魏文焯，鄭 超，吳 艷，梁振華，皮勁松，杜金平，李成鳳，張 昊

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，武漢 430064；2.西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621010；3.湖北神丹健康食品有限公司，安陸 432600)

環(huán)狀RNA(circRNA)是一類廣泛存在于生物體細胞中的非編碼RNA分子(ncRNA)，是不具有5′-末端帽子和3′-末端poly(A)尾巴、并以共價鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性非編碼RNA分子[1-2]。它是通過前體mRNA(pre-mRNA)反向剪接，即下游5′-端剪接位點與上游3′-端剪接位點反向連接，在連接位點形成一個具有3′,5′-磷酸二酯鍵，最終以共價閉合形態(tài)廣泛存在于各種真核生物體中[3-4]。隨著高通量RNA測序技術、生物信息學技術和基因功能研究的不斷發(fā)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)circRNA在機體內(nèi)發(fā)揮著重要作用。2012年，Salzman等[5]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術發(fā)現(xiàn)，circRNA在人類細胞中廣泛存在，引發(fā)學術界對circRNA的研究熱度不斷提升，目前已經(jīng)成為分子生物學領域的研究熱點。

眾所周知，上皮細胞的增殖分化是機體自我修復的一種方式，當機體受到損傷時，上皮細胞就開始進行增殖分化，修復受損組織。而circRNA在上皮細胞的增殖分化中扮演重要角色，有研究表明，circRNA 3890可協(xié)同miR-26b-3p調(diào)控奶山羊子宮內(nèi)膜上皮細胞的增殖分化[6]。ZNF326是一種調(diào)節(jié)細胞生長、促進細胞增殖與遷移的基因[7-9]，近年來研究較為廣泛。ZNF326經(jīng)過反向剪接可形成circ-ZNF326，而circ-ZNF326生物學功能及作用機制卻鮮見報道。因此，本試驗利用反向剪接位點驗證circ-ZNF326成環(huán)方式，檢測其在細胞中的核質(zhì)分布情況，并構(gòu)建PLCDH-ciR真核表達載體，利用實時熒光定量PCR技術檢測circ-ZNF326的表達效率，利用轉(zhuǎn)染、CCK-8等方法檢測過表達circ-ZNF326對蛋鴨小腸上皮細胞增殖的影響，為深入研究circ-ZNF326的生物學功能及其對蛋鴨小腸上皮細胞增殖的調(diào)控機制奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

在湖北省農(nóng)業(yè)科學院蛋鴨場選擇綠頭鴨種蛋10枚，將種蛋放入孵化箱，孵至26胚齡用于分離培養(yǎng)蛋鴨腸上皮細胞。

1.2 主要試劑與儀器

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞由湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所保存；聚合酶I-5TM2×High-Fidelity Master Mix購自北京擎科生物科技有限公司；環(huán)狀RNA表達載體PLCDH-ciR、Lipofectmin 3000均購自吉賽生物科技(廣州)有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ、T4 DNA連接酶及高保真DNA聚合酶均購自上海起發(fā)實驗試劑有限公司；凝膠回收試劑盒與質(zhì)粒提取試劑盒均購自上海北諾生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與核質(zhì)分離試劑盒(PARISTM Kit)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

超凈工作臺(HD-1360)購自哈爾濱市東聯(lián)電子有限公司；凝膠成像儀和PCR擴增儀均購自伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司；離心機購自艾本德(上海)國際貿(mào)易有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-6)購自國華電器有限公司；全自動高壓蒸汽滅菌器購自致微(廈門)儀器有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱購自賓德股份公司。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 準備3枚26胚齡鴨胚，在超凈臺中取鴨胚十二指腸組織，然后利用Trizol法提取腸道組織RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的腸道組織RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 鴨小腸上皮細胞的分離培養(yǎng) 另取3枚26胚齡的啄殼鴨胚，在超凈臺中使用無菌操作取出鴨胚的小腸組織，放入提前準備好的DPBS溶液中，利用DPBS溶液清洗小腸組織，去除胰腺和腸系膜后把小腸剖開，用DPBS溶液清洗小腸內(nèi)壁，直至上液清亮，將清洗好的小腸剪成1～2 mm的組織塊，放入DPBS溶液中。利用1%的Ⅰ型膠原酶消化液20 mL消化小腸組織塊，37 ℃、80 r/min振蕩消化60 min，后用DPBS清洗3次。利用PBS溶液輕柔吹打小腸組織塊，收集上層細胞懸浮液，并保留組織塊繼續(xù)加入PBS吹打，重復上述步驟6～7次，直至上液清亮。 將獲得的細胞懸液1 000 r/min離心3 min后棄上清，將獲得的細胞團用完全培養(yǎng)基吹打重懸，并用100 μm細胞篩過濾，鴨小腸上皮細胞完全培養(yǎng)基為：DMEM-F12培養(yǎng)基中加入5%胎牛血清，0.5%肝素鈉(100 μg/mL)，0.1%表皮生長因子(105 ng/mL)，0.1%胰島素(25 mg/mL)，1%青鏈霉素(10 000 U)。過篩后的細胞用完全培養(yǎng)基懸浮吹打均勻，并將其接種到細胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)90 min，去掉貼壁雜細胞，收集未貼壁細胞，細胞按照1×107/mL密度接種于細胞培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3.3 circ-ZNF326的成環(huán)驗證及測序驗證 根據(jù)前期全轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(未發(fā)表)分析得到circ-ZNF326的全長序列，并采用Primer Premier 5.0軟件設計circ-ZNF326成環(huán)驗證引物：F：5′-ACCCAATAGTCAAGGCACG-3′；R：5′-TGCTG-CTGAACGGAACTG-3′。以蛋鴨腸道組織cDNA為模板，進行PCR擴增，預期PCR產(chǎn)物長度為234 bp。PCR反應體系為50 μL：模板cDNA 5 μL，2×FastTaqPremix 25 μL，上、下游引物各1.5 μL，ddH2O 17 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將膠塊內(nèi)的目的條帶切下送奧科鼎盛(武漢)生物科技有限公司進行測序。

1.3.4 實時熒光定量PCR檢測circ-ZNF326在細胞核與細胞質(zhì)中的分布 利用核質(zhì)分離試劑盒PARISTM Kit分別提取腸上皮細胞中細胞核與細胞質(zhì)的RNA，分別取等量的細胞核與細胞質(zhì)的RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體操作按照試劑盒說明書進行，反應體系10 μL：5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，Total RNA 1 μL，ddH2O 6 μL。參照circ-ZNF326全長序列設計實時熒光定量PCR引物，circ-ZNF326引物：F：5′-ACCCAATAGTCAAGGCA-CG-3′，R：5′-TGCTGCTGAACGGAACTG-3′(預期擴增234 bp)；內(nèi)參基因β-actin引物：F：5′-GC-TATGTCGCCCTGGATTT-3′；R：5′-GGATGCC-ACAGGACTCCATAC-3′(預期擴增367 bp)。分別以細胞核與細胞質(zhì)的cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR檢測。PCR反應體系15 μL：cDNA模板1 μL，THUNDERBID SYBR?qPCR Mix 7.5 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 5.7 μL。PCR反應程序：98 ℃預變性10 s；94 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，60 ℃延伸15 s，共45個循環(huán)；65 ℃延伸60 s。將細胞核中circ-ZNF326的相對表達量設為基準(值為1)，采用2-△△Ct方法處理數(shù)據(jù)，分析circ-ZNF326在細胞核與細胞質(zhì)中的表達情況。

1.3.5 過表達載體的構(gòu)建與驗證

1.3.5.1 circ-ZNF326序列全長的合成 分析前期全轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果得到circ-ZNF326的全長序列(未發(fā)表)，根據(jù)序列設計合成含EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點的circ-ZNF326全長序列，片段由奧科鼎盛(武漢)生物科技有限公司合成，合成片段如圖1所示。

加粗下劃線標記堿基代表酶切位點，虛線下劃線標注堿基代表circ-ZNF326全長序列Bases are underlined in hold to represent the restriction sites,and bases are underlined in dashed to represent the full length circ-ZNF326 sequence圖1 circ-ZNF326全長序列合成片段Fig.1 Synthetic fragment of circ-ZNF326 full-length sequence

1.3.5.2 circ-ZNF326過表達載體的構(gòu)建與驗證 將含有circ-ZNF326全長序列的質(zhì)粒與PLCDH-ciR真核表達載體(圖2)經(jīng)EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切并切膠回收。在二者回收產(chǎn)物中加入T4連接酶和Buffer，16 ℃連接2 h。反應體系：膠回收產(chǎn)物各4 μL、10×Buffer 1 μL、T4連接酶1 μL。連接體系加入50 mL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，均勻涂布于含氨芐(Amp)的LB固體培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜。提取重組載體質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒利用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用含有Amp的LB培養(yǎng)基篩選陽性克隆，將陽性菌液送奧科鼎盛(武漢)生物科技公司測序，利用DNAStar軟件將測序所得堿基序列與目的序列進行比對分析。

圖2 PLCDH-ciR模式圖Fig.2 Schematic diagram of PLCDH-ciR expression vector

1.3.5.3 實時熒光定量PCR驗證circ-ZNF326的過表達效率 將分離培養(yǎng)的鴨小腸上皮細胞均勻接種于6孔板中，第一排3個孔加入7 μL的Lipofectmin 3000和2.5 μg circ-ZNF326過表達重組質(zhì)粒(過載組，circ-ZNF326)，第二排3個孔中加入7 μL的Lipofectmin 3000和2.5 μg PLCDH-ciR載體質(zhì)粒(空載組，PLCDH)于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后提取RNA，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作按照試劑盒說明書進行，熒光定量PCR反應體系與程序同1.2.4。

1.3.6 CCK-8檢測過表達circ-ZNF326對蛋鴨小腸上皮細胞增殖的影響 利用鴨胚分離培養(yǎng)小腸上皮細胞，將細胞分別接種在3個96孔板中，每塊96孔板設置空載組(PLCDH)和過載組(circ-ZNF326)，每組設置5個重復孔，標記為24、48、72 h。過載組每孔加入0.3 μL的Lipofectmin 3000和0.1 μg的circ-ZNF326表達載體質(zhì)粒，空載組每孔加入0.3 μL的Lipofectmin 3000和0.1 μg的PLCDH-ciR載體質(zhì)粒，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在上述3個時間點向每孔中加入20 μL CCK-8溶液，放入細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。孵育結(jié)束后，利用酶標儀測定450 nm處吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 23.0軟件進行方差分析。P<0.05表示差異顯著;P<0.01表示差異極顯著。所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0軟件制圖，結(jié)果以平均值±標準誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 circ-ZNF326反向剪接的驗證

如圖3測序結(jié)果所示，其中右邊框中的堿基序列為ZNF326基因第10號外顯子起始序列，左邊框中的堿基序列則為第12號外顯子末尾序列。此外，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR擴增產(chǎn)物的長度接近250 bp(圖4)，與預期相符。

圖3 circ-ZNF326反向剪切位點測序圖(A)及形成示意圖(B)Fig.3 Sequencing (A) and formation diagram (B) of circ-ZNF326 reverse shear site

圖4 circ-ZNF326的PCR擴增結(jié)果Fig.4 PCR amplification results of circ-ZNF326

2.2 circ-ZNF326的核質(zhì)分布情況

由圖5可知，circ-ZNF326在細胞質(zhì)中的相對表達量極顯著高于細胞核(P<0.01)，表明circ-ZNF326可能主要在細胞質(zhì)中發(fā)揮作用。

2.3 circ-ZNF326過表達載體的構(gòu)建及鑒定

將重組質(zhì)粒利用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切，結(jié)果如圖6所示， 出現(xiàn)2條清晰明亮的條帶，與預期結(jié)果相符。 此外，陽性菌液測序結(jié)果與目的序列一致。

**，差異極顯著(P<0.01)。圖7同**,Extremely significant difference (P<0.01).The same as fig.7圖5 細胞質(zhì)與細胞核中circ-ZNF326的相對表達量Fig.5 Relative expression of circ-ZNF326 in cytoplasm and nucleus

圖6 circ-ZNF326過表達質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.6 Identification of circ-ZNF326 recombinant plasmid by double digestion

2.4 circ-ZNF326過表達效率檢測

如圖7所示，過載組蛋鴨小腸上皮細胞中circ-ZNF326的相對表達量極顯著高于空載組(P<0.01)，證明circ-ZNF326過表達載體構(gòu)建成功，可用于后續(xù)試驗。

2.5 過表達circ-ZNF326對蛋鴨小腸上皮細胞增殖的影響

由圖8可知，轉(zhuǎn)染了circ-ZNF326過表達載體的試驗組蛋鴨小腸上皮細胞活力極顯著或顯著高于空載組(P<0.01；P<0.05)，表明過表達circ-ZNF326會使蛋鴨小腸上皮細胞加速增殖。

圖7 circ-ZNF326過表達載體的表達效率Fig.7 Expression efficiency of circ-ZNF326 overexpressing vector

與空載組相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)Compared with vector group，*,Significant difference (P<0.05)；**,Extremely significant difference (P<0.01)圖8 過表達circ-ZNF326對蛋鴨小腸上皮細胞增殖的影響Fig.8 Effects of overexpression of circ-ZNF326 on proliferation of small intestinal epithelial cells in laying ducks

3 討 論

腸道是機體消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要器官，也是防止腸道微生物侵襲的先天屏障，腸道屏障功能的完整性對機體的正常生長發(fā)育起著至關重要的作用[10]，而應激產(chǎn)生的大量ROS會破壞機體氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡[11]，對腸道屏障功能造成損傷，引發(fā)腸屏障功能障礙[12-14]。腸上皮細胞、免疫系統(tǒng)和腸道菌群可維持正常腸道穩(wěn)態(tài)和屏障完整性[15]。為應對微生物的侵襲，腸上皮細胞發(fā)生凋亡，以維持腸上皮的正常功能，保持組織的持續(xù)更新和穩(wěn)態(tài)，但腸上皮細胞凋亡會導致腸道通透性和屏障功能障礙增加，引發(fā)多種急慢性腸道疾病[16]。因此，促進腸上皮細胞的增殖分化，對維持腸道屏障功能的完整性有重要作用。

越來越多的研究表明，包括miRNAs、circRNAs和lncRNA等非編碼RNA在各種生物學過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能[17-19]。作者前期研究中利用測序技術鑒定了不同養(yǎng)殖模式的蛋鴨腸道中差異表達的circRNA，并對特定circRNA的功能進行了研究，其中circ-ZNF326是ZNF326基因經(jīng)過反向剪接所形成的circRNA，ZNF326可調(diào)控細胞的增殖(未發(fā)表)。有研究表明，miR-21可靶向抑制ZNF326基因的表達,進而促進乳腺癌細胞增殖、遷移[20]。由此推測，由ZNF326所編碼的circ-ZNF326也具備調(diào)控細胞增殖遷移的能力。本試驗通過circRNA反向剪接位點驗證circ-ZNF326的成環(huán)方式、并分別提取細胞核與細胞質(zhì)RNA檢測其在細胞中的核質(zhì)分布情況，分析其基本特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZNF326基因中第10、11和12號外顯子可經(jīng)反向剪接，使第12號外顯子的3′-端連接到10號外顯子5′-端，進而形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。此外，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，circ-ZNF326主要在細胞質(zhì)中發(fā)揮作用。目前研究表明circRNA主要在細胞質(zhì)中發(fā)揮內(nèi)源性競爭RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)作用，但有研究發(fā)現(xiàn)，某些circRNA能在細胞核中發(fā)揮可調(diào)控來源基因轉(zhuǎn)錄的功能[21-22]，提示circ-ZNF326在細胞質(zhì)內(nèi)可能作為ceRNA發(fā)揮吸附miRNA作用，具體功能還需要進一步驗證。目前，circRNA對蛋鴨腸道的影響鮮見報道,僅有少量研究表明，circRNA在蛋鴨脂肪細胞分化中起作用[23]。因此，本研究利用circRNA表達載體，對circ-ZNF326表達載體質(zhì)粒在蛋鴨腸上皮細胞中進行過表達研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達circ-ZNF326可提高腸上皮細胞的活力，從而提高蛋鴨的腸道屏障功能，減少蛋鴨腸道疾病的發(fā)生。此外，circ-ZNF326對蛋鴨小腸上皮細胞活力的作用機制還有待研究。

4 結(jié) 論

本試驗成功驗證了circ-ZNF326的反向剪接與環(huán)狀結(jié)構(gòu)，證明了circ-ZNF326主要富集在細胞質(zhì)中，并構(gòu)建了circ-ZNF326過表達載體，證實了過表達circ-ZNF326可提高蛋鴨小腸上皮細胞的活力，為深入研究circ-ZNF326的生物學功能及其對蛋鴨小腸上皮細胞增殖的調(diào)控機制奠定了理論基礎。