石 馨，惠 明，田 青，黃繼紅

河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001

濃香型白酒亦稱(chēng)瀘香型，香氣主體為己酸乙酯，具有芳香濃郁、香味協(xié)調(diào)、尾凈余長(zhǎng)等特點(diǎn)，在我國(guó)白酒市場(chǎng)所占份額最大[1-3]。由于環(huán)境、氣候、原料等原因，導(dǎo)致部分濃香型白酒香氣不足、品質(zhì)較差，有研究將產(chǎn)酯酵母應(yīng)用于濃香型白酒的釀造，改善酒體品質(zhì)，并取得了較好的成效[4-5]。產(chǎn)酯酵母[6]是一類(lèi)能夠產(chǎn)生酯類(lèi)、醇類(lèi)等多種揮發(fā)性香氣物質(zhì)的酵母菌，普遍存在于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，將產(chǎn)酯酵母應(yīng)用于白酒發(fā)酵可增加香氣物質(zhì)的含量和種類(lèi)，是改善其風(fēng)味、提高品質(zhì)的一種有效方式[7-9]，在白酒釀造行業(yè)中應(yīng)用較為廣泛。目前所研究的產(chǎn)酯酵母大多高產(chǎn)乙酸乙酯，而主產(chǎn)己酸乙酯的酵母相對(duì)較少，本實(shí)驗(yàn)室前期從大曲中分離出1株產(chǎn)酯酵母，經(jīng)鑒定為異常威客漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)，發(fā)現(xiàn)其具有較高的產(chǎn)己酸乙酯能力。探究該酵母的發(fā)酵產(chǎn)酯特點(diǎn)，對(duì)于提高濃香型白酒品質(zhì)具有重要意義。目前針對(duì)該類(lèi)酵母的產(chǎn)酯發(fā)酵調(diào)控研究較少[10-11]，因此產(chǎn)酯條件還需調(diào)整和優(yōu)化。作者以異常威客漢姆酵母(命名為WickerhamomycesanomalusY-1)為研究對(duì)象，采用均勻設(shè)計(jì)及主成分分析法優(yōu)化該菌株的產(chǎn)酯條件，確定最適培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、轉(zhuǎn)速及接種量，并利用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(SPME-GC-MS)分析在該條件下的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，探究其應(yīng)用潛力，為濃香型白酒的提酯增香提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來(lái)源

WickerhamomycesanomalusY-1，由工業(yè)微生物菌種保藏與選育河南省工程實(shí)驗(yàn)室篩選和保藏。

1.1.2 主要試劑

酵母膏、蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)公司；玉米淀粉：上海麥克林生化科技有限公司；氯化鈉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙酸正丁酯(2%)：色譜純，無(wú)錫市展望化工試劑公司；其他試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：瑞楚生物有限公司。

產(chǎn)酯培養(yǎng)基：酵母膏10 g/L，玉米淀粉2.9 g/L，蛋白胨20 g/L，(NH4)2SO40.1 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO40.1 g/L，CaCl20.1 g/L，NH4Cl 0.2 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津有限公司；TRACE1300氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：賽默飛世爾科技公司；固相微萃取裝置(SPME手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭)：江蘇默克儀器有限公司；ZHJH-C1112C超凈工作臺(tái)、ZQZY-CS全溫恒溫培養(yǎng)搖床、ZXSD-A1160恒溫培養(yǎng)箱：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1WickerhamomycesanomalusY-1耐受性研究

考察WickerhamomycesanomalusY-1生長(zhǎng)溫度耐受性(16、22、28、34、40 ℃)、pH耐受性(3、4、5、6、7、8)、乙醇耐受性(乙醇體積分?jǐn)?shù)0%、2%、4%、6%、8%、10%)。取適量斜面保藏的菌體接種于YPD液體培養(yǎng)基中，120 r/min、28 ℃培養(yǎng)24 h，制備種子液，按5%(V/V)將種子液接種于前期優(yōu)化的產(chǎn)酯培養(yǎng)基中，分別按照上述不同溫度、pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液在600 nm處的吸光度，并參考文獻(xiàn)[12]測(cè)定發(fā)酵液中總酯含量。

1.3.2 均勻優(yōu)化試驗(yàn)

在作者前期對(duì)該菌株生長(zhǎng)特征研究的基礎(chǔ)上[13]，以己酸乙酯相對(duì)含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，溫度(X1)、培養(yǎng)時(shí)間(X2)、轉(zhuǎn)速(X3)、接種量(X4)為考察因素，進(jìn)行四因素六水平的均勻優(yōu)化試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 均勻優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平Table 1 Uniform optimization test design factors and levels

1.3.3 揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定方法

量取5 mL樣品于20 mL的頂空瓶中，加入2%乙酸正丁酯內(nèi)標(biāo)液5 μL，放入磁力攪拌轉(zhuǎn)子，加蓋密封。插入50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，纖維頭置于頂空瓶上部空間，50 ℃水浴平衡10 min，120 r/min萃取50 min，萃取結(jié)束后取出手柄，直接進(jìn)行GC-MS分析。GC-MS設(shè)定條件參考文獻(xiàn)[14]。

1.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)優(yōu)化后的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，并與預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，確定該酵母產(chǎn)酯的最適條件。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 26、Origin2018、DPS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸、主成分回歸等統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Wickerhamomyces anomalus Y-1耐受性研究

白酒釀造是一個(gè)復(fù)雜的生化反應(yīng)過(guò)程，影響微生物生長(zhǎng)發(fā)育的環(huán)境因素有很多，乙醇體積分?jǐn)?shù)、pH值和溫度是極其重要的因素。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酒醅內(nèi)部的酸度、溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)不斷升高，對(duì)酵母的生長(zhǎng)和發(fā)酵均會(huì)產(chǎn)生阻礙作用，高溫也會(huì)導(dǎo)致酶系的鈍化直至失活。在發(fā)酵后期，酒醅內(nèi)過(guò)高的溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)會(huì)使發(fā)酵停止。因此，對(duì)WickerhamomycesanomalusY-1進(jìn)行耐受性研究，研究不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、pH值、溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酯能力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、pH值和溫度對(duì)Wickerhamomyces anomalus Y-1生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of different ethanol content,pH value, and temperature on Wickerhamomyces anomalus Y-1 growth

由圖1a可知，酵母的D(600)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，同時(shí)產(chǎn)酯能力也隨之下降，可見(jiàn)乙醇對(duì)該酵母的生長(zhǎng)和產(chǎn)酯均有抑制作用，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于4%時(shí)，產(chǎn)酯能力較為穩(wěn)定，大于4%時(shí)，產(chǎn)酯能力明顯下降。由圖1b可知，隨著pH值的升高，該酵母的D(600)和產(chǎn)酯量均呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)，在pH3和pH8時(shí)，生長(zhǎng)和產(chǎn)酯能力均較差，在pH5時(shí)，產(chǎn)酯量最大。由圖1c可知，該酵母隨著溫度的升高，D(600)和產(chǎn)酯量呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)，在28 ℃時(shí)產(chǎn)酯能力最強(qiáng)，當(dāng)溫度高于28 ℃時(shí)，生長(zhǎng)能力和產(chǎn)酯能力都急劇下降，在40 ℃時(shí)，該酵母幾乎不再產(chǎn)酯。

2.2 Wickerhamomyces anomalus Y-1產(chǎn)酯條件優(yōu)化及回歸分析

WickerhamomycesanomalusY-1發(fā)酵液中的揮發(fā)性物質(zhì)主要包括酯類(lèi)、高級(jí)醇類(lèi)、酸類(lèi)。其中酯類(lèi)相對(duì)含量最高的是己酸乙酯，所以己酸乙酯可視為該酵母的特征產(chǎn)物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的酯類(lèi)物質(zhì)依次為辛酸乙酯、庚酸乙酯和十六酸乙酯，故將這4種酯作為該酵母的關(guān)鍵酯類(lèi)物質(zhì)。均勻優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示，6個(gè)試驗(yàn)組中酯類(lèi)相對(duì)含量和關(guān)鍵酯相對(duì)含量變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明這幾種酯類(lèi)物質(zhì)在整個(gè)揮發(fā)性組分中占主導(dǎo)地位。

表2 Wickerhamomyces anomalus Y-1均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of ester-producing conditions by Wickerhamomyces anomalus Y-1

產(chǎn)酯酵母代謝復(fù)雜，與發(fā)酵溫度、時(shí)間、接種量、轉(zhuǎn)速等多種因素相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，高溫可以使促進(jìn)酯類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生的酶系鈍化失活，從而降低酯類(lèi)相對(duì)含量[15]。培養(yǎng)時(shí)間是影響酵母產(chǎn)酯的一個(gè)重要因素，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體活力逐漸降低，產(chǎn)酯能力隨之下降。轉(zhuǎn)速過(guò)大或過(guò)小都會(huì)導(dǎo)致溶氧量發(fā)生變化，影響菌體正常生長(zhǎng)，從而影響酵母的產(chǎn)酯能力。接種量少會(huì)導(dǎo)致單位體積發(fā)酵液中所含菌體數(shù)過(guò)少，影響產(chǎn)酯效果，接種量多則會(huì)使有限的營(yíng)養(yǎng)成分無(wú)法供應(yīng)過(guò)多的菌體生長(zhǎng)，從而引起產(chǎn)酯能力下降[16]。WickerhamomycesanomalusY-1酵母所產(chǎn)酯類(lèi)中己酸乙酯相對(duì)含量最高，且己酸乙酯為濃香型白酒的主體風(fēng)味，分析發(fā)酵條件對(duì)其產(chǎn)己酸乙酯相對(duì)含量的影響，對(duì)提高濃香型白酒品質(zhì)有重要意義。因此采用二次多項(xiàng)式逐步回歸法對(duì)發(fā)酵液中酯類(lèi)相對(duì)含量(Y1)、關(guān)鍵酯相對(duì)含量(Y2)、己酸乙酯相對(duì)含量 (Y3)與溫度(X1)、培養(yǎng)時(shí)間(X2)、轉(zhuǎn)速(X3)、接種量(X4) 4個(gè)因素進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。酯類(lèi)相對(duì)含量、關(guān)鍵酯相對(duì)含量以及己酸乙酯相對(duì)含量的回歸方程均達(dá)到顯著水平(P<0.05)，且己酸乙酯相對(duì)含量回歸方程的R2接近1，說(shuō)明該回歸方程對(duì)己酸乙酯相對(duì)含量這一觀(guān)測(cè)值擬合度最好，其次是酯類(lèi)相對(duì)含量、關(guān)鍵酯相對(duì)含量。

表3 最適條件預(yù)測(cè)及回歸方程Table 3 Optimal condition prediction and regression equation

2.3 發(fā)酵液主成分分析

對(duì)酯類(lèi)(Y1)、關(guān)鍵酯(Y2)、己酸乙酯(Y3)、高級(jí)醇類(lèi)(Y4)和酸類(lèi)(Y5)5個(gè)指標(biāo)的相對(duì)含量進(jìn)行主成分分析，各主成分特征值、貢獻(xiàn)率及累計(jì)貢獻(xiàn)率如表4所示。根據(jù)累計(jì)貢獻(xiàn)率大于85%的原則[17]，提取的3個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率可達(dá)到98.742%，即提取的3個(gè)主成分可以解釋全部指標(biāo)的98.742%的信息，能夠反映發(fā)酵液整體情況。

表4 5個(gè)主成分的特征值、貢獻(xiàn)率及累計(jì)貢獻(xiàn)率Table 4 Eigenvalues, contribution rate, and cumulative contribution rate of the 5 principal components

通過(guò)主成分分析，得到5個(gè)指標(biāo)的3個(gè)主成分特征值的成分矩陣及對(duì)應(yīng)系數(shù)，如表5所示。根據(jù)成分絕對(duì)值大小可以看出，決定第1主成分的指標(biāo)是酯類(lèi)相對(duì)含量(Y1)、關(guān)鍵酯相對(duì)含量(Y2)、己酸乙酯相對(duì)含量(Y3)，決定第2主成分的指標(biāo)是酸類(lèi)相對(duì)含量(Y5)，決定第3主成分的指標(biāo)是醇類(lèi)相對(duì)含量(Y4)。

表5 5個(gè)指標(biāo)的成分矩陣及對(duì)應(yīng)系數(shù)Table 5 Component matrix and corresponding coefficients of 5 indicators

根據(jù)特征值對(duì)應(yīng)的系數(shù)矩陣，得出主成分表達(dá)式(1)、(2)、(3)以及綜合得分表達(dá)式(4)。

F1=0.527Y1+0.566Y2-0.032Y3-0.199Y4+0.548Y5；

(1)

F2=-0.336Y1+0.133Y2-0.053Y3+0.204Y4+0.908Y5；

(2)

F3=0.252Y1-0.051Y2+0.18Y3+0.944Y4-0.101Y5；

(3)

F=0.593F1+0.216F2+0.190F3。

(4)

通過(guò)以上表達(dá)式計(jì)算主成分F1、F2、F3和綜合表達(dá)式F，如表6所示，第4組試驗(yàn)綜合得分最高，為0.943；第3組試驗(yàn)綜合得分最低，為-1.127，與均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果相符，均是第4個(gè)試驗(yàn)組發(fā)酵液品質(zhì)最高。

表6 主成分得分Table 6 Principal component score

2.4 最佳培養(yǎng)條件預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

二次多項(xiàng)式逐步回歸模型預(yù)測(cè)表明，當(dāng)培養(yǎng)溫度25.2 ℃、培養(yǎng)時(shí)間12.2 h、轉(zhuǎn)速180 r/min、接種量為2.0%(V/V)時(shí)，己酸乙酯相對(duì)含量預(yù)測(cè)值為383.720 μg/L。考慮發(fā)酵液整體水平，包括酯類(lèi)相對(duì)含量及關(guān)鍵酯相對(duì)含量，并結(jié)合二者的回歸分析以及主成分分析給出的最優(yōu)因素組合，最終確定最優(yōu)條件為培養(yǎng)溫度25.2 ℃、培養(yǎng)時(shí)間12.2 h、轉(zhuǎn)速180 r/min、接種量為9.8%(V/V)。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示，發(fā)酵液中酯類(lèi)相對(duì)含量、關(guān)鍵酯相對(duì)含量、己酸乙酯相對(duì)含量分別為680.594、551.201、380.360 μg/L，其中己酸乙酯相對(duì)含量接近于預(yù)測(cè)值，并明顯高于試驗(yàn)組中得分最高的第4組中己酸乙酯相對(duì)含量，酯類(lèi)相對(duì)含量、關(guān)鍵酯相對(duì)含量均高于預(yù)測(cè)值。說(shuō)明在該條件下培養(yǎng)，不僅使發(fā)酵液中己酸乙酯相對(duì)含量明顯提升，對(duì)發(fā)酵液整體水平也有一定改善效果。

2.5 最佳培養(yǎng)條件下的風(fēng)味物質(zhì)分析

利用SPME-GC-MS測(cè)定最佳培養(yǎng)條件下發(fā)酵液中的揮發(fā)性物質(zhì)，總離子流色譜圖如圖2所示。與NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合保留時(shí)間對(duì)樣品中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性，共鑒定出44種揮發(fā)性物質(zhì)，主要包括酯類(lèi)、醇類(lèi)、酸類(lèi)、醛類(lèi)等，物質(zhì)種類(lèi)及相對(duì)含量如表7所示。

圖2 揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖Fig.2 GC-MS total ion chromatography of volatile components

表7 發(fā)酵液揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)及相對(duì)含量Table 7 Types and relative content of volatile substances in fermentation broth

酯類(lèi)物質(zhì)對(duì)白酒的風(fēng)格形成具有重要意義，濃香型白酒以己酸乙酯作為主體香，該酯具有濃郁的曲香和菠蘿香氣，是白酒四大酯類(lèi)物質(zhì)之一[18-20]。根據(jù)GB/T 10781.1對(duì)濃香型白酒的規(guī)定，優(yōu)級(jí)濃香型白酒的己酸乙酯含量在1.2～2.8 g/L之間，總酯含量不低于2.5 g/L。綜合目前報(bào)道的關(guān)于產(chǎn)酯酵母的結(jié)果來(lái)看，大多數(shù)產(chǎn)酯酵母通常高產(chǎn)乙酸乙酯，高產(chǎn)己酸乙酯的酵母較少，并且產(chǎn)量較低，該酵母主要產(chǎn)己酸乙酯的這一特性可用于改善濃香型白酒的品質(zhì)。根據(jù)表7可知，酯類(lèi)物質(zhì)占總揮發(fā)性物質(zhì)的88.610%，包括己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、十六酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯等，這些物質(zhì)都具有獨(dú)特香氣，在濃香型白酒中均有檢出[21-22]，對(duì)濃香型白酒品質(zhì)的提升具有一定的意義。

醇類(lèi)物質(zhì)在白酒中起助香作用。根據(jù)表7可知，發(fā)酵液中β-苯乙醇是相對(duì)含量最高的醇類(lèi)物質(zhì)，占總揮發(fā)性物質(zhì)的6.872%，其次是異戊醇，占總揮發(fā)性物質(zhì)的2.711%。β-苯乙醇是白酒重要的風(fēng)味成分，適量的添加不僅能賦予白酒一定的玫瑰香氣，而且可使其口感更加綿柔，異戊醇則可增加白酒的厚重感[23-24]。除此之外，WickerhamomycesanomalusY-1能產(chǎn)少量的1-丙醇、異丁醇等高級(jí)醇，這些醇類(lèi)在適宜范圍內(nèi)能夠增進(jìn)β-苯乙醇的特殊芳香，并可襯托酯香，使酒香更加飽滿(mǎn)。若酒中不含高級(jí)醇或含量過(guò)低，會(huì)使酒味淡薄，隨著白酒貯存時(shí)間的增加，這些醇類(lèi)將會(huì)作為其他風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)，被緩慢氧化縮合為酯類(lèi)[25]。

除酯類(lèi)和醇類(lèi)外，WickerhamomycesanomalusY-1還能產(chǎn)少量的酸類(lèi)和醛類(lèi)。白酒中的酸主要是乙酸、己酸、丁酸等，適量的酸與其他呈味物質(zhì)一起呈現(xiàn)出白酒特有的芬芳，酸還具有緩沖作用，可消除飲后上頭、口味不協(xié)調(diào)等現(xiàn)象[26-27]。酸含量不足會(huì)導(dǎo)致白酒固有風(fēng)味缺失，含量過(guò)高容易出現(xiàn)邪雜味，一般以0.1 g/100 mL為宜。白酒中的醛類(lèi)對(duì)呈香也有一定的作用[28]，比如苯甲醛具有水果香氣，壬醛具有玫瑰、柑橘的氣味，癸醛具有一定的甜香、蠟香氣味，并且醛類(lèi)物質(zhì)在白酒的貯存中可以改善酒的嗅香、陳味。由此可見(jiàn)，該酵母不僅具有較強(qiáng)的產(chǎn)酯能力，同時(shí)具有突出的產(chǎn)醇、產(chǎn)酸、產(chǎn)醛能力，在白酒釀造工業(yè)中具有重要的潛力和價(jià)值[29-30]。

3 結(jié)論

本研究對(duì)先前實(shí)驗(yàn)室分離得到的一株產(chǎn)酯酵母WickerhamomycesanomalusY-1進(jìn)行生長(zhǎng)特性研究，并對(duì)其產(chǎn)酯條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最適產(chǎn)酯條件為培養(yǎng)溫度25.2 ℃，培養(yǎng)時(shí)間12.2 h，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，接種量9.8%(V/V)。在此條件下，發(fā)酵液中酯類(lèi)相對(duì)含量為680.594 μg/L，己酸乙酯含量為380.360 μg/L，對(duì)所產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該酵母不僅有較強(qiáng)的產(chǎn)己酸乙酯能力，還能產(chǎn)辛酸乙酯、庚酸乙酯、β-苯乙醇、癸醛等多種改善白酒風(fēng)味的物質(zhì)，對(duì)于濃香型白酒的增酯提香具有重要意義。但目前發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)己酸乙酯的酵母相對(duì)較少，產(chǎn)量也較低，繼續(xù)挖掘高產(chǎn)己酸乙酯菌株并提高產(chǎn)量是改善濃香型白酒品質(zhì)的一項(xiàng)重要工作。