基因?qū)μ嵘蛎a(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義，然而目前對(duì)KAP11.1基因在新疆南疆地方綿羊品種中的毛囊發(fā)育機(jī)制研究甚少。鑒于此，本研究擬對(duì)平原型和田羊、山區(qū)型和田羊和卡拉庫爾羊KAP11.1基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析，構(gòu)建原核表達(dá)載體，檢測KAP11.1基因在3種綿羊中的表達(dá)差異，為進(jìn)一步研究KAP11.1基因在決定羊毛性狀方面的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 3只平原型和田羊購自新疆和田地區(qū)洛浦縣；3只山區(qū)型和田羊購自新疆和田地區(qū)策勒縣；3只卡拉庫爾羊購自新疆農(nóng)一師12團(tuán)。每只綿羊于肩胛骨后緣左側(cè)中線上方10 cm處剃毛，局部麻醉后取直徑為1 cm的皮膚樣品，于液氮中保存?zhèn)溆?，后續(xù)用藥護(hù)理直至痊愈，整個(gè)過程嚴(yán)格遵循動(dòng)物福利倫理要求。

1.1.2 主要試劑及儀器 限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ、pMD19-T克隆載體、pET-28a(+)原核表達(dá)載體及大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均購自TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自全式金生物技術(shù)有限公司；5×蛋白上樣緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司；膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

梯度PCR儀(Veriti)購自ABI公司；超微量分光光度計(jì)(NanoDrop One)購自賽默飛世爾科技公司；凝膠成像系統(tǒng)(GELDOC 2000)購自Bio-Rad公司；藍(lán)光切膠儀(G500312)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 依照GenBank中綿羊KAP11.1基因序列(登錄號(hào)：HQ595347.1)，利用DNAStar軟件設(shè)計(jì)引物，以18S rRNA(登錄號(hào)：KF703715.1)為內(nèi)參基因，普通PCR引物上、下游引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，引物信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增 用Trizol法對(duì)3種綿羊皮膚組織樣品提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以得到的cDNA為模板擴(kuò)增KAP11.1基因CDS區(qū)。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×TaqMasterMix(Dye Plus) 10 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

1.2.3 克隆 膠回收KAP11.1基因片段，與pMD19-T載體進(jìn)行連接，構(gòu)建pMD19-T-KAP11.1克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板(氨芐抗性)，藍(lán)白斑鑒定后挑取白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行菌液PCR鑒定，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。雙酶切體系10 μL：pMD19-T-KAP11.1質(zhì)粒7 μL，10×Quickcut Green Buffer 1 μL，QuickcutBamH Ⅰ 1 μL，QuickcutHind Ⅲ 1 μL，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR及酶切產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1.2.4 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-KAP11.1構(gòu)建與鑒定 分別雙酶切pET-28a(+)和克隆質(zhì)粒pMD19-T-KAP11.1，將回收后的pET-28a(+)片段和KAP11.1基因片段16 ℃連接過夜，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-KAP11.1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板(卡那抗性)，挑取白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行菌液PCR鑒定，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。 雙酶切體系10 μL：pET-28a(+)-KAP11.1質(zhì)粒7 μL，10×Quickcut Green Buffer 1 μL，QuickcutBamH Ⅰ 1 μL，QuickcutHind Ⅲ 1 μL。PCR及酶切產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定,將鑒定正確的pET-28a(+)-KAP11.1重組質(zhì)粒陽性菌送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 運(yùn)用BLAST程序和MegAlign軟件對(duì)3種綿羊KAP11.1基因序列和GenBank中綿羊(Ovisaries，登錄號(hào)：HQ595347.1)、白尾鹿德克薩斯亞種(Odocoileusvirginianustexanus，登錄號(hào)：XM_020914491.1)、加拿大馬鹿(Cervuscanadensis，登錄號(hào)：XM_043449100.1)、瘤牛(Bosindicus，登錄號(hào)：XM_019967059.1)、美洲草原野牛(Bisonbisonbison，登錄號(hào)：XM_010855840.1)、山羊(Caprahircus，登錄號(hào)：JQ795995.1、NM_001286757.1)、水牛(Bubalusbubalis，登錄號(hào)：XM_006053846.2)和彎角大羚羊(Oryxdammah，登錄號(hào)：XM_040227916.1)進(jìn)行相似性比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用ProtParam在線軟件(https:∥web.expasy.org/protparam/)對(duì)KAP11.1蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析；利用SOPMA(http:∥https:∥npsa-prabi.ibcp.fr∥)和SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/interactive)在線軟件對(duì)KAP11.1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.2.6 SDS-PAGE及Western blotting 將pET-28a(+)-KAP11.1原核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂板(卡那抗性)，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性菌擴(kuò)大培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)4 h，收集菌液，12 000 r/min離心2 min，棄上清；加入200 μL PBS混勻，12 000 r/min離心2 min，棄上清；加入160 μL PBS和40 μL 5×蛋白上樣混勻，100 ℃煮10 min，室溫放置，做SDS-PAGE電泳鑒定，電泳上樣量15 μL。SDS-PAGE完成后進(jìn)行Western blotting檢測，200 mA、90 min濕轉(zhuǎn)至NC

膜，將膜置于5%封閉液中封閉1 h后放入一抗中緩慢振蕩1 h，TBST洗脫，接著放入二抗中緩慢振蕩45 min，TBST洗脫后成像。

1.2.7KAP11.1基因在3種綿羊皮膚毛囊中的表達(dá) 以18S rRNA為內(nèi)參基因，以表1中引物對(duì)3種綿羊皮膚毛囊KAP11.1基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。 PCR反應(yīng)體系20 μL：2×TaqMasterMix 10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 7 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。 熔解階段溫度設(shè)置在65～95 ℃。用2-△△Ct法處理數(shù)據(jù)，用GraphPad Prism 8單因素方差分析方法整理數(shù)據(jù)并繪圖，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 KAP11.1基因PCR擴(kuò)增

以3種綿羊皮膚毛囊cDNA為模板，成功擴(kuò)增出片段大小約為480 bp的目的條帶(圖1)，無明顯雜帶，與預(yù)期結(jié)果一致。

1,陰性對(duì)照；M，DL2000 DNA Marker；2，山區(qū)型和田羊；3，平原型和田羊；4，卡拉庫爾羊1,Negative control;M，DL2000 DNA Marker;2，Mountain-type Hetian sheep;3，Plain-type Hetian Sheep；4，Karakul sheep圖1 KAP11.1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of KAP11.1 gene

2.2 克隆質(zhì)粒pMD19-T-KAP11.1的鑒定

分別雙酶切pMD19-T載體和克隆質(zhì)粒pMD19-T-KAP11.1，結(jié)果顯示，pMD19-T條帶大小約為2 692 bp，KAP11.1基因條帶約為480 bp(圖2)，說明克隆質(zhì)粒pMD19-T-KAP11.1構(gòu)建成功。

1,pMD19-T載體；M，Trans5K? DNA Marker；2，山區(qū)型和田羊；3，平原型和田羊；4，卡拉庫爾羊1，pMD19-T vector;M，Trans5K? DNA Marker;2，Mountain-type Hetian sheep;3，Plain-type Hetian Sheep;4，Karakul sheep圖2 克隆質(zhì)粒pMD19-T-KAP11.1的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of the cloned plasmid pMD19-T-KAP11.1 by double digestion

2.3 表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-KAP11.1的鑒定

分別雙酶切pET-28a(+)載體和表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-KAP11.1，結(jié)果顯示，pET-28a(+)條帶大小約為5 369 bp，KAP11.1條帶約為480 bp(圖3)，說明表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-KAP11.1構(gòu)建成功。

2.4 KAP11.1基因相似性分析

將3種綿羊測序結(jié)果與GenBank中綿羊KAP11.1基因序列(登錄號(hào)：HQ595347.1)進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，平原型和田羊和山區(qū)型和田羊基因序列的相似性均為99.79%，均為423 bp處發(fā)生突變，由C變?yōu)門，卡拉庫爾羊基因序列的相似性為99.38%，其69 bp處G變?yōu)門、93 bp處C變?yōu)門、423 bp處C變?yōu)門(圖4)。

山區(qū)型和田羊、平原型和田羊與白尾鹿德克薩斯亞種、加拿大馬鹿、瘤牛、美洲草原野牛、山羊(登錄號(hào)：JQ795995.1)、山羊(登錄號(hào)：NM_001286757.1)、水牛和彎角大羚羊的相似性均分別為96.7%、95.8%、95.2%、95.4%、98.8%、99.0%、95.8%和97.9%；卡拉庫爾羊與以上物種的相似性分別為96.2%、95.4%、94.8%、95.0%、98.3%、98.5%、95.4%和97.5%(圖5)。

1,pET-28a(+)載體；M，Trans2K? Plus Ⅱ DNA Marker；2，山區(qū)型和田羊；3，平原型和田羊；4，卡拉庫爾羊1,pET-28a(+) vector;M，Trans2K? Plus Ⅱ DNA Marker;2，Mountain-type Hetian sheep;3，Plain-type Hetian sheep;4，Karakul sheep圖3 表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-KAP11.1的雙酶切鑒定Fig.3 Identification of expression plasmid pET-28a(+)-KAP11.1 by double digestion

圖4 3種綿羊KAP11.1基因序列比對(duì)結(jié)果Fig.4 Alignment results of KAP11.1 gene sequences in 3 sheep breeds

圖5 KAP11.1基因核苷酸序列相似性分析Fig.5 Nucleotide similarity analysis of KAP11.1 gene

2.5 KAP11.1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

利用Mega-X軟件對(duì)3種綿羊序列與GenBank中綿羊及其他物種間構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖6。由圖6可知，平原型和田羊、山區(qū)型和田羊、卡拉庫爾羊與GenBank中綿羊、山羊親緣關(guān)系最近，彎角大羚羊次之，它們均由同一支分化而來，與加拿大馬鹿和白尾鹿德克薩斯亞種親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)，與水牛、美洲草原野牛和瘤牛親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖6 KAP11.1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of KAP11.1 gene

2.6 生物信息學(xué)分析

2.6.1 理化性質(zhì) 用ProtParam在線軟件對(duì)KAP11.1蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，山區(qū)型和田羊、平原型和田羊和卡拉庫爾羊與綿羊均編碼159個(gè)氨基酸，脂肪系數(shù)和理論等電點(diǎn)相同，不穩(wěn)定系數(shù)略有差異，但均在61左右(>40)，為不穩(wěn)定蛋白(表2)。

2.6.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu) 對(duì)3種綿羊KAP11.1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，均由延伸鏈(8.18%)和無規(guī)則卷曲(91.82%)組成，但均沒有預(yù)測到α-螺旋和β-折疊(圖7)。通過BLAST比對(duì)找到與KAP11.1蛋白相似性為98.11%的山羊(登錄號(hào)：NM_001286757.1)序列，以它作為KAP11.1蛋白的參考模板進(jìn)行同源建模，蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果見圖8。

表2 KAP11.1蛋白理化性質(zhì)分析

c、長線條，無規(guī)則卷曲；e、短線條，延伸鏈c and the long line，Random coil；e and the short line,Extended strand圖7 KAP11.1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Secondary structure prediction of KAP11.1 protein

圖8 KAP11.1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.8 Tertiary structure prediction of KAP11.1 protein

2.7 KAP11.1基因原核表達(dá)及檢測

將pET-28a(+)-KAP11.1陽性重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后提純蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting檢測，在約19 ku處出現(xiàn)目的條帶(圖9、10)，與預(yù)期結(jié)果一致，說明KAP11.1基因可在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá)。

2.8 KAP11.1基因在不同綿羊皮膚毛囊中的表達(dá)

對(duì)3種綿羊KAP11.1基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，得到熔解曲線均有單一的信號(hào)峰，說明引物特異性較好。由圖11可知，KAP11.1基因在山區(qū)型和田羊和卡拉庫爾羊毛囊中的表達(dá)量顯著高于平原型和田羊(P<0.05)，山區(qū)型和田羊和卡拉庫爾羊差異不顯著(P>0.05)。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，pET-28a(+)；2，山區(qū)型和田羊；3，平原型和田羊；4，卡拉庫爾羊M，Protein Marker；1，pET-28a(+)；2，Mountain-type Hetian sheep；3，Plain-type Hetian sheep；4，Karakul sheep圖9 KAP11.1蛋白SDS-PAGE檢測Fig.9 SDS-PAGE detection of KAP11.1 protein

1，山區(qū)型和田羊；2，平原型和田羊；3，卡拉庫爾羊1,Mountain-type Hetian sheep；2，Plain-type Hetian sheep；3，Karakul sheep圖10 KAP11.1蛋白Western blotting檢測Fig.10 Western blotting detection of KAP11.1 protein

肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05);肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Values with different letter superscripts mean significant difference(P<0.05)；While with the same letter superscripts mean no significant difference(P>0.05)圖11 KAP11.1基因在3種綿羊皮膚毛囊中的表達(dá)量Fig.11 Expression of KAP11.1 gene in skin follicles of 3 sheep breeds

3 討 論

KAP11.1基因在綿羊皮膚組織中的表達(dá)類似于β-actin，在調(diào)節(jié)羊毛纖維直徑中起重要作用[19]，羊毛的主要成分為角蛋白，它的化學(xué)結(jié)構(gòu)決定羊毛的特性，并由KAPs基因家族編碼[20]。蘇波[21]研究表明，KAPs含量及與角蛋白互作形成的交聯(lián)結(jié)構(gòu)影響羊毛的理化性質(zhì)，進(jìn)而決定羊毛品質(zhì)。KAP基因能影響羊毛品質(zhì)，可作為調(diào)控羊毛品質(zhì)的候選基因[22]。本研究成功克隆了平原型和田羊、山區(qū)型和田羊和卡拉庫爾羊KAP11.1基因的完整CDS區(qū)，全長480 bp，將3種綿羊基因測序結(jié)果與參照序列進(jìn)行比對(duì)，平原型和田羊和山區(qū)型和田羊核苷酸序列相似性高達(dá)99.79%，卡拉庫爾羊核苷酸序列相似性為99.38%，三者序列均高度保守。研究發(fā)現(xiàn)，KAPs基因核苷酸序列變異與山羊的產(chǎn)絨性狀密切相關(guān)[23]，絨山羊KAP26-1基因核苷酸序列的變異可能對(duì)產(chǎn)絨性能有影響[24]。說明KAP基因的核苷酸變異可能是影響羊毛品質(zhì)的因素之一。3種綿羊均編碼159個(gè)氨基酸，含有大量的半胱氨酸、絲氨酸和纈氨酸，其含有的半胱氨酸可通過二硫鍵和KIF交聯(lián)進(jìn)而影響羊毛性狀[25]，由于密碼子的簡并性，編碼的氨基酸幾乎沒有改變，這是一種同義突變，可能是由品種不同引起的[26]，具體原因有待進(jìn)一步確認(rèn)。

對(duì)所得序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，平原型和田羊、山區(qū)型和田羊、卡拉庫爾羊和參照序列及兩種山羊相似性最高，與瘤牛和美洲草原野牛遺傳距離最遠(yuǎn)，和田羊和卡拉庫爾羊雖然在毛色和個(gè)體大小上有差異，但從同一支分化而來，相似性最高，親緣關(guān)系最近，這說明親緣關(guān)系越近，相似性越高，符合物種進(jìn)化規(guī)律?？ɡ瓗鞝栄騅AP11.1基因分子質(zhì)量為41 037.12 u，原子總數(shù)為5 083，不穩(wěn)定系數(shù)為61.49，均高于平原型和田羊和山區(qū)型和田羊。3種綿羊KAP11.1基因不穩(wěn)定系數(shù)略有差異，為不穩(wěn)定的疏水蛋白。KAP11.1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)無α-螺旋和β-折疊，由延伸鏈和無規(guī)則卷曲組成，不含有α-螺旋的原因可能與蛋白的親/疏水性及脯氨酸含量有關(guān)[10,27]。對(duì)3種綿羊KAP11.1蛋白預(yù)測沒發(fā)現(xiàn)三級(jí)結(jié)構(gòu)，這可能是由于其二級(jí)結(jié)構(gòu)缺少α-螺旋造成的，所以用蛋白相似度高的序列進(jìn)行了同源建模來推測其蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。KAP11.1基因在3種綿羊中理化性質(zhì)的差異可能引起羊毛性狀的差異。

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)KAP11.1基因在平原型和田羊、山區(qū)型和田羊和卡拉庫爾羊毛囊中的表達(dá)量變化進(jìn)行探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KAP11.1基因在山區(qū)型和田羊和卡拉庫爾羊毛囊中的表達(dá)量均顯著高于平原型和田羊，而在山區(qū)型和田羊和卡拉庫爾羊中差異不顯著。據(jù)報(bào)道，KAP11.1基因在初級(jí)毛囊、次級(jí)毛囊以及毛囊的不同部位中表達(dá)量差異明顯[19,28]；KAP13.3和KRT17基因表達(dá)量在山區(qū)型和田羊中最高，卡拉庫爾羊次之，平原型和田羊最低[29]，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。山區(qū)型和田羊毛囊密度大于平原型和田羊[30]，羊毛細(xì)度、油脂含量和凈毛率也優(yōu)于平原型和田羊[31]，山區(qū)型和田羊和平原型和田羊KAP11.1基因表達(dá)量差異的原因仍有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)成功克隆了平原型和田羊、山區(qū)型和田羊和卡拉庫爾羊KAP11.1基因CDS區(qū)序列，長度為480 bp，編碼159個(gè)氨基酸，序列相似性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，3種綿羊與山羊親緣關(guān)系最近，與瘤牛親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。試驗(yàn)成功構(gòu)建KAP11.1基因原核重組表達(dá)載體，原核表達(dá)后獲得了分子質(zhì)量為19 ku的KAP11.1蛋白，該蛋白為不穩(wěn)定的疏水性蛋白，由無規(guī)則卷曲和延伸鏈組成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，KAP11.1基因在山區(qū)型和田羊中表達(dá)量最高，其次是卡拉庫爾羊，平原型和田羊最低。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究KAP11.1基因在決定羊毛性狀方面的作用提供材料。