完馬單智，簡(jiǎn)瑩娜，王貴元，張學(xué)勇，扎西東主，王光華，才旦卓瑪，王戈平，林偉山，李秀萍，馬利青

(1.青海省海西州天峻縣木里鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,天峻 817299；2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,西寧 810016)

牦犢牛腹瀉為牦牛常見疾病，主要病原有致病性大腸桿菌、沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、球蟲、隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲、牛病毒性腹瀉病毒、輪狀病毒及冠狀病毒等[1]。目前，雖然臨床上治療牛腹瀉的藥物很多，但是多數(shù)情況下由于不能夠清楚地分離鑒定到致病原，僅簡(jiǎn)單采用抗生素類藥物治療，有時(shí)不能做到有效治療，甚至出現(xiàn)耐藥性菌株。

大腸桿菌為條件性致病菌，當(dāng)環(huán)境驟變引起家畜較強(qiáng)的應(yīng)激反應(yīng)、抵抗力免疫力降低時(shí)，非常容易誘發(fā)牛羊等家畜大腸桿菌病，但以犢牛、羔羊更為易感，發(fā)病急、病死率高，多呈地方性流行[2，3]。大腸桿菌的耐藥機(jī)理復(fù)雜，主要有產(chǎn)生質(zhì)粒型廣譜和超廣譜的β 內(nèi)酰胺酶水解β內(nèi)酰胺類抗生素，產(chǎn)生耐藥甚至多重耐藥[4]。最新研究報(bào)道稱耐藥基因可以通過質(zhì)粒垂直傳給下一代，并且水平傳播至人和其他動(dòng)物[5-7]。為了避免出現(xiàn)耐藥菌株，希望有關(guān)獸醫(yī)相關(guān)部門對(duì)動(dòng)物疾病嚴(yán)格診斷、進(jìn)行耐藥性分析，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥。

本研究通過對(duì)木里鎮(zhèn)死亡牦犢牛組織樣品進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)和PCR分子鑒定，確診引起牦牛腹瀉乃至死亡的致病原，對(duì)致病原進(jìn)行致病性及耐藥性研究，以期為該地區(qū)有效防治牦牛腹瀉提供科學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1病料采集

在青海省天峻縣木里鎮(zhèn)某牦牛牧場(chǎng)，按照采樣要求，對(duì)因腹瀉致死的牦犢牛進(jìn)行組織樣品(心、肝、脾、肺、腎及腸道內(nèi)容物)采集，各1份，將樣品保存于冰盒及時(shí)送檢至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。

1.2主要試劑儀器

本次試驗(yàn)所用實(shí)驗(yàn)試劑如下: 2×Easy Taq PCR SuperMix、Trans 2K DNA Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；PCR引物合成及測(cè)序均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成；鮮血營(yíng)養(yǎng)瓊脂為本實(shí)驗(yàn)室配置；其他均為國(guó)產(chǎn)常規(guī)試劑。本次試驗(yàn)所用的主要儀器包括恒溫培養(yǎng)箱、PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、離心機(jī)、微量移液器、干式孵育器等。

1.3試驗(yàn)動(dòng)物

昆明系小鼠6 只，雌雄各半，6～8 周齡，體重16～20 g，購(gòu)自蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4細(xì)菌分離培養(yǎng)

將各組織進(jìn)行無(wú)菌分離培養(yǎng)至鮮血營(yíng)養(yǎng)瓊脂、厭氣肉肝湯以及營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱24 h后進(jìn)行觀察，有無(wú)溶血，細(xì)菌形態(tài)。

1.5致病性實(shí)驗(yàn)

將脾臟中1株溶血菌株進(jìn)行純化，取0.2 mL18 h培養(yǎng)物，經(jīng)腹腔注射給實(shí)驗(yàn)小白鼠，于24 h內(nèi)死亡。

1.6PCR鑒定

提取分離菌株的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。按照參考文獻(xiàn)[8]中細(xì)菌16S rRNA 引物序列合成引物，序列信息為16S-F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCT CAG-3'，16S-R: 5'- TCAGGTTACCTTGTTACGACT-3'。25 μL 反應(yīng)體系: 2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，純化水7.5 μL，DNA 模板3 μL。反應(yīng)程序: 95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性35 s，60℃退火35 s，72℃延伸2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，利用凝膠成像儀觀察拍照，并PCR產(chǎn)物純化，送往蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7藥敏試驗(yàn)

參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)(CLSIM100)，采用K-B 紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[9]，將菌懸液均勻涂布于MH培養(yǎng)基上，用無(wú)菌鑷子放置抗生素藥敏片，37℃孵育24 h，測(cè)定抑菌圈直徑，根據(jù)有無(wú)抑菌圈及抑菌圈直徑大小判斷分離菌對(duì)各種藥物的敏感程度。

2 結(jié)果

2.1細(xì)菌分離結(jié)果

從病死牦犢牛脾臟中分離到1株具有β溶血，灰色，中等大小，圓形隆起的菌落。

2.2PCR鑒定

以分離株基因組DNA為模板，以16S rRNA基因片段的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了預(yù)期的基因片段，其大小約1500 bp，見圖1。通過測(cè)序獲得序列信息，利用在線BLAST 軟件工具對(duì)序列進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果表明分離菌株與大腸桿菌(Genebank登錄號(hào)為MZ209199.1)序列同源性為99%，鑒定該菌為大腸桿菌。

圖1 細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增結(jié)果圖

2.3致病性實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)組小鼠均于24h內(nèi)死亡，對(duì)照組小鼠無(wú)異常。將試驗(yàn)組小鼠剖檢，小鼠腸鼓氣，將小鼠肝臟進(jìn)行分離培養(yǎng)，小鼠肝臟分離菌落形態(tài)與上述牦牛脾臟分離菌株形態(tài)一致，具有β溶血，灰色，中等大小，圓形隆起的菌落，經(jīng)革蘭氏染色后形態(tài)與牦牛脾臟分離菌株一致，為革蘭氏陰性短桿菌，說明該菌株具有致病性。

2.4藥敏試驗(yàn)

分離菌株對(duì)慶大霉素、諾氟沙星、左氧氟沙星及氧氟沙星藥物敏感；對(duì)多黏菌素E 和阿米卡星等藥物中敏；對(duì)多黏菌素B、氯霉素等藥物耐藥。

表1 分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

對(duì)送檢牦犢牛病料進(jìn)行細(xì)菌分離，于脾臟中分離到1 株致病菌，經(jīng)過動(dòng)物致死試驗(yàn)、PCR分子生物學(xué)鑒定結(jié)果判定該分離菌株為致病性大腸桿菌。表明本次引起該牧場(chǎng)牦犢牛死亡的主要病原菌為大腸桿菌。根據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，建議使用慶大霉素、諾氟沙星等敏感藥物對(duì)其他患病牦犢牛進(jìn)行治療，從而達(dá)到較好的效果，控制該疾病的擴(kuò)散、蔓延。

抗生素的不合理使用日趨嚴(yán)重，成為一個(gè)全球性問題，其耐藥范圍、種類并且多重耐藥性呈上升趨勢(shì)[10]。為保證畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康，建議不要盲目使用抗生素。本試驗(yàn)分離到的大腸桿菌對(duì)多黏菌素E、氯霉素、紅霉素、強(qiáng)力霉素及四環(huán)素等藥物耐藥，提示以上藥物不適合使用。此外，在養(yǎng)殖過程中還應(yīng)加強(qiáng)環(huán)境消毒，降低動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，加強(qiáng)家畜的飼養(yǎng)管理，提高家畜自身的免疫力，及時(shí)隔離病畜預(yù)防疾病的大規(guī)模擴(kuò)散，結(jié)合本地區(qū)情況制訂合理的治療程序，在選擇藥物之前先做藥敏試驗(yàn)，篩選敏感藥物進(jìn)行治療，這樣既能達(dá)到較好的治療效果，又能降低成本，還能減少耐藥菌株的產(chǎn)生。