劉嘉霖，謝慧敏，張崢，楊柏云，羅火林，龔貴如，熊冬金

（南昌大學生命科學學院，江西 南昌，330031）

大豆（Glycine max(L.) Merr.）含有約40%的蛋白質和20%的脂肪，是重要的糧食作物。我國是大豆的原產(chǎn)地，擁有十分豐富的大豆種質資源[1～3]。黃淮海和南方是我國重要的大豆產(chǎn)區(qū)，與國內其他的大豆生態(tài)區(qū)域種質交流頻繁，選育出了大量優(yōu)異的大豆品種[4]。這些育成品種是大豆選育的重要資源，對大豆遺傳研究具有十分重要的意義。Zhou等[5]和Guo 等[6]利用SSR 標記分析大豆種質資源，認為黃淮海夏大豆的遺傳多樣性最高。蓋鈞鎰等分三個育種時期（1923-1995、1995-2005、2005-現(xiàn)在）對我國大豆育成品種進行了品種收集及系譜分析等工作[7～9]，其中2005 年之前的1200 多個優(yōu)良品種被廣泛應用于我國大豆生產(chǎn)[10]。研究大豆遺傳多樣性和遺傳基礎，對大豆育種的親本選配和遺傳改良具有重要指導意義。近年來，分子標記和數(shù)量性狀（QTL）定位發(fā)展迅速，在大豆方面，QTL 定位了大豆耐鹽、大豆葉綠素、大豆籽粒大小、脂肪含量[11]、蛋白質[12]、產(chǎn)量[13]等性狀。Karikari 等[14]報道了亞非歐三個區(qū)域大豆資源的遺傳多樣性，共有21 個SSR 標記與開花天數(shù)和百粒重相關。Patil 等[15]對野生、栽培大豆利用連鎖定位技術鑒定出18個與蛋白質、油脂和蔗糖含量相關QTL，部分QTL 與大豆馴化相關基因組位點重合。隨著基因組重測序和全基因組關聯(lián)分析的發(fā)展[16,17]，QTL定位數(shù)量激增。利用功能分子標記及與產(chǎn)量性狀相關的功能分子標記來研究大豆主要家族的育成品種遺傳基礎報道較少。本試驗選用與QTL相關SSR標記對來源于中國黃淮海江蘇的濱海大白花（A034）和銅山天鵝蛋（A231），山東的即墨油豆（A133）三個祖先親本家族共105份大豆育成品種進行遺傳多樣性與群體遺傳結構研究，研究不同時期群體的遺傳多樣性水平。探索優(yōu)異等位變異在大豆品種選育中的利用途徑及功能基因相關位點標記的遺傳結構，充分了解現(xiàn)有重要祖先親本家族育成品種的遺傳基礎，挖掘利用大豆遺傳多樣性信息，指導育種親本創(chuàng)制和選擇，及品種間的合理布局，提高育種的可預見性，豐富種質遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料

根據(jù)熊冬金等[18]對我國1923-2005 年育成的1300 個大豆的研究信息，選擇12 個省份105 份中國黃淮海產(chǎn)區(qū)的大豆育成品種作為試驗材料（表1）。其中濱海大白花（A034）和銅山天鵝蛋（A231）是江蘇的祖先親本，即墨油豆（A133）山東祖先親本，105份大豆育成品種名稱及相關信息詳見首頁OSID附表。

表1 105份大豆實驗材料Table 1 105 cultivars used in this study

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 選取4～5葉期的大豆葉片，采用改良的CTAB 法[19]提取DNA。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，使用核酸定量儀Qubit 2.0測定濃度與純度，根據(jù)檢測結果將DNA 稀釋至20 ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 QTL 相關SSR 標記引物篩選 根據(jù)http://soybase. org[20]資料查閱已經(jīng)被定位的與產(chǎn)量性狀QTL 緊密連鎖的SSR 標記作為功能基因標記位點。選擇分布于20 條染色體的99 個多態(tài)性高、帶型清晰、重復性好的SSR 標記。以上引物序列在http://soybase.org查詢并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反應總體系15 μL，含DNA 60 ng，上下游引物0.1 μmol·L-1，Taq 酶1.5 U，dNTPs 0.2 μmol·L-1，MgCl20.12 μmol·L-1，ddH20 補齊反應體系。PCR 程序為：94℃3 min；94℃30 s，50～59℃1 min，72℃1 min，共30 個循環(huán)；72℃10 min。擴增后的PCR 產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，再用銀染顯影后觀察結果并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 群體遺傳多樣性分析 通過SSR 標記的主帶分子量大小，對105 份供試材料進行基因分型并輸入Excel。利用Powermarker V3.25[21]軟件計算多態(tài)性信息含量（PIC）和基因多樣性（gene diversity）系數(shù)。用Gen Al Ex6.5[22]軟件進行標記位點的遺傳多態(tài)性分析，計算等位變異位點數(shù)（Na）、有效等位變異位點數(shù)（Ne）、Shannon’s 信息指數(shù)（I），并計算群體的分子方差（AMOVA）估測遺傳變異在亞群間和亞群內的分布。

1.3.2 群體遺傳結構分析 進一步通過Power-Marker 軟件分析各品種之間的遺傳相似性，用非加權配對法（UPGMA）進行聚類分型，經(jīng)i-TOL[23]軟件轉化為聚類無根樹狀圖；用Gen Al Ex6.5 進行主坐標分析（PCoA）。利用Structure 2.3.4[24]軟件估算群體的遺傳結構，并計算材料相應Q 值（第I 材料屬于第k 亞群的概率）。根據(jù)structure Harvester（http://taylor0. biology. ucla. edu/structure Harvester/#）確定合適的K值。

2 結果與分析

2.1 引物擴增多態(tài)性結果分析

從20 條染色體上選取了99 對擴增效果較好，數(shù)據(jù)缺失少的SSR 引物進行分析（圖1），最少的11號染色體上僅含1個標記位點，最多的4號、6號和7號染色體上含有8 個標記位點，平均每個染色體上含有4.95 個標記位點。所有位點都檢測到等位變異數(shù)，每個位點的等位變異數(shù)5～24 個，平均每個位點11.54個等位變異。每條染色體的等位變異數(shù)9～94個，平均每條染色體上57.10個等位變異（表2）。

表2 引物擴增多態(tài)性結果Table 2 Polymorphism result of primers

圖1 QTL相關的SSR標記位點在染色體上的分布Fig.1 Distribution of SSR marker sites on chromosomes

計算分析每個位點等位基因頻率，9 號染色體上Satt326 等位基因頻率最高為0.486，3 號染色體上Satt009 最低為0.095，平均等位基因頻率0.238。所有的105 個材料上所有等位位點都是純合基因型，沒有雜合基因型，說明所選大豆材料都是高度純合的育成品種。

2.2 時期亞群間遺傳多樣性分析

將105 份大豆材料按育成時期劃分為4 個亞群，以下簡稱時期亞群。由表3 可以看出4 個時期亞群和整個群體的遺傳多樣性，1991-2000 亞群的觀測等位基因數(shù)（9.121）、Nei's基因多樣性（0.839）、多態(tài)性信息含量（0.820）最高，而2001-2004 亞群的有效等位基因數(shù)（0.6088）最高。1963-1980 亞群的觀測等位基因數(shù)（6.152）、有效等位基因數(shù)（4.668）、Nei's基因多樣性（0.628）、多態(tài)性信息含量（0.562）都最低。以上結果說明1991-2000亞群的遺傳多樣性最高，而2001-2004 亞群的材料分布更均勻。1963-1980 亞群的遺傳多樣性最低可能是由樣本數(shù)偏少造成的。

表3 時期亞群間遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of period populations

2.3 時期亞群相似性系數(shù)聚類分析與分子方差分析

表4 相似性系數(shù)結果表明亞群間相似性系數(shù)（GI）≥0.679，亞群間遺傳距離（GD）≤0.387。說明分時期亞群間的遺傳差異較大。表5 和圖2 可以看出1991-2000 和2001-2004 兩個亞群的相似性系數(shù)高（GI=0.821），分化小，親緣關系相近。而1963-1980和1991-2000 兩亞群的遺傳距離較大，親緣關系也較遠（GD=0.387）。分時期亞群的相似性系數(shù)聚類分析和遺傳多樣性分析結果相似。但綜合考慮亞群內樣本數(shù)目和材料分布等因素的影響，尚不能說明大豆育成品種的基因遺傳多樣性和育種時間的關系。

表4 時期亞群間Nei's遺傳距離與相似性系數(shù)Table 4 Nei's genetic distance and genetic identity between period populations

表5 大豆材料在3個類群中的分布Table 5 Distribution of populations in 3 groups

圖2 基于Nei's遺傳距離大豆時期亞群聚類圖Fig.2 Period populations dendrogram of soybeans based on Nei's genetic distance

分子方差分析（AMOVA）分析結果表明，大豆時期亞群內分子變異占99%，群體間變異占1%，而群體分化系數(shù)Fst=0.013，P=0.010，組間差異顯著。說明亞群間的遺傳差異主要是由于亞群內的大豆材料遺傳差異較大造成的。分析大豆材料遺傳差異較大可能與大豆育成品種主要來自3個不同主要家族，且每個祖先親本對該品種的遺傳貢獻值差異造成的。

2.4 大豆材料聚類分析

UPGMA 聚類分析顯示（圖3），在相似系數(shù)D1=0.42 處將105 份大豆材料分為3 個類群，第Ⅰ類群包含49 份材料，主要來自1991-2000 和2001-2004兩時期。第Ⅱ類群含有25 份材料，其中17 份大豆材料來自1963-1980、1981-1991 這2 個相對較早的時期。第Ⅲ類群共31份材料，大豆各時期材料分布相對均勻。

圖3 105份大豆材料的UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA dendrogram of 105 accessions

從各時期亞群分布來看，4 個時期亞群分散聚集到3 個類群中，且各亞群有其聚類的偏好性。1991-2000、2001-2004 這兩個相對較晚的時期主要分布于第Ⅰ類群，這兩個時期的大豆資源具有一定的遺傳相似性。1963-1980 時期的大豆材料有50%聚集在第Ⅱ類群，且第Ⅱ類群68%的大豆材料來自1963-1980、1981-1990 這2 個時期，說明相對較早時期的大豆材料偏向聚集在第Ⅱ類群。1981-1990時期的大豆均勻分布于第Ⅱ、Ⅲ類群，說明1981-1990時期的大豆材料遺傳資源集中度相對較低。

2.5 群體遺傳結構分析

大豆材料的遺傳結構分析表明K 取值范圍為2～9，當K=3 時，△K 最大且較穩(wěn)定（圖4），大豆群體分為3 個類群（圖5）。分別對3 個類群內大豆材料統(tǒng)計（表6），第Ⅰ類群包含44份材料，第Ⅱ類群含有25份材料，第Ⅲ類群共36份材料。群體遺傳結構分布表明，遺傳結構分布與UPGMA 聚類結果具有高度一致性。有100份大豆材料的結構分布與聚類結果一致。UPGMA 聚類第Ⅰ類群中4 份四川省大豆材料（貢豆5 號、貢豆8 號、貢豆10、貢豆11）和江西省大豆材料贛豆4號在群體遺傳結構分析中分布在第Ⅲ類群。

圖4 似然對數(shù)的變化折線圖(ΔK)Fig.4 Line chart of ΔK with change of K value

圖5 105份大豆材料群體遺傳結構Fig.5 Population structure of 105 accessions

表6 大豆材料遺傳結構分布Table 6 Distribution of population structure

2.6 群體主坐標分析

分時期亞群的主坐標分析（圖6）表明，第一、二、三主成分分別解釋了4.12%、3.61%和2.90%的總變異。相對較后時期（1991-2000 和2001-2004）的材料基本聚集在同一區(qū)域，只有少數(shù)品種在其他區(qū)域，而1963-1980 分布于不同區(qū)域。說明大豆材料具有一定的時期特征，早期的大豆材料與相對較后兩時期的大豆材料有一定的遺傳差異，而這兩時期的遺傳差異小，親緣關系較近。

圖6 主坐標分析Fig.6 Principal coordinates analysis of subgroups

3 討論

3.1 QTL相關的SSR位點多態(tài)性分析

大豆種質資源研究中不少功能分子標記在遺傳變異或多樣性分析中都有廣泛應用。實驗室早期選擇ScoT[25]、EST-SSR[26]等標記研究黃淮海和南方地區(qū)大豆的遺傳多樣性，平均位點的等位變異數(shù)為8.81 和4.81。SSR 標記與這些功能分子標記相比，等位變異數(shù)為11.54，多態(tài)性更高，檢測更靈敏。此外，熊冬金等[18]也曾用161 個SSR 分子標記對209份大豆育成品種遺傳多樣性分析，多態(tài)性信息含量平均0.819，低于本研究中的0.836。這一結果與通常認為的樣本越大、標記數(shù)量越多則遺傳多樣性越高這一結論不符。通過比較發(fā)現(xiàn)，本研究中SSR 位點均是與QTL 相關且基因型豐富的位點，平均等位變異數(shù)11.54。而熊冬金等研究中SSR 位點數(shù)目多，包含與QTL 相關的SSR 位點141 個和QTL 無關的SSR 位點20 個。QTL 無關的SSR 位點大多基因型多態(tài)性簡單，與QTL 相關位點放一起，平均的等位變異數(shù)11.07，影響整體的遺傳多樣性水平，因此低于本實驗的群體遺傳多樣性。

通過Soybase網(wǎng)站查詢各位點信息，每個位點皆與幾個不同QTL 相關聯(lián)。例如基因型豐富的satt009 位點與大豆產(chǎn)量、開花數(shù)、種子異黃酮、種子硬度等10余個QTL性狀相關。在后期馴化培育中，QTL 連鎖區(qū)位點的基因型有自身局限性和連鎖阻力，理應遺傳多樣性小。但在育種過程中，育種者極大地保存了位點自身的遺傳多樣性，在探索基因型時引入新的多樣性，增加品種的低頻多樣性也是長期受馴化和近交的結果[27]。

3.2 育成品種大豆資源的遺傳多樣性分析

本研究選擇99 個QTL 相關的SSR 標記位點，對105 份大豆育成品種進行分時期亞群的遺傳多樣性分析，Nei's基因多樣性范圍為0.628～0.839，平均0.774。多態(tài)性信息含量0.562～0.820，平均0.742。時期亞群大豆育成品種遺傳多樣性高低順序為1991-2000＞2001-2004＞1981-1990＞1963-1980。時期亞群相似性系數(shù)聚類分析表示，與遺傳多樣性最高的1991-2000時期的亞群間遺傳距離大小順序為1963-1980（0.387）＞1981-1990（0.236）＞2001-2004（0.197）。說明1963-1980 與1991-2000 兩時期的親緣關系最遠，而2001-2004 與1991-2000 兩時期的親緣關系最近。大豆分時期亞群的遺傳多樣性呈現(xiàn)先增后減的趨勢與改革開放后我國從國外引入大量的大豆材料有關，我國大豆育成品種遺傳基礎有所拓寬。而在現(xiàn)有的遺傳基礎上再增加大豆遺傳多樣性，需在今后的育種工作中進一步拓寬親本來源。

分子方差分析表明大豆材料99%為亞群內變異，僅1%為亞群間變異。亞種群內的高變異象征著對經(jīng)濟上重要的性狀更頻繁地被選擇，以致各主要家族的祖先親本對該品種的遺傳貢獻值有所差異。育種親本越復雜的品種，有多個主要家族的遺傳貢獻，多態(tài)性位點的等位變異數(shù)增加的幾率越大，品種的遺傳多樣性越高。然而，育成品種所利用的種質資源還是相對較狹窄，一方面種質育種不能囊括優(yōu)質親本所有的優(yōu)勢表型，另一方面這與我國引進外來種質資源無法滿足育種需求不無關系。其次大豆材料為高度純合的育成品種也部分影響著遺傳變異結果。

3.3 育成品種大豆的群體遺傳結構分析

本研究對3 個主要家族的105 份大豆材料的聚類分析和遺傳結構分析都認為它們明顯分為3 類群，且兩方面的分析結果高度一致，也與Dong 等[28]利用53 對SSR 標記對100 份菜豆品種的UPGMA 亞群與結構亞群分析結果具有高度一致性。這些群體的聚類表現(xiàn)出極大的一致性，與大豆育成品種在主要家族系譜中代數(shù)及各時期亞群的遺傳基礎粗略相關。例如類群2 中大豆育成品種在A034、A133和A231 家族系譜中代數(shù)在3 代以前，類群1 中大豆品種則在3 個主要家族中代數(shù)靠后，主要為4 代以后品種。類群2 在親緣關系上更貼近3 個主要家族，而類群1 與3 個主要家族親緣關系不如類群2，其他的遺傳背景影響更大。

從各時期亞群的遺傳基礎來看，且各亞群有其聚類的偏好性，遺傳基礎相似的亞群有聚在同一類群中的趨勢，例如1991-2000 和2001-2004 兩個時期內的大豆材料遺傳相似性高，所以主要集中在類群1中，1963-1980和上述兩時期大豆材料的遺傳相似性低，則偏向于集中在類群2 中。關于大豆育成品種遺傳組分受到分時期遺傳基礎影響這一結論有待明確，目前尚無文獻報道，但普遍認為有生態(tài)區(qū)劃分遺傳基礎[29,30]。

聚類后出現(xiàn)的相同來源的種質分別聚類在不同類群中或不同來源的種質相聚在同一類群的現(xiàn)象，常見于群體遺傳結構的研究中[31,32]。這與種質的遺傳背景和種質間遺傳差異相關。不同來源的種質可能遺傳背景相似，相同來源的種質也可能遺傳差異較大。說明大豆育種不能簡單的異地雜交育種，考慮種質間的遺傳相似性才能有效利用大豆種質資源。

4 結論

利用99 個與大豆QTL 性狀相關的SSR 位點，對黃淮海和南方產(chǎn)區(qū)的105份大豆育成品種進行遺傳多樣性和群體結構分析。按品種育成時期將群體劃分為4 個亞群，研究表明不同時期內大豆品種基因交流頻繁，UPGMA 聚類和群體遺傳結構分析均將105 份材料分為3 個類群，且結果高度一致，大豆育成品種遺傳多樣性水平具有一定的時期特征，總體呈遞增趨勢。