侯金星，王戰(zhàn)航，朱俊儒，江 悅，劉淑娟，安小鵬

(1．楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，楊凌 712100；2．西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，楊凌 712100)

山羊奶營養(yǎng)成分豐富，營養(yǎng)價值接近人乳，被營養(yǎng)學(xué)界評價為唯一可與人乳相媲美的功能性食品[1]。與牛奶相比，羊奶還具有抗氧化、消炎作用，可改善嬰兒的輕微消化紊亂，預(yù)防過敏性疾病[2]。羊奶中具有更開放的酸誘導(dǎo)凝固結(jié)構(gòu)和更細(xì)的蛋白質(zhì)鏈，嬰幼兒食用后胃蛋白酶可以更好地擴散，與牛奶相比，羊奶在嬰幼兒的胃中更容易被消化[3]。羊奶含有豐富的營養(yǎng)保健功能，其短鏈脂肪酸含量豐富，不易在體內(nèi)沉積，且因其核苷酸含量豐富，還具有益腦健智的功能[4]。αs1-酪蛋白(alpha-s1 casein，CSN1S1)基因位于山羊6號染色體一段長250～300 kb區(qū)域中，與它共同組成基因座的還有β-酪蛋白(CSN2)、αS2酪蛋白(CSN1S2)和κ-酪蛋白(CSN3)。山羊CSN1S1基因延伸出約16 785 bp的片段，其中外顯子區(qū)域長1 138 bp、內(nèi)含子區(qū)域長15 647 bp，與牛CSN1S1基因序列相似性約為57%。編碼酪蛋白的基因普遍具有多態(tài)性，研究表明，CSN1S1基因的多態(tài)性不僅會影響羊奶中酪蛋白的含量，而且會影響羊奶的結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)特性[5]。研究發(fā)現(xiàn)，CSN1S1基因中11 bp的突變與關(guān)中奶山羊羊奶中的酸度有顯著關(guān)系[6]；CSN1S1基因多態(tài)性對挪威奶山羊的游離脂肪酸濃度有顯著影響[7]。本試驗以關(guān)中奶山羊為研究對象，PCR擴增并克隆了關(guān)中奶山羊CSN1S1-1和CSN1S1-2 2種突變形態(tài)，利用多種生物信息學(xué)軟件及在線工具對突變型和野生型序列進行分析比對，同時分析其在關(guān)中奶山羊各組織中的表達(dá)情況，為進一步研究CSN1S1基因在奶山羊乳成分合成中的調(diào)控作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于西北農(nóng)林科技大學(xué)關(guān)中奶山羊養(yǎng)殖場，選取泌乳期的健康關(guān)中奶山羊，屠宰后采集肝臟、脾臟、乳腺、腎臟、子宮、輸卵管組織1～2 g，置于DEPC水中漂洗后迅速放入液氮罐中保存。采集乳腺組織用PBS沖洗2～3次，保存于含有雙抗的PBS中，帶回實驗室后在超凈工作臺中處理乳腺組織，組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)原代乳腺上皮細(xì)胞。

高純總RNA快速提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒、pMD19-T載體、RNAiso Plus均購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購自天根生化科技(北京)有限公司；氨芐青霉素溶液(AMP)購自Solarbio公司。

1.2 CSN1S1基因CDS區(qū)克隆

1.2.1 引物設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank中CSN1S1基因變體1的CDS區(qū)序列(登錄號：XM_018049127.1)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計CSN1S1基因CDS區(qū)擴增引物：F：5′-CCCAAGC-TTATGAAACTTCTCATCCTTACCTGTCTT-3′；R：5′-CCCTCGAGTCACCACAGTGGCATAGTA-GTCTTTC-3′，預(yù)計擴增產(chǎn)物大小為645 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 RNA提取 按照總RNA快速提取試劑盒說明書從乳腺上皮細(xì)胞及奶山羊肝臟、脾臟、乳腺、腎臟、子宮、輸卵管中提取總RNA，用核酸分光光度儀檢測RNA的純度和濃度。

1.2.3 PCR擴增及克隆 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系20 μL：Reaction Solution from Step 1 10 μL，5×Prime Script Buffer 2(for Real-time) 4 μL，Prime Script RT Enzyme Mix 1 1 μL，RT Prime Mix 1 μL，DEPC水4 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃保存。

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板進行PCR擴增。 PCR反應(yīng)體系20 μL：上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板(50 μmol/L)2 μL，Primer Star MAX酶10 μL，DNase-free ddH2O 6 μL。 PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。

采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，切膠回收正確條帶，與pMD19-T載體連接。連接體系10 μL：膠回收產(chǎn)物(DNA片段)3 μL，Solution Ⅰ 5 μL，pMD19-T載體1 μL，DEPC水1 μL。16 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取100 μL菌液涂布含1% Amp的固體LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h后挑取單克隆菌落，搖床4～5 h后進行菌液PCR鑒定，取陽性單克隆菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3 生物信息學(xué)分析

通過NCBI中ORF Finder在線軟件(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)鑒定開放閱讀框；用ProtParam在線軟件(https:∥www.expasy.org/resources/protparam)分析CSN1S1基因野生型和突變型編碼蛋白的基本理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征；采用NetPhos在線軟件(http:∥www.dabi.temple.edu/disphos/)進行蛋白磷酸化位點預(yù)測；通過TMHMM Server v.2.0在線軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用SingalP 4.1 Server在線軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行蛋白信號肽預(yù)測；利用YLoc在線軟件(https:∥kohlbacherlab.org/Software/)進行蛋白亞細(xì)胞定位分析；利用NPS(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)和Phyre2(http:∥bioinf.cs.ucl.ac.uk./psipred/)在線軟件分別預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。

1.4 CSN1S1基因組織表達(dá)譜分析

將關(guān)中奶山羊肝臟、脾臟、乳腺、腎臟、子宮、輸卵管6個組織的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實時熒光定量PCR檢測其相對表達(dá)量，引物信息見表1，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 PCR反應(yīng)體系25 μL：SYBR Premix ExTaqⅡ (2×) 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。每個樣品做3個重復(fù)，各表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計算。

表1 引物信息

續(xù)表

1.5 統(tǒng)計分析

利用SPSS 25.0軟件分析試驗數(shù)據(jù)，通過獨立樣本t檢驗分析結(jié)果的差異性，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 CSN1S1基因2種新序列

PCR產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，目的條帶清晰，條帶大小分別為645和639 bp(圖1)，分別命名為CSN1S1-1和CSN1S1-2。測序結(jié)果顯示，關(guān)中奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中存在CSN1S1-1和CSN1S1-2兩種突變形態(tài)，其中CSN1S1-1在92 bp處T突變成C，108、274 bp處C突變成G；CSN1S1-2除在上述位點發(fā)生突變外，還在242 bp處缺失C堿基，249-253 bp處缺失TGAGG序列(表2)。

M,Direct-load StarMarker D2000 Plus；1，CSN1S1-2基因PCR擴增產(chǎn)物；2，CSN1S1-1基因PCR擴增產(chǎn)物M,Direct-load StarMarker D2000 Plus;1,PCR amplification product of CSN1S1-2 gene;2,PCR amplification product of CSN1S1-1 gene圖1 CSN1S1-1/-2基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of CSN1S1-1/-2 genes

表2 CSN1S1-1/-2基因CDS區(qū)序列突變及缺失

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白理化性質(zhì)分析 蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，CSN1S1和CSN1S1-1均含有214個氨基酸，相對分子質(zhì)量分別為24 276.59和24 261.53，CSN1S1-2含有212個氨基酸，相對分子質(zhì)量為24 102.45；CSN1S1和擴增的2種突變形態(tài)均為酸性蛋白，且不穩(wěn)定系數(shù)均>40，為不穩(wěn)定蛋白，具體見表3。BLAST比對結(jié)果顯示，CSN1S1野生型與CSN1S1-1蛋白相似性為99.07%，與CSN1S1-2蛋白相似性為97.20%。與CSN1S1相比，CSN1S1-1中3個堿基的突變導(dǎo)致第31位亮氨酸變成脯氨酸，第92位谷氨酰胺變成谷氨酸；CSN1S1-2中除上述氨基酸改變之外，還出現(xiàn)了第81、82位2個絲氨酸缺失，第83位絲氨酸變成半胱氨酸，第84位谷氨酸變成谷氨酰胺。3種蛋白中氨基酸含量占比相對較多的均為亮氨酸和谷氨酸，CSN1S1中占比分別為10.7%和8.9%，CSN1S1-1中占比為10.3%和9.3%，CSN1S1-2中占比分別為10.4%和9.0%；氨基酸含量占比較少的均為色氨酸和半胱氨酸，其中色氨酸占比均為0.9%(表4)。

表3 CSN1S1及CSN1S1-1/-2蛋白理化性質(zhì)對比

表4 CSN1S1及CSN1S1-1/-2蛋白的氨基酸組成

2.2.2 磷酸化位點預(yù)測 通過DISPHOS 1.3軟件分析3種蛋白的磷酸化位點分布情況，結(jié)果見圖2。由圖2可知，CSN1S1和CSN1S1-1蛋白共有15個絲氨酸磷酸化位點、3個蘇氨酸磷酸化位點和4個酪氨酸磷酸化位點；CSN1S1-1蛋白共有16個絲氨酸磷酸化位點、3個蘇氨酸磷酸化位點和4個酪氨酸磷酸化位點；CSN1S1-2由于堿基的缺失與CSN1S1相比少了3個絲氨酸磷酸化位點。3種蛋白中蘇氨酸和酪氨酸的數(shù)量雖然一致，但由于突變其分布位點卻有所差異。

2.2.3 亞細(xì)胞定位分析 根據(jù)YLoc在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CSN1S1及CSN1S1-1/-2蛋白均在細(xì)胞外分布(表5)。

2.2.4 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 經(jīng)NPS和Phyre2分析發(fā)現(xiàn)，CSN1S1蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲占比分別為42.99%、8.88%和48.13%；CSN1S1-1中占比分別為40.19%、7.48%和52.34%；CSN1S1-2中占比分別為40.09%、8.49%和51.42%(圖3)。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)一致(圖4)。

正方形，絲氨酸磷酸化位點；三角形，蘇氨酸磷酸化位點；圓形，酪氨酸磷酸化位點Square,Ser phosphorylation site;Triangle,Thr phosphorylation site;Round,Tyr phosphorylation site圖2 CSN1S1及CSN1S1-1/-2蛋白的磷酸化位點預(yù)測Fig.2 Phosphorylation site prediction of CSN1S1 and CSN1S1-1/-2 proteins

表5 CSN1S1及CSN1S1-1/-2蛋白亞細(xì)胞定位分布

長豎線，α-螺旋；中豎線，延伸鏈；短豎線，無規(guī)則卷曲Long vertical line,Alpha helix;Middle vertical line,Extended chain;Short vertical line,Random coil圖3 CSN1S1(A)、CSN1S1-1(B)和CSN1S1-2(C)蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Secondary structure prediction of CSN1S1 (A),CSN1S1-1 (B) and CSN1S1-2 (C) proteins

圖4 CSN1S1(A)、CSN1S1-1(B)和CSN1S1-2(C)蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Tertiary structure prediction of CSN1S1 (A),CSN1S1-1 (B) and CSN1S1-2 (C) proteins

2.3 組織表達(dá)譜分析

由圖5可知，CSN1S1-1/-2基因在關(guān)中奶山羊各組織中的相對表達(dá)趨勢基本相同，子宮中CSN1S1-2基因表達(dá)量顯著高于CSN1S1-1基因(P<0.05)，2種突變形態(tài)均在乳腺中的表達(dá)量最高，其次是輸卵管和子宮，而肝臟、腎臟和脾臟中表達(dá)量均較低。

*，差異顯著(P<0.05)*,Significant difference (P<0.05)圖5 CSN1S1-1/-2基因在關(guān)中奶山羊各組織中的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression of CSN1S1-1/-2 genes in various tissues of Guanzhong dairy goats

3 討 論

3.1 CSN1S1基因及CSN1S1-1/-2 2種突變形態(tài)

CSN1S1編碼αs1-酪蛋白基因，與CSN2、CSN1S2和CSN3構(gòu)成一個基因座，聚集在6號染色體300 kb內(nèi)[8]，以上4種酪蛋白基因的遺傳變異可以影響羊乳乳蛋白產(chǎn)量、乳成分、奶酪加工特性、人體營養(yǎng)消化率和耐受性等[5]。這4個基因編碼的酪蛋白在山羊中有很高的遺傳變異性[9]，目前在山羊、奶牛、綿羊、駱駝和馬身上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾十個酪蛋白等位基因，這些序列變異與基因表達(dá)和牛奶蛋白含量的改變有關(guān)[10]。Luigi-Sierra等[11]分析了來自非洲、歐洲、南亞、東亞和西亞的伊朗綿羊和家羊的全基因組序列，鑒定出CSN1S1的248個SNPs、CSN1S2的268個SNPs、CSN2的146個SNPs和CSN3的112個SNPs，并發(fā)現(xiàn)4個家羊群體共享44.2%～57.4%的蛋白多態(tài)性位點。Zhang等[12]研究表明，CSN1S1基因是調(diào)節(jié)哺乳動物泌乳性能的主要基因之一，也與機體發(fā)育有關(guān)，同時提出CSN1S1基因11 bp的插入或缺失對山羊泌乳性能和體測性狀存在潛在影響。本研究通過PCR擴增并克隆關(guān)中奶山羊中普遍存在的CSN1S1-1和CSN1S1-2 2個CSN1S1基因的突變形態(tài)，比對發(fā)現(xiàn)，2個突變形態(tài)均發(fā)生了3個堿基的轉(zhuǎn)換和顛換，CSN1S1-2還存在2處共6個堿基的缺失。推測CSN1S1-1和CSN1S1-2中由于突變導(dǎo)致的氨基酸種類和數(shù)量的變化可能影響奶山羊乳中蛋白成分。

3.2 CSN1S1-1/-2生物信息學(xué)分析

研究表明，細(xì)胞中蛋白質(zhì)的結(jié)合、生物活性及蛋白質(zhì)和其他生物分子的相互作用等功能都可以由蛋白質(zhì)的磷酸化-去磷酸化來調(diào)控[13]，且每個組織內(nèi)部都有專門的、相互關(guān)聯(lián)的磷酸化網(wǎng)絡(luò)，許多蛋白質(zhì)由磷酸化直接調(diào)控[14]。酪蛋白的磷酸化通常發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的側(cè)鏈，由磷酸激酶催化[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，CSN1S1-1在第90位氨基酸殘基處多了1個絲氨酸磷酸化位點，而CSN1S1-2由于堿基的缺失反而缺少了3個絲氨酸磷酸化位點，且存在大范圍的酸磷酸化位點前移，CSN1S1-1和CSN1S1-2絲氨酸磷酸化位點數(shù)量的變化預(yù)示著其具有調(diào)控CSN2表達(dá)的潛能，為CSN2合成調(diào)控的研究提供了新思路。

基因鄰域(gene neighborhood)指基因組中共同表達(dá)的空間集群[16]。CSN1S1、CSN2、CSN3、CSN1S2等基因都表達(dá)酪蛋白，這些基因功能相關(guān)，但不具有同源性，構(gòu)成一個基因鄰域[17]。對蛋白質(zhì)相互作用分析發(fā)現(xiàn)，本試驗未直接找到關(guān)中奶山羊CSN1S1蛋白互作圖，而綿羊和牛CSN1S1與CSN2、CSN3、CSN1S2、LALBA、PAEP、CYM、PRR12、SCAF1存在互作關(guān)系，推測關(guān)中奶山羊中也存在CSN1S1及其突變形態(tài)與以上蛋白的互作。Gilmanov等[18]研究發(fā)現(xiàn)，CSN1S1、CSN2、CSN3基因復(fù)雜型對奶牛產(chǎn)奶量具有顯著影響。Song等[19]研究證實，奶山羊CSN1S1基因可以通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT5a信號通路抑制CSN2啟動子活性和CSN2合成。 此外，miR-204-5p通過CSN1S1/STAT5a信號軸增強了CSN2表達(dá)，并通過激活位于CSN2啟動子中的STAT5響應(yīng)元件促進了CSN2的轉(zhuǎn)錄，進一步確定了奶山羊中CSN1S1與CSN2的互作關(guān)系[20]。在幼齡反芻動物中，凝乳酶(CYM)可以通過水解CSN2產(chǎn)生1個抑制金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌的小肽[21-22]，由此推測，CYM與CSN1S1基因可能存在潛在互作關(guān)系。目前對于奶山羊中CSN1S1基因與其他基因互作的研究還較為缺乏，CSN1S1-1和CSN1S1-2的功能也有待進一步挖掘。

3.3 CSN1S1基因組織表達(dá)譜分析

酪蛋白是主要的乳蛋白，可以改善腸道鈣吸收，在營養(yǎng)方面具有進化上的保守作用。酪蛋白基因的序列變化直接影響動物的乳成分，酪蛋白基因的調(diào)控元件可用于在轉(zhuǎn)基因動物乳汁中直接表達(dá)所需蛋白成分[23]。研究發(fā)現(xiàn)，CSN1S1可使單核細(xì)胞分化向巨噬細(xì)胞樣表型傾斜[24]，還可通過TLR4和炎癥小體通路以磷酸化依賴的方式發(fā)揮促炎作用[25]，且在原代人單核細(xì)胞中可檢測到CSN1S1基因mRNA表達(dá)[26]。表明CSN1S1基因不僅能表達(dá)乳蛋白，還可能在其他組織中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。本研究構(gòu)建的關(guān)中奶山羊組織表達(dá)譜中CSN1S1-1和CSN1S1-2在乳腺中表達(dá)量最高，子宮和輸卵管中也有表達(dá)，且子宮中CSN1S1-2的表達(dá)量顯著高于CSN1S1-1的表達(dá)，提示CSN1S1-2可能在子宮中發(fā)揮其他功能，其具體功能還有待進一步探索。

4 結(jié) 論

本研究擴增出2種(CSN1S1-1、CSN1S1-2)與CSN1S1蛋白相似性均達(dá)到97%以上的突變形態(tài)，其中CSN1S1-1存在3個堿基突變，在蛋白結(jié)構(gòu)上與CSN1S1已有明顯區(qū)別，而CSN1S1-2中6個堿基的缺失是導(dǎo)致氨基酸改變、磷酸化位點缺失與移位的直接原因。CSN1S1-1和CSN1S1-2均在關(guān)山奶山羊乳腺、子宮和輸卵管中高表達(dá)，CSN1S1-2在關(guān)中奶山羊子宮中表達(dá)量顯著高于CSN1S1-1。