楊 非 ,姚文環(huán) ,李 慧 ,張 靜 ,唐 慧 ,呂實波 ,郭婕,孫劭靖,陸 震,程 東?

(1.山東省疾病預(yù)防控制中心,濟南 250014;2.山東華熙海御生物醫(yī)藥有限公司,濟南 250000;3.華熙生物科技股份有限公司,濟南 250000)

銀耳為擔(dān)子菌門真菌銀耳的子實體,又稱白木耳、雪耳。中國食用銀耳歷史悠久,可追溯到南北朝時期。銀耳多糖(Tremellapolysaccharide)是銀耳的主要組成和活性成分,其種類較多,主要包括酸性、中性雜多糖、胞壁、胞外多糖、酸性低聚糖等五大類。目前,關(guān)于銀耳多糖的研究主要集中在提取技術(shù)、多糖結(jié)構(gòu)種類、保健作用方面,如調(diào)節(jié)機體免疫力、抗腫瘤,抗氧化、抗輻射、抗衰老、提高記憶力、皮膚保濕等[1-16],而關(guān)于銀耳多糖的食用安全性的毒理學(xué)資料極少。為此我們選用華熙生物科技股份有限公司從銀耳孢子經(jīng)發(fā)酵等環(huán)節(jié)獲得的銀耳多糖為研究對象,依照食品安全國家標準要求,進行急性經(jīng)口毒性試驗、遺傳毒性試驗和大鼠90 d經(jīng)口毒性試驗[17-21]等毒理學(xué)試驗,為初步確定銀耳多糖的食用安全性,并為其開發(fā)利用提供基礎(chǔ)毒理學(xué)資料。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

本研究均使用SPF 級動物。90 d 經(jīng)口毒性試驗:SD 大鼠140 只雌雄各半,體重63～85 g,急性經(jīng)口毒性試驗:ICR 小鼠20 只雌雄各半,體重18.1～22.0 g,均來源于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[SCXK(魯)2019-0003];哺乳動物紅細胞微核試驗:ICR 小鼠50 只雌雄各半,體重25.0～35.0 g,小鼠精原細胞染色體畸變試驗:ICR 雄性小鼠30 只,體重31.0～34.0 g,均來源于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]。動物均飼養(yǎng)于山東省疾病預(yù)防控制中心屏障環(huán)境[SYXK(魯)2018-0014],實驗動物飼料來源于北京華阜康生物科技股份有限公司。本次實驗經(jīng)山東省疾病預(yù)防控制中心實驗動物倫理委員會批準(A20210312-2),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 菌株

組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌菌株購自上海寶錄生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

銀耳多糖,黃褐色粉末,由華熙生物科技股份有限公司提供,總糖含量≥61%,蛋白質(zhì)含量為≥6.2%。

S9 混合液,上海寶錄生物科技有限公司提供;血液學(xué)試劑,SYSMEX 公司提供;血生化試劑,SIEMENS 公司提供。

CX21 生物顯微鏡,奧林巴斯公司提供;XN-1000 全自動血細胞分析儀,希思美康公司提供;Dimension Xpandplus 全自動生化分析儀,美國西門子公司提供;CombiScan500 全自動尿液分析儀,Combi 公司提供;Coatron 3000 全自動血凝儀,TECO公司提供;Multifuge 3plus 離心機,Heraeus 公司提供;病理設(shè)備,LEICA 公司提供;檢眼鏡,蘭羚公司提供;電子天平,梅特勒-托勒多公司提供等。

1.3 實驗方法

1.3.1 急性經(jīng)口毒性試驗

按照限量法試驗進行。受試物最大灌胃濃度為100 mg/mL,按0.4 mL/10 g 體重(bw),一日內(nèi)3次進行經(jīng)口灌胃(ig),每次間隔4 h,合并一次劑量為12.0 g/(kg·bw),觀察動物一般表現(xiàn)并記錄,持續(xù)14 d。

1.3.2 細菌回復(fù)突變試驗

考慮受試物對菌株的毒性和溶解度,最高劑量設(shè)置為每皿5 mg,按等比組距原則下設(shè)4 個劑量組(每皿8、40、200、1000 μg)和4 個對照組(自發(fā)回變、溶劑對照、DMSO 對照組和陽性對照組)。分別在加/不加S9 條件下用平板摻入法進行兩次試驗。

1.3.3 哺乳動物紅細胞微核試驗

受試物最大灌胃濃度為100 mg/mL,按0.2 mL/(kg·bw)灌胃,高劑量組為2.0 g/(kg·bw),按2 倍組距下設(shè)2 個劑量組[即1.0、0.5 g/(kg·bw)]。另設(shè)純化水組和環(huán)磷酰胺組(40 mg/(kg·bw))。受試物按0.2 mL/10 (g·bw)間隔24 h 兩次ig 給予。第二次ig 后6 h 采集胸骨骨髓,制片。每只動物至少觀察200 個紅細胞(RBC),同時計數(shù)嗜多染紅細胞(PCE)在總紅細胞中的比例。每只動物至少觀察2000 個PCE,計數(shù)有微核的PCE 頻率。

1.3.4 精原細胞染色體畸變試驗

受試物最大灌胃濃度為100 mg/mL,按0.2 mL/(kg·bw)灌胃,1 日內(nèi)兩次進行ig(間隔6 h),高劑量組為4.0 g/(kg·bw),按2 倍組距下設(shè)2 個劑量組(即2.0、1.0 g/(kg·bw))。另設(shè)純化水對照組和環(huán)磷酰胺對照組(40 mg/(kg·bw),單次ip)。高劑量組于末次ig 后的第24 h 和第48 h 處死動物采樣,其余各組動物于末次ig 后第24 h 處死動物采樣。處死動物前5 h,ip 秋水仙素(4 mg/(kg·bw))。常規(guī)制片。每只動物鏡檢1000 個細胞以確定精原細胞有絲分裂指數(shù)。每只動物計數(shù)100 個中期分裂相細胞,記錄每個中期分裂相細胞的畸變類型和數(shù)量,計算染色體畸變細胞率。

1.3.5 90 d 經(jīng)口毒性試驗

(1)劑量選擇與受試物給予方式

劑量組:大鼠100 只,隨機分為5 組,每組20只,雌雄各半。根據(jù)《食品安全國家標準90 d 經(jīng)口毒性試驗》要求設(shè)計試驗劑量:大鼠每日攝食量按體重8%折算,受試物最高可摻入飼料比例為質(zhì)量分數(shù)10%,動物攝入劑量可達到8.00 g/(kg·bw),以此為高劑量組。下設(shè)三個劑量,分別為4.00、2.00、1.00 g/(kg·bw)。所有劑量組調(diào)整飼料配方,加酪蛋白使蛋白含量與對照組一致(蛋白含量約19%)。衛(wèi)星組:設(shè)衛(wèi)星對照組和衛(wèi)星8.00 g/(kg·bw)劑量組,每組10 只,雌雄各5 只,衛(wèi)星對照組給予基礎(chǔ)飼料,衛(wèi)星8.00 g/(kg·bw)劑量組給予受試物高劑量組飼料。于試驗第45 天(試驗中期)和停止給予受試物后(恢復(fù)期) 28 d 處死取材。

(2)方法

每天觀察大鼠一般表現(xiàn),每周記錄大鼠攝食量、體重。試驗前和試驗結(jié)束時,對高劑量組和對照組大鼠進行眼部檢查(角膜、結(jié)膜、虹膜和晶狀體);試驗中期、試驗結(jié)束、恢復(fù)期結(jié)束血液學(xué)檢查、血生化血檢查和尿液檢查。試驗結(jié)束,麻醉解剖大鼠,稱心臟、肝、腎、脾、胸腺、腎上腺、腦、睪丸、附睪、卵巢和子宮的絕對重量,計算臟/體比值和臟器組織病理學(xué)檢查。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS 22.0 軟件進行分析,結(jié)果以平均數(shù)±標準差()形式表示。計量資料用方差分析、計數(shù)資料用卡方檢驗和Poisson 分布進行組間比較,以P<0.05 為顯著性差異,P<0.01 為極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗

各組小鼠飲水進食正常,未見中毒癥狀,體重逐日增加,14 d 內(nèi)無死亡。結(jié)果顯示雌雄小鼠的LD50均大于12.0 g/(kg·bw),屬實際無毒級。

2.2 細菌回復(fù)突變試驗

兩次試驗中受試物各劑量組回變菌落數(shù)均未大于自發(fā)回變菌落數(shù)的2 倍,亦無劑量-反應(yīng)關(guān)系,說明在加與不加S9 時該受試物對五株試驗菌株均未呈現(xiàn)遺傳毒性(見表1、表2)。

表1 細菌回復(fù)突變試驗結(jié)果(,第一次)Table 1 Results of bacterial reverse mutation test (,First time)

表1 細菌回復(fù)突變試驗結(jié)果(,第一次)Table 1 Results of bacterial reverse mutation test (,First time)

注:(1):敵克松,每皿50 μg;(2):2-氨基芴,每皿10 μg;(3):甲基磺酸甲酯,每皿0.5 μL;(4):1,8-二羥基蒽醌,每皿50 μg;(5):疊氮鈉,每皿0.25 μg ;(6):2-氨基蒽,每皿1 μg。Note.(1),Dioxone,50 μg per dish.(2),2-aminofluorene,10 μg per dish.(3),Methyl sulfonic acid,0.5 μL per dish.(4),1,8-dihydroxyanthraquinone,50 μg per dish.(5),Sodium azide,0.25 μg per dish.(6),2-aminoanthracene,1 μg per dish.

表2 細菌回復(fù)突變試驗結(jié)果(,第二次)Table 2 Results of bacterial reverse mutation test(,Second time)

表2 細菌回復(fù)突變試驗結(jié)果(,第二次)Table 2 Results of bacterial reverse mutation test(,Second time)

注:(1):敵克松,每皿50 μg;(2):2-氨基芴,每皿10 μg;(3):甲基磺酸甲酯,每皿0.5 μL;(4):1,8-二羥基蒽醌,每皿50 μg;(5):疊氮鈉,每皿0.25 μg ;(6):2-氨基蒽,每皿1 μg。Note.(1),Dioxone,50 μg per dish.(2),2-aminofluorene,10 μg per dish.(3),Methyl sulfonic acid,0.5 μL per dish.(4),1,8-dihydroxyanthraquinone,50 μg per dish.(5),Sodium azide,0.25 μg per dish.(6),2-aminoanthracene,1 μg per dish.

2.3 哺乳動物紅細胞微核試驗

如表3 所示,與陰性對照組比較,銀耳多糖各劑量組對雌雄小鼠的含微核細胞率無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),結(jié)果為陰性。

表3 小鼠哺乳動物紅細胞微核試驗(n=5)Table 3 Results of mammalian erythrocyte micromucleus test

2.4 小鼠精原細胞染色體畸變試驗

如表4、表5 所示,與陰性對照組比較,銀耳多糖各劑量組對小鼠的染色體畸變細胞率無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),結(jié)果為陰性。

表4 小鼠精原細胞染色體畸變試驗結(jié)果(個,%)Table 4 Results of mouse spermatogonial chromosomal aberration test(n,%)

表5 小鼠精原細胞染色體畸變試驗結(jié)果(n=5)Table 5 Results of mouse spermatogonial chromosomal aberration test

2.5 90 d 經(jīng)口毒性試驗

2.5.1 動物的一般觀察

90 d 試驗期間和28 d 恢復(fù)期間,各組動物生長狀況良好,體重逐周增長,被毛光滑、皮膚無潰破、眼、黏膜、分泌物和排泄物(大小便)無異常,呼吸、神經(jīng)系統(tǒng)、自主活動,無實驗動物死亡。

2.5.2 對大鼠體重、食物利用率的影響

與陰性對照組比較,銀耳多糖各劑量組的每周體重、進食量、食物利用率和體重增重、總進食量、總食物利用率均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表6)。

表6 90 d 經(jīng)口毒性試驗對大鼠總食物利用率的影響()Table 6 Results of total food utilization rate of rats in 90 d oral toxicity test

表6 90 d 經(jīng)口毒性試驗對大鼠總食物利用率的影響()Table 6 Results of total food utilization rate of rats in 90 d oral toxicity test

2.5.3 眼部檢查

試驗前后,8.00 g/(kg·bw)劑量組和對照組大鼠的角膜、晶狀體、虹膜和結(jié)膜表面光滑,無充血水腫等異常表現(xiàn)。

2.5.4 血液學(xué)測定結(jié)果

與陰性對照組比較,試驗?zāi)┢谛坌?.00 g/(kg·bw)劑量組白細胞分類嗜酸(%)升高、2.00 g/(kg·bw)劑量組PT 降低和8.00 g/(kg·bw)劑量組PT 降低,雌性4.00 g/(kg·bw)劑量組白細胞分類中性(%)升高、淋巴(%)降低(P<0.05 或P<0.01)(表7、表8、表9)。

表7 90 d 經(jīng)口毒性試驗中期血液學(xué)檢查結(jié)果()Table 7 Results of hematological examination for mid-term in 90 d oral toxicity test

表7 90 d 經(jīng)口毒性試驗中期血液學(xué)檢查結(jié)果()Table 7 Results of hematological examination for mid-term in 90 d oral toxicity test

表8 90 d 經(jīng)口毒性試驗?zāi)┢谘簩W(xué)檢查結(jié)果(,n=10)Table 8 Results of hematological examination for final-term in 90 d oral toxicity test

表8 90 d 經(jīng)口毒性試驗?zāi)┢谘簩W(xué)檢查結(jié)果(,n=10)Table 8 Results of hematological examination for final-term in 90 d oral toxicity test

注:與對照組比較,?P<0.05,??P<0.01。Note.Compared with the negative control group,?P<0.05,??P<0.01.

表9 90 d 經(jīng)口毒性試驗恢復(fù)期結(jié)束血液學(xué)檢查結(jié)果(,n=5)Table 9 Results of hematological examination for recovery-term in 90 d oral toxicity test

表9 90 d 經(jīng)口毒性試驗恢復(fù)期結(jié)束血液學(xué)檢查結(jié)果(,n=5)Table 9 Results of hematological examination for recovery-term in 90 d oral toxicity test

2.5.5 血液生化學(xué)測定結(jié)果

試驗中期,雌性實驗動物8.00 g/(kg·bw)劑量組氯離子與對照組比較有顯著性差異(P<0.05),但仍在本研究室正常值范圍內(nèi),不認為存在生物學(xué)意義;試驗?zāi)┢诤突謴?fù)期,劑量組動物各項指標與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05),且其值均在本實驗室正常值范圍內(nèi)(表10、表11、表12)。

表10 90 d 經(jīng)口毒性試驗中期血液生化結(jié)果(,n=5)Table 10 Results of biochemistry examination for mid-term in 90 d oral toxicity test

表10 90 d 經(jīng)口毒性試驗中期血液生化結(jié)果(,n=5)Table 10 Results of biochemistry examination for mid-term in 90 d oral toxicity test

注:與對照組比較,?P<0.05。Note.Compared with the negative control group,?P<0.05.

表11 90 d 經(jīng)口毒性試驗?zāi)┢谘荷Y(jié)果(,n=10)Table 11 Results of biochemistry examination for final-term in 90 d oral toxicity test

表11 90 d 經(jīng)口毒性試驗?zāi)┢谘荷Y(jié)果(,n=10)Table 11 Results of biochemistry examination for final-term in 90 d oral toxicity test

表12 90 d 經(jīng)口毒性試驗恢復(fù)期結(jié)束血液生化結(jié)果(,n=5)Table 12 Results of biochemistry examination for recovery-term in 90 d oral toxicity test

表12 90 d 經(jīng)口毒性試驗恢復(fù)期結(jié)束血液生化結(jié)果(,n=5)Table 12 Results of biochemistry examination for recovery-term in 90 d oral toxicity test

2.5.6 尿液檢查結(jié)果

與對照組比較,試驗中期雄性8.00 g/(kg·bw)劑量組尿蛋白有顯著性差異(P<0.05);試驗?zāi)┢诖菩?.00 g/(kg·bw)劑量組pH 值有顯著性差異(P<0.05),但均在本研究室正常值范圍內(nèi),不認為存在生物學(xué)意義。其余各劑量組各項指標均無顯著性差異。

2.5.7 病理解剖

(1)大體解剖

90 d 經(jīng)口毒性試驗結(jié)束后,大體觀察各劑量組動物的腦、垂體、甲狀腺、胸腺、肺、心臟、肝、脾、腎、腎上腺、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、胰腺、腸系膜淋巴結(jié)、卵巢、子宮、睪丸、附睪、前列腺和膀胱等組織器官均未見明顯異常。

(2)組織病理學(xué)檢查

對照組和高劑量組大鼠各臟器病理切片檢查發(fā)現(xiàn)對照組和高劑量組有少數(shù)動物出現(xiàn)肝、肺和腎輕微病理改變:雄性對照組和雌性高劑量組、對照組各1 只大鼠可觀察到肝小葉內(nèi)點狀的炎癥灶,灶內(nèi)炎細胞浸潤,個別肝細胞壞死,雄性高劑量組、對照組各1 只內(nèi)可見匯管區(qū)內(nèi)點狀的炎癥灶;雄性高劑量組1 只大鼠可觀察到肺氣腫,部分肺泡腔融合成肺大泡,雄性對照組和雌性高劑量組、對照組各有1 只可觀察到肺間質(zhì)炎,肺泡上皮增生,肺泡壁變厚,肺泡腔和肺泡壁有炎細胞浸潤;雄性高劑量組、對照組各1 只大鼠可觀察腎小管變性,小管上皮細胞腫脹,嗜堿性染色增強,胞漿內(nèi)出現(xiàn)透明空泡樣區(qū),胞核疏松淡染,小管管腔變窄。

(3)臟器系數(shù)測定結(jié)果

試驗?zāi)┢诩盎謴?fù)期,腦、心臟、胸腺、腎上腺、肝、脾、腎、睪丸、附睪、子宮、卵巢等臟器的重量和臟器系數(shù)與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)(表13～表16)。

表13 90 d 經(jīng)口毒性試驗?zāi)┢谂K器重量(,n=10)Table 13 Organ weight for final-term in 90 d oral toxicity test

表13 90 d 經(jīng)口毒性試驗?zāi)┢谂K器重量(,n=10)Table 13 Organ weight for final-term in 90 d oral toxicity test

表14 90 d 經(jīng)口毒性試驗?zāi)┢谂K器系數(shù)(,n=10)Table 14 Organ coefficient for final-term in 90 d oral toxicity test

表14 90 d 經(jīng)口毒性試驗?zāi)┢谂K器系數(shù)(,n=10)Table 14 Organ coefficient for final-term in 90 d oral toxicity test

表15 90 d 經(jīng)口毒性試驗恢復(fù)期結(jié)束臟器重量(,n=10)Table 15 Organ coefficient for recovery-term in 90 d oral toxicity test

表15 90 d 經(jīng)口毒性試驗恢復(fù)期結(jié)束臟器重量(,n=10)Table 15 Organ coefficient for recovery-term in 90 d oral toxicity test

表16 90 d 經(jīng)口毒性試驗恢復(fù)期結(jié)束臟器系數(shù)(,n=10)Table 16 Organ coefficient for recovery-term in 90 d oral toxicity test

表16 90 d 經(jīng)口毒性試驗恢復(fù)期結(jié)束臟器系數(shù)(,n=10)Table 16 Organ coefficient for recovery-term in 90 d oral toxicity test

3 討論

銀耳多糖生理活性廣泛,具有廣闊的市場價值,但作為食品原料開發(fā)利用還缺乏充分的毒理安全評價資料?，F(xiàn)僅查閱到賈漢卿等[22-25]報道的關(guān)于銀耳多糖J 的小鼠急性毒性、慢性毒性、生殖毒性、致癌試驗文章,其采用的試驗方法參考文獻為1978 年人民衛(wèi)生出版社出版的《食品毒理》。報道未對受試物銀耳多糖來源、性狀等作出說明,實驗動物選用小鼠,未標明小鼠品系、來源、飼養(yǎng)環(huán)境等,在慢性毒性試驗中,未提供每周體重、進食量、食物利用率、血液學(xué)、血生化學(xué)、尿液檢查、臟器濕重、臟體比等多項指標數(shù)據(jù),也未設(shè)置衛(wèi)星組,研究不夠深入系統(tǒng)。本次研究依據(jù)最新的食品安全國家標準[17-21]對華熙生物科技股份有限公司生產(chǎn)的銀耳多糖開展毒理學(xué)試驗,初步研究銀耳多糖的食用安全性。急性毒性試驗采用限量法[17],24 h 內(nèi)經(jīng)口累積給予小鼠12.0 g/(kg·bw)的銀耳多糖,小鼠無一死亡,無明顯的毒性癥狀,可見銀耳多糖屬實際無毒級。在遺傳毒性試驗中,無論原核細胞試驗還是真核細胞試驗,無論體內(nèi)試驗還是體外試驗,結(jié)果均為陰性,初步判斷該銀耳多糖沒有遺傳毒性。在90 d 經(jīng)口毒性試驗中,各劑量組動物每周體重、體重增重、進食量、總進食量、食物利用率和總食物利用率與對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義,可見銀耳多糖對大鼠生長發(fā)育、進食、營養(yǎng)吸收沒有不良影響。血液學(xué)、血生化、尿液檢查中,個別劑量白細胞分類嗜酸、中性、淋巴、PT,氯離子、尿蛋白、尿PH 值等與對照組比較出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異,但沒有劑量反應(yīng)關(guān)系,時間沒有連續(xù)性,與性別無關(guān),且其值均在本研究室正常值范圍內(nèi),不認為有生物學(xué)意義和毒理學(xué)意義,可能與動物個體差異有關(guān)。組織病理學(xué)檢查對照組和高劑量組少數(shù)動物的標本出現(xiàn)病理改變,但這些病理改變程度較輕且無組間特異性分布,考慮與動物質(zhì)量有關(guān),不認為與銀耳多糖作用有關(guān)。

綜合以上結(jié)果,在本次條件下,本次所研究的銀耳多糖屬于實際無毒級物質(zhì),未見遺傳毒性效應(yīng),根據(jù)銀耳多糖的實際攝入劑量初步確定該樣品最大未觀察到有害作用劑量(NOAEL)為:雄性動物為7.21 g/(kg·bw),雌性動物為8.18 g/(kg·bw)。本次對華熙生物科技股份有限公司生產(chǎn)的銀耳多糖開展的毒理學(xué)安全研究為銀耳多糖開發(fā)利用提供了科學(xué)數(shù)據(jù),為進行下一步的毒理學(xué)試驗提供了劑量參考依據(jù)。