賀 珍，袁紅朝，張麗萍，耿梅梅，許麗衛(wèi)，陳 聞，彭 燦，王久榮

(中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南 長沙 410125)

土壤中有機氮通過微生物的礦化作用轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮供給植物氮素營養(yǎng)需求，是土壤氮素循環(huán)和作物養(yǎng)分供給過程中重要的“庫”和“源”[1-4]。作為土壤有機氮的代表性中間產(chǎn)物，氨基酸態(tài)氮在研究土壤肥力、循環(huán)機制和生物有效性等方面有著重要意義[5-6]。隨著穩(wěn)定同位素示蹤技術在生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)領域應用的不斷拓寬和深入，氮穩(wěn)定同位素示蹤技術廣泛應用于土壤氮循環(huán)研究[7-9]。土壤提取液中可溶性氮組分復雜，包括無機態(tài)氮，如銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮，以及可溶性有機氮，如氨基酸和少量氨基糖等[10-11]。因此，土壤游離氨基酸態(tài)氮同位素豐度的檢測需要對樣品進行前處理轉(zhuǎn)化，其前處理方法的精確程度對質(zhì)譜分析結(jié)果的準確度影響較大[12]。

目前，氨基酸類氮同位素測定方法主要有單個氨基酸的特定化合物同位素分析[13-14]和化學轉(zhuǎn)化N2O產(chǎn)生法[15]。其中，單個氨基酸的特定化合物同位素分析涉及復雜的樣品前處理過程，如氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜(GC-C-IRMS)分析時涉及氨基酸的衍生化反應，而氨基酸類衍生化合物在室溫下不穩(wěn)定，且衍生物中碳氮比高，常引起色譜分析柱的過載和色譜峰共流出[14]。對于只針對土壤中游離氨基酸產(chǎn)生和消耗速率的研究，Noll等[15]發(fā)表了土壤游離氨基酸態(tài)氮化學轉(zhuǎn)化為N2O測定氮同位素的方法，前處理方法為擴散法結(jié)合N2O產(chǎn)生法, 主要包括氨基酸的分離純化和氨基酸態(tài)氮的化學轉(zhuǎn)化兩步驟。其原理為擴散法除去土壤提取液中的銨態(tài)氮后，氨基酸在Br-催化下由ClO-氧化生成NO2-[16]，NO2-被NaN3還原生成N2O氣體[17]，用帶自動預濃縮裝置的穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀(PreCon-IRMS)測定N2O 中的15N 豐度。與單個氨基酸的氮同位素分析和間接法相比，該方法提高了樣品通量，并在一定程度上簡化了前處理步驟，但仍存在以下不足：1) 擴散法除去銨態(tài)氮需要2～3天，實驗周期較長，且該過程存在氮同位素分餾，需要結(jié)果校正；2) 化學轉(zhuǎn)化操作中使用NaN3還原NO2-生成N2O氣體，涉及劇毒化學藥品和反應中間產(chǎn)物，需要專用的儀器設備，操作過程相對復雜，易引入人為操作誤差，導致測試結(jié)果不準確；3) NaN3還原NO2-生成N2O氣體，從同位素分配角度看，形成N2O中的2個氮原子分別來自于亞硝酸鹽(氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化而來)和NaN3分子，因此，測得的N2O的15N豐度不是亞硝酸鹽(氨基酸態(tài)氮)的15N豐度，需經(jīng)公式換算，數(shù)據(jù)處理較繁瑣。

針對以上問題，本研究擬在前期研究[15-22,24]基礎上進行方法改進和測試條件優(yōu)化，建立一種快速蒸餾法結(jié)合化學轉(zhuǎn)化N2O的前處理方法，用帶自動預濃縮裝置的PreCon-IRMS測定土壤提取液中游離氨基酸15N豐度，并利用本實驗室研制開發(fā)的自動化裝置[23]替代原化學轉(zhuǎn)化N2O中的部分人工操作，試驗不同反應條件對氨基酸轉(zhuǎn)化的N2O 產(chǎn)率的影響，明確最適宜的方法條件。以不同濃度和15N豐度的混合氨基酸標準溶液考察該方法對15N豐度測定的精密度和準確度，并通過加入混合氨基酸溶液到不同類型土壤中，驗證該方法對實際土壤樣品中游離氨基酸態(tài)氮穩(wěn)定同位素豐度測定的適用性。

1 實驗部分

1.1 方法原理

α-氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化生成N2O：堿性條件下，次溴酸鈉將氨基酸終端α-NH2裂解為NH4+，該反應被Br-催化，生成NH4+；真空條件下，NH4+繼續(xù)與次溴酸鈉反應，產(chǎn)生氮氣和一部分N2O，該反應被Cu2+催化，并與pH值有關，可通過調(diào)節(jié)NaOH濃度改變反應體系的pH環(huán)境，提升次溴酸鈉的氧化性能，從而提高N2O產(chǎn)率。涉及的化學反應為：

(1)

(2)

1.2 主要儀器與裝置

Precon痕量氣體預濃縮裝置：T1～T3冷阱，Combi PAL自動進樣器，96位氣體樣品盤，頂空瓶(12 mL)，化學阱(填充高氯酸鎂和堿石灰)，poraPlot Q色譜柱，載氣(氦氣，純度>99.999%)；MAT253穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀：高靈敏度電子轟擊離子源，10 kV加速電壓，C/N法拉第杯；質(zhì)譜儀主機與外部設置系統(tǒng)控制、數(shù)據(jù)采集和處理：均由Isodat 3.0軟件自動完成。以上儀器均為美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。XS3DU天平(百萬分之一)：瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；干式恒溫器(加熱盤為64位，與12 mL頂空瓶匹配，控溫范圍為室溫～150 ℃，精度1 ℃)：杭州瑞誠公司產(chǎn)品。

全自動微量氮轉(zhuǎn)化-N2O發(fā)生裝置[23]：實驗室自制(專利號：2018114796378)，配備自動進樣器、120位氣體樣品盤(與12 mL頂空瓶匹配)、自動氣體置換及注入系統(tǒng)和自動加液系統(tǒng)等。

1.3 主要材料與試劑

氯化鉀溶液(濃度1 mol/L)，氧化鎂(純度≥99.5%)，堿性次溴酸鈉溶液(次溴酸鈉溶液(含2 mmol/L Cu2+和10 mol/L氫氧化鈉))：國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品；甘氨酸：純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；混合氨基酸標準品A(20種氨基酸混標，15N豐度0.362 atom%)、混合氨基酸標準品B(20種氨基酸混標，15N豐度98 atom%)：純度≥99.5%，美國CIL劍橋同位素實驗室公司產(chǎn)品；混合氨基酸標準溶液：將2種15N豐度的氨基酸標準品均配制成10 mmol/L的標準溶液A1和B1，再用低豐度標準溶液A1作為稀釋劑，取一定量的標準溶液B1制備成15N豐度約為1.0 atom%和3.5 atom%的標準溶液C1和C2。使用元素分析儀-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜(EA-IRMS)[17]測定標準溶液C1和C2的15N豐度(每個樣品重復測定6次)作為參考值，分別為(1.01±0.02) atom%和(3.35±0.05) atom%，并用于后續(xù)的方法驗證。N2O標準氣體(濃度分別為0.300、1.50、3.00 μmol/mol)：委托中國計量科學研究院國家標準物質(zhì)研究中心制備。

土壤樣品：采集于長沙農(nóng)業(yè)環(huán)境觀測研究站不同土地利用方式的稻田和旱地土壤，其基本理化性質(zhì)列于表1。

表1 供試土壤基本信息 Table 1 Basic properties of tested soil

土壤提取液的制備：稱取5 g經(jīng)研磨過2 mm篩的土壤樣品(土壤含水量30%)，置于50 mL離心管中，加入500 μL標記的10 mmol/L混合氨基酸(15N豐度為3.35 atom%)，充分混勻，重復3次，同時做不添加對照。處理后的土壤立即以土液質(zhì)量比1∶5加入25 mL 1 mol/L KCl溶液，在25 ℃下以180 r/min振蕩0.5 h，過濾液用于氨基酸濃度(熒光 OPAME 法測定[25])及氮同位素豐度測定。

N2O 參比氣體：委托南京土壤所穩(wěn)定同位素實驗室進行標定，標定值可溯源至日本SHOKO有限公司的N2O 標準氣體，該N2O參比氣體的δ15NAir‰值為(6.008±0.020)‰，用于帶自動預濃縮裝置的穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀進行氮同位素比值測定。

1.4 實驗條件及優(yōu)化

1.4.1氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化生成N2O條件 由Zhang等[16]研究可知，Strecker降解反應具有一定的位置特異性，反應主要發(fā)生在α-氨基端，對側(cè)鏈氨基也有一定作用。因此，本實驗選擇結(jié)構(gòu)簡單的甘氨酸進行反應條件的優(yōu)化探索。吸取0.1 mL 10 mmol/L甘氨酸溶液，置于12 mL頂空反應瓶中，在干式恒溫器上蒸干，取出反應瓶，冷卻后蓋上密封瓶蓋，再轉(zhuǎn)移至全自動微量氮轉(zhuǎn)化-N2O發(fā)生裝置抽真空，連接自動加液系統(tǒng)，向反應瓶中加入1 mL不同堿度和濃度的堿性次溴酸鈉溶液，最后注入一定量的惰性氦氣。每組樣品重復3次，反應生成的N2O氣體濃度和15N豐度直接用帶自動預濃縮裝置的穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀測定，以確定影響N2O產(chǎn)率的參數(shù)及最優(yōu)反應條件。

1.4.2混合氨基酸標準溶液及土壤樣品中氨基酸態(tài)氮-N2O轉(zhuǎn)化 在確定最優(yōu)轉(zhuǎn)化反應體系的基礎上，對不同豐度混合氨基酸標準溶液及土壤提取液進行前處理。吸取一定量的15N系列混合氨基酸標準溶液，置于12 mL頂空反應瓶中，反應瓶中氨基酸含量分別為0.1、0.5、1.0 μmol，每組樣品重復5次。將蒸干的反應瓶冷卻后蓋上密封瓶蓋，轉(zhuǎn)移至全自動微量氮轉(zhuǎn)化-N2O發(fā)生裝置抽真空，向反應瓶中依次加入1 mL堿性次溴酸鈉溶液，最后注入一定量的氦氣。反應生成的N2O氣體濃度和15N豐度直接用帶自動預濃縮裝置的同位素比值質(zhì)譜儀測定。

依據(jù)土壤中氨基酸含量，取一定量的土壤浸提液(<3 mL)，置于12 mL頂空反應瓶中，加入約10 mg MgO后，置于120 ℃干式恒溫器中加熱(去除NH4+-N)，濃縮反應液至微干，每組樣品重復3次，后續(xù)N2O轉(zhuǎn)化反應條件和操作同標準溶液。

1.4.3PreCon-IRMS測定15N-N2O豐度的工作條件 預濃縮裝置的氦氣流速20 mL/min，冷阱T2、T3的濃縮時間分別為180、300 s，色譜柱溫度50 ℃。待儀器穩(wěn)定后，將氣體樣品置于Combi PAL自動進樣器上，經(jīng)化學阱除去大部分水汽及二氧化碳干擾氣體后，依次通過T2/T3冷阱濃縮。濃縮后，含N2O的混合氣通過氣相色譜柱分離，依次進入穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀主機進行檢測。根據(jù)N2O參比氣體的標定值，Isodat 3.0軟件自動將樣品的測定值校正成δ15NAir‰值，并最終獲得15N豐度(15N atom%)。

同時，取同體積不同濃度的N2O標準氣體進行檢測，參考Lachouani等[17]方法對標準氣體的峰信號強度Area All值和對應的標準氣體濃度進行線性分析(R>0.995)，樣品產(chǎn)生的N2O氣體濃度可通過該線性方程由峰信號強度換算得到。

1.5 數(shù)據(jù)處理與繪圖

使用Excel 2013和SPSS 19.0處理實驗數(shù)據(jù)，OriginPro 8軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響氨基酸態(tài)氮化學轉(zhuǎn)化過程中N2O產(chǎn)率的因素

氨基酸態(tài)氮化學轉(zhuǎn)化產(chǎn)生N2O涉及2個關鍵反應：第1步是氨基酸的α-NH2在Br-催化下被次溴酸鈉裂解為NH4+；第2步是反應生成的NH4+在真空條件下繼續(xù)與次溴酸鈉反應，并在Cu2+催化下產(chǎn)生一部分N2O。本研究的第1步解離過程主要基于Strecker反應原理，根據(jù)Zhang等[16]報道，此過程中氨基酸-NH2解離效率差異主要源于氨基酸的分子構(gòu)型及位點，它對α-NH2具有較強的特異性，同時對側(cè)鏈氨基也有一定作用；而本研究的第2步，解離的銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化生成N2O的反應原理主要基于Schonberg等[20-22]研究，該反應過程中，N2O產(chǎn)率主要受反應體系的影響，也是氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化的限制步驟。Laughlin等[21]發(fā)現(xiàn)，該反應體系除保證催化劑Cu2+濃度不小于0.5 mmol/L外，N2O產(chǎn)率主要取決于NaOBr的堿度。本研究也發(fā)現(xiàn)，提高NaOH和次溴酸鈉濃度，氨基酸態(tài)氮反應體系中N2O產(chǎn)率增加，且在不小于150 mmol/L NaOBr條件下，當NaOH濃度為10 mol/L時，N2O產(chǎn)率可達到25%左右，在此基礎上繼續(xù)提高體系中NaOH和次溴酸鈉濃度，N2O產(chǎn)率沒有明顯變化，示于圖1。

圖1 次溴酸鈉濃度和堿度對甘氨酸化學轉(zhuǎn)化成N2O產(chǎn)率的影響Fig.1 Effects of sodium hypobromate concentration and alkalinity on the yield of glycine chemical conversion to N2O

2.2 測定氨基酸態(tài)氮中15N的精密度和準確度

不同氨基酸氮含量和15N豐度的標準溶液經(jīng)前處理后，結(jié)合氣體預濃縮裝置與穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)測定其15N豐度，獲得的檢測結(jié)果示于圖2。從精密度來看，所有自然豐度的實驗樣品5次重復測定均能獲得較好的精密度(CV<0.5%)；而對于高豐度的實驗樣品，除0.1 μmol氨基酸的測量精密度稍差，在3.6%～4.0%之間，其他含量標準溶液的精密度均小于1%。從準確度來看，針對不同15N豐度，氨基酸氮含量等于或者超過1 μmol樣品的15N豐度5次重復測量平均值分別為0.361%、0.991%、3.31%，與參考值基本一致。此外，0.1 μmol實驗樣品15N豐度的準確度和精密度與另外2組氨基酸氮含量較高的樣品差異顯著(p<0.05)，在保證理想的測試準確度和精密度條件下，推薦單次反應體系中氨基酸的最低含量為0.5 μmol。本研究采用快速蒸餾除銨和濃縮處理土壤浸提液，并通過全自動微量氮轉(zhuǎn)化-N2O發(fā)生裝置替代Noll等[15]原方法中擴散法手工操作過程，大大縮短了前處理時間，提高了分析測試效率，降低了測試精密度對人員操作熟練程度的依賴，且不存在同位素分餾。

注：a，b表示不同氨基酸含量對豐度測定值的顯著性影響(p<0.05)圖2 化學轉(zhuǎn)化N2O產(chǎn)生法測定不同15N豐度氨基酸態(tài)氮中15N的精密度和準確度Fig.2 Precision and accuracy of the determination of 15N abundance of amino acid-N by chemical conversion N2O method

2.3 土壤浸提液中游離氨基酸態(tài)氮的15N豐度

由于供試土壤中游離氨基酸含量較低，換算為干重含量僅為0.73～1.1 μmol/g，取10 mL土壤浸提液，先經(jīng)冷凍濃縮后，再用于后續(xù)的氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化前處理。

供試土壤樣品中氨基酸含量及其15N豐度結(jié)果列于表2。可以看出，不同利用類型土壤游離氨基酸含量差異較大，土壤1的游離氨基酸含量約為土壤2的1.5倍，這可能是由于土壤1為稻田土壤，肥力較高，其全氮及有機碳含量均遠高于旱地土壤，因此游離氨基酸含量也高于旱地土壤。此外，兩種不同利用類型土壤添加的氨基酸回收率均較高(90%以上)，這可能與土壤質(zhì)地有關，兩種土壤均為粉砂性，對氨基酸的吸附能力相對較弱，因此，添加后立即提取可獲得較好的回收率。

表2 供試土壤浸提液中游離氨基酸15N豐度Table 2 15N abundance of free amino acid in extractions of soils by chemical conversion N2O method

土壤15N豐度的測定結(jié)果顯示，雖然2種不同類型土壤的15N豐度值差異較大，但是對照處理和15N富集處理的土壤15N豐度的重現(xiàn)性均較好(CV<1.0%)，可滿足相關科研工作的需求。

3 結(jié)論

本研究采用快速蒸餾法替代微擴散法，將批量樣品前處理時間從原來的2～3天縮減至1 h內(nèi)即可完成，且對氨基酸化學轉(zhuǎn)化成N2O 的反應過程進行改進，避免使用劇毒化學品和外源氮導致的同位素分餾，同時結(jié)合全自動微量氮轉(zhuǎn)化裝置代替前處理過程中的部分手動操作，利用改進后的反應體系建立了一種簡單、快速、準確且靈敏度高的土壤游離氨基酸前處理及上機測試分析方法，方法的最低檢測限為0.5 μmol AA(1 mL反應體系)。采用本方法測定土壤游離氨基酸態(tài)氮的15N豐度，可以顯著提高樣品通量和檢測效率，均能獲得較理想的精密度，且無分餾現(xiàn)象發(fā)生。通過向不同類型土壤中加入混合氨基酸溶液，可實現(xiàn)nmol級氨基酸濃度土壤樣品中游離氨基酸態(tài)氮穩(wěn)定同位素豐度的測定。該方法的建立有助于推進土壤有機氮礦化、周轉(zhuǎn)、氨基酸態(tài)氮的生物有效性及其影響機制等研究工作的開展。