劉勇，鄒亞文，孫嬴，王雪梅，余祖江

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 感染科，河南 鄭州 450000）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是一個全球性的公共衛(wèi)生問題，世界范圍約有2.5億乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）攜帶者［1］。據(jù)統(tǒng)計，我國約有7 000萬例慢性HBV感染者，是全球HBV感染人數(shù)最多的國家［2］。中國慢性乙型肝炎防治指南（2019版）［3］推薦意見指出：血清HBV DNA陽性、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）大于正常值上限（upper limit of normal，ULN）且排除其他原因所致者，均應(yīng)進行抗病毒治療。對于ALT正常乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）陽性慢性HBV感染者，既往觀念認為患者處于免疫耐受期，肝組織通常無顯著炎癥和纖維化，可暫不啟動抗病毒治療。然而，近年來的研究表明，在ALT正?；蜉p度升高的慢性HBV感染者中，仍有相當比例的患者存在顯著肝組織學(xué)病變［炎癥活動度≥G2和（或）纖維化程度≥S2］［4－7］，這部分患者同樣有較高風(fēng)險進展為肝硬化、肝細胞癌和終末期肝?。?］。因此，準確評估ALT正常的慢性HBV感染者肝組織病變程度，對于是否啟動抗病毒治療有重要意義［9］。

肝組織活檢是評估肝組織學(xué)病變的金標準［10－11］，但肝活檢是一項有創(chuàng)傷性的檢查，并且有潛在出血風(fēng)險和取樣誤差等缺點［12］。因此，肝活檢在臨床上的應(yīng)用受到了限制。近些年，多種肝組織無創(chuàng)評估方法，如血清無創(chuàng)模型和瞬時彈性超聲（transient elastography，TE）成為評估肝纖維化的主要替代方法［13－16］。然而，上述無創(chuàng)模型主要用于肝纖維化分期的評估，而對肝組織炎癥的診斷效能有限。目前，臨床上缺乏同時評估肝組織炎癥分級和肝纖維化分期的無創(chuàng)模型。因此，構(gòu)建新型無創(chuàng)模型來預(yù)測ALT正常HBeAg陽性慢性HBV感染者是否存在顯著組織學(xué)病變［炎癥活動度≥G2和（或）纖維化程度≥S2］是臨床研究的熱點問題。

本研究旨在探討ALT持續(xù)正常HBeAg陽性慢性HBV感染者發(fā)生顯著肝組織病變的獨立危險因素，并進一步基于危險因素構(gòu)建一種預(yù)測肝組織學(xué)病變的無創(chuàng)模型，為篩選慢性HBV感染者進行肝穿刺活檢或啟動抗病毒治療提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 研究對象 回顧性收集了2016年5月至2020年11月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診并行肝組織病理活檢的慢性HBV感染者的臨床資料。慢性HBV感染的定義為HBsAg和／或HBV DNA陽性6個月以上［3］。

入組標準：（1）HBeAg陽性；1 a內(nèi)3～4次的隨訪ALT水平均在正常參考值范圍（＜40 IU·L－1）；（2）既往未曾接受抗病毒治療。排除標準：（1）HBeAg陰性；（2）1 a隨訪期ALT水平異常（＞40 IU·L－1）；（3）合并其他病毒感染如HCV、HEV或HIV感染，伴有非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病和遺傳性肝病等。最終，研究納入了251例ALT持續(xù)正常HBeAg陽性的慢性HBV感染者。其中，2016年5月至2018年12月的156例患者構(gòu)成了訓(xùn)練隊列，2019年1月至2020年11月的95例患者構(gòu)成了驗證隊列。本研究通過了鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有入組患者均簽署了知情同意書，研究程序符合1975年赫爾辛基宣言。

1.2 實驗室指標檢測

1.2.1 血常規(guī)檢測 采用深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司全自動血細胞分析儀BC－3000 Plus。簡要流程如下：（1）用含有EDTA－K2抗凝劑的真空采血管采取靜脈血2 mL；（2）混勻靜脈血后，將采樣針插入抗凝管；（3）選擇檢測界面為“全血”模式；（4）按下檢測鍵，對樣本血細胞計數(shù)。

1.2.2 肝功能檢測 采用日本日立公司的全自動生化分析儀7600 Series，其中ALT的正常參考值范圍為9～40 IU·L－1。簡要流程如下：（1）一次性真空管采集靜脈血5 mL；（2）將樣品加至反應(yīng)杯，使待測樣品和反應(yīng)試劑充分混合均勻，進行生化反應(yīng)；（3）光學(xué)測量儀對反應(yīng)物進行光學(xué)比色，得到檢測結(jié)果。

1.2.3 HBV免疫學(xué)標志物 包括HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb等，采用化學(xué)發(fā)光微粒子分析技術(shù)，儀器和試劑為美國雅培公司的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀ARCHITECT i2000SR及配套專用試劑，嚴格按照試劑說明書進行操作和結(jié)果判定。血清HBV DNA的提取采用中山大學(xué)達安基因股份有限公司的乙型肝炎病毒（HBV）核酸擴增熒光檢測試劑盒，然后使用羅氏Light Cycler 480實時熒光定量PCR儀進行HBV DNA定量，檢測下限范圍＜100 IU·mL－1。簡要流程如下：（1）血清樣本6 000 r·min－1離心20 s；（2）吸取上清液40μL，加入40μL DNA裂解液，充分混合均勻；（3）100℃沸水浴10 min；（4）10 000 r·min－1離心5 min，取上清液2μL用于PCR上樣；（5）配制PCR擴增體系，擴增程序為93℃3 min預(yù)變性，93℃45 s，55℃45 s，72℃60 s，重復(fù)40個循環(huán)。

1.3 肝組織病理評估 在超聲引導(dǎo)下，使用16G一次性活檢針行肝組織穿刺活檢，獲取的肝組織經(jīng)100 g·L－1的甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，隨后行HE染色、網(wǎng)狀纖維和Masson染色。獲取的肝組織長度大于15 mm，且鏡下至少包含6個匯管區(qū)認為取樣合格。所有肝組織切片由2位病理醫(yī)生獨立閱片，當閱片結(jié)果存在差異時由第3位高年資病理醫(yī)生重新閱片并給出病理結(jié)果。根據(jù)Scheuer評分系統(tǒng)［17］，慢性HBV感染者的肝組織炎癥分級為G0～4，肝組織纖維化程度分為S0～4。根據(jù)慢性乙型肝炎防治指南（2019版）［3］推薦，肝組織炎癥活動度≥G2和（或）纖維化程度≥S2存在顯著組織學(xué)病變，需要啟動抗病毒治療。

1.4 常用臨床無創(chuàng)模型 臨床廣泛應(yīng)用的評估肝組織病變的無創(chuàng)模型包括肝硬度測定（liver stiffness measurement，LSM）、谷草轉(zhuǎn)氨酶與血小板比率指數(shù)（aspartate aminotransferase to platelet ratio index，APRI）［13］和基于4因子的纖維化指數(shù)（fibrosis4 score，F(xiàn)IB－4）［14］。采用FibroSacn測定肝硬度值來評估肝纖維程度。患者需在血清總膽紅素＜51μmol·L－1的情況下空腹測定，連續(xù)測量10次取平均值記錄為測定的肝硬度值［16］。APRI和FIB－4的計算公式如下：

式中I1為APRI，ρ1為谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平（IU·L－1），ρ’為AST正常值上限，這里為40 IU·L－1，A為血小板計數(shù)（platelets，PLT）（×109L－1），I2為FIB－4，B為年齡（歲），ρ2為ALT水平（IU·L－1）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計分析采用SPSS 25.0和Med-Calc 15.2軟件。符合正態(tài)分布的連續(xù)性變量以均值±標準差（±s）表示，方差齊性的兩組數(shù)據(jù)采用t檢驗；非正態(tài)分布的連續(xù)性變量以中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，組間采用Mann－Whitney U檢驗；分類變量以頻數(shù)和率（%）表示，組間采用Pearson χ2檢驗。使用單因素和多因素logistic回歸分析篩選肝組織發(fā)生顯著病變的獨立危險因素，并應(yīng)用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）、曲線下面積（area under curve，AUC）評估無創(chuàng)模型的預(yù)測效能。AUC數(shù)值＞0.5且＜1.0，AUC越接近1.0，提示診斷效果越好。0.5＜AUC≤0.7提示診斷價值較低，0.7＜AUC≤0.8提示診斷價值中等，0.8＜AUC≤0.9提示診斷價值較高，AUC＞0.9提示診斷價值極高。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性HBV感染者的臨床參數(shù) 根據(jù)入院時間順序，將251例初治ALT持續(xù)正常HBeAg陽性慢性HBV感染者分為訓(xùn)練隊列（n＝156）和驗證隊列（n＝95）。入組患者的基線臨床參數(shù)見表1?；颊咂骄挲g為（34.1±7.8）歲，男性患者占比52.2%，HBsAg定量中位水平為4.1 log10IU·mL－1，HBeAg中位水平為2.9 log10S／CO，HBV DNA 中位水平為7.2 log10IU·mL－1。根據(jù)Scheuer評分系統(tǒng)，入組的251例患者中共有88例患者存在顯著肝組織病變。訓(xùn)練隊列和驗證隊列分別有34例（21.8%）和25例（26.3%）患者存在顯著肝炎癥，48例（30.8%）和30例（31.6%）患者存在顯著肝纖維化，55 例（35.3%）和33例（34.7%）存在顯著肝組織病變。訓(xùn)練隊列與驗證隊列相比較，兩組間的年齡和性別比例、白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、PLT、ALT、AST、堿性磷酸酶、谷氨?；D(zhuǎn)移酶（gamma－glutamyl transferase，GGT）、總膽紅素、白蛋白、球蛋白、HBsAg、HBeAg、HBV DNA 及LSM 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 入組慢性HBV感染者基線臨床參數(shù)

2.2 慢性HBV感染者存在顯著組織病變的獨立預(yù)測因子 在訓(xùn)練隊列中，入組患者根據(jù)肝組織病理結(jié)果分為非顯著肝組織病變組（炎癥活動度＜G2且纖維化程度＜S2）和顯著肝組織病變組［炎癥活動度≥G2和（或）纖維化程度≥S2］。顯著肝組織學(xué)病變組與非顯著肝組織病變組相比，患者的年齡、ALT、GGT和LSM更高，而患者的PLT、HBsAg、HBeAg和HBV DNA更低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。見表2。單因素logistic回歸分析表明，患者年齡、PLT、ALT、GGT、HBsAg、HBeAg、HBV DNA和LSM水平與慢性HBV感染者的肝組織病變密切相關(guān)（P＜0.05）；多因素回歸分析表明，年齡、HBsAg定量和LSM是ALT持續(xù)正常HBeAg陽性慢性HBV感染者肝組織學(xué)發(fā)生顯著病變的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3。

表2 訓(xùn)練隊列中非顯著組織學(xué)病變組與顯著組織學(xué)病變組患者各指標比較

表3 ALT持續(xù)正常HBeAg陽性慢性HBV感染者發(fā)生顯著組織學(xué)病變的logistic回歸分析

2.3 新型無創(chuàng)模型的構(gòu)建及預(yù)測效能比較 根據(jù)logistic回歸模型，進一步構(gòu)建了由年齡、HBsAg和LSM組成的預(yù)測肝組織學(xué)病變的新型無創(chuàng)模型：

式中X為年齡（歲），ρ為HBsAg水平（log10IU／mL），P為LSM水平（kPa）。在訓(xùn)練隊列中，該無創(chuàng)模型預(yù)測顯著肝組織病變的AUC為0.861，優(yōu)于臨床常用的無創(chuàng)模型，如APRI、FIB－4和LSM。同樣地，在驗證隊列該無創(chuàng)模型預(yù)測顯著肝組織病變的AUC為0.872，仍優(yōu)于APRI、FIB－4和LSM。見表4、圖2。

圖1 訓(xùn)練隊列中新型無創(chuàng)模型與臨床常用無創(chuàng)模型的預(yù)測效能比較

圖2 驗證隊列中新型無創(chuàng)模型與臨床常用無創(chuàng)模型的預(yù)測效能比較

表4 新型無創(chuàng)模型與臨床常用無創(chuàng)模型的預(yù)測效能比較

鑒于該新型無創(chuàng)模型是在LSM的基礎(chǔ)上引入了另外2個新指標，因此，進一步應(yīng)用凈重新分類指數(shù)（net reclassification index，NRI）來比較新型無創(chuàng)模型預(yù)測能力的準確性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不管是訓(xùn)練隊列（NRI＝14.8%，P＝0.031）還是驗證隊列（NRI＝18.6%，P＝0.033），新型無創(chuàng)模型的預(yù)測能力均有所增強。

3 討論

本研究顯示，ALT持續(xù)正常HBeAg陽性慢性HBV感染患者中有約1／3的患者存在顯著肝組織學(xué)病變。基于常用臨床參數(shù)，采用logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)年齡、HBsAg定量和LSM是ALT持續(xù)正常HBeAg陽性慢性HBV感染者肝組織學(xué)發(fā)生顯著病變的獨立危險因素，并構(gòu)建了由年齡、HBsAg和LSM組成的新型無創(chuàng)模型。該無創(chuàng)模型在訓(xùn)練隊列和驗證隊列預(yù)測顯著肝組織病變的AUC分別為0.861和0.872，均明顯優(yōu)于APRI、FIB－4和LSM。

在我國廣泛實行乙型肝炎疫苗預(yù)防接種之前，慢性HBV感染以母嬰傳播為主。隨著HBV感染時間延長，多數(shù)患者會打破“免疫耐受”階段，進入到“免疫清除”階段。李強等［18］研究發(fā)現(xiàn)，年齡＞30歲是ALT正常HBeAg陽性高病毒載量的慢性HBV感染者發(fā)生顯著肝組織學(xué)病變的危險因素。本研究表明，對于ALT持續(xù)正常HBeAg陽性慢性HBV感染者，發(fā)生顯著肝組織病變患者的中位年齡高于未發(fā)生肝組織病變患者（38歲比32歲，P＜0.001）。中國《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》［3］同樣指出，ALT持續(xù)正常、無肝硬化／肝癌家族史但年齡＞30歲的患者，建議行肝纖維化無創(chuàng)評估或肝組織學(xué)檢查。因此，年齡是影響慢性HBV感染者肝組織學(xué)病變的重要因素。

HBsAg水平通常用于區(qū)分慢性HBV感染自然史的不同階段，近年來的研究表明HBsAg在區(qū)分慢性HBV感染患者肝組織病變方面有一定價值［19］。Martinot－peignoux等［20］研究表明，HBsAg水平與初治的HBeAg陽性慢性HBV感染者肝纖維化程度密切相關(guān)。Gao等［21］研究則發(fā)現(xiàn)HBsAg水平是預(yù)測ALT＜2 ULN的HBeAg陽性慢性HBV感染者發(fā)生顯著肝組織學(xué)病變的獨立因子。目前，HBsAg用于反映肝組織學(xué)病變的機制尚不清楚，推測可能機制如下：隨著HBV感染時間延長，宿主免疫功能活化進而靶向HBV在體內(nèi)復(fù)制，導(dǎo)致了HBsAg合成減少，同時造成了肝組織損傷［19］。

LSM在評估慢性HBV感染者肝纖維化方面的價值已得到廣泛證實［22－23］。歐洲肝病學(xué)會指南推薦采用LSM作為評估慢性乙型肝炎患者肝纖維化程度的無創(chuàng)方法［15］。我國肝纖維化診斷和治療共識［16］指出，膽紅素、ALT正常的慢性HBV 感染者LSM≥9.0 kPa考慮進展性肝纖維化，LSM＜6.0 kPa排除進展性肝纖維化，LSM在6.0～9.0 kPa之間者可考慮肝活檢明確肝組織病變。Lee等［24］研究發(fā)現(xiàn)LSM、血清觸珠蛋白、載脂蛋白A1和α2－巨球蛋白水平是預(yù)測慢性HBV感染者發(fā)生顯著肝纖維化的獨立因子，將LSM與血清學(xué)參數(shù)聯(lián)合組成的無創(chuàng)模型能使近50%慢性HBV感染者免于肝穿刺活檢。在本研究中，同樣發(fā)現(xiàn)將LSM、年齡和HBsAg聯(lián)合構(gòu)建的新型無創(chuàng)模型預(yù)測顯著肝組織學(xué)病變的效能要優(yōu)于LSM。分析可能原因如下：本研究入組患者的ALT水平均在正常范圍，雖然這在一定程度上降低了因ALT水平升高對LSM準確度的影響，但LSM還可能受到患者肋間隙寬度、肥胖程度、膽紅素水平及操作者業(yè)務(wù)水平等諸多因素的影響［25］，而該新型無創(chuàng)模型綜合評估了患者感染HBV的時間、血清學(xué)HBsAg水平及肝硬度，最大限度避免了因單一參數(shù)變異造成的預(yù)測效能下降。此外，構(gòu)成該新型無創(chuàng)模型的3個參數(shù)在臨床實踐中易于獲得，因此具有較高的臨床應(yīng)用價值。

本研究存在以下不足。第一，本研究設(shè)計屬于單中心的回顧性研究，劃分訓(xùn)練隊列和驗證隊列主要根據(jù)患者入院時間，這種分組方式可能會造成選擇偏倚。因此，該研究結(jié)論尚需要前瞻性、多中心的隊列研究進行驗證。第二，研究入組患者均來源于省級三甲醫(yī)院，這些患者肝組織病變的檢出率高于基層醫(yī)療機構(gòu)就診患者，因此，該無創(chuàng)模型是否適用于所有ALT正常HBeAg陽性慢性HBV感染者，仍有待進一步研究。第三，由年齡、HBsAg和LSM組成的新型無創(chuàng)模型的計算公式相對復(fù)雜，在后續(xù)的研究中仍需對模型進行精簡完善，以期更好地服務(wù)臨床。

綜上所述，ALT持續(xù)正常HBeAg陽性慢性HBV感染者仍可能發(fā)生顯著肝組織學(xué)病變。由年齡、HBsAg和LSM組成的新型無創(chuàng)模型預(yù)測顯著肝組織病變的效能優(yōu)于APRI、FIB－4和LSM，該無創(chuàng)模型對臨床診療可能有積極作用。