荊文光，趙小亮，張權(quán)，程顯隆，馬雙成*，魏鋒*

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050；

2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700

藥性是中藥的基本屬性，中藥藥性理論作為中醫(yī)藥理論的核心內(nèi)容，是中藥發(fā)揮藥效作用的高度概括。利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)挖掘中藥“四氣五味”的物質(zhì)基礎(chǔ)，是闡述中藥整體藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要環(huán)節(jié)?！饵S帝內(nèi)經(jīng)·素問》記載：“五氣入鼻、五味入口”[1]，說明中藥四氣五味的發(fā)現(xiàn)最先依賴于人的鼻舌，然而歷代醫(yī)家對(duì)于同一種藥物味的記述并不完全相同，且對(duì)藥味敏感度也不同，故有“極”“大”“甚”或“微”的描述[2]。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，許多仿生模型被應(yīng)用到食品和藥物的氣味鑒別及質(zhì)量評(píng)價(jià)中，其中應(yīng)用較多的有電子鼻和電子舌技術(shù)。與人工評(píng)價(jià)相比，電子舌具有客觀性，重復(fù)性，無需進(jìn)行樣品前處理，不疲勞，檢測(cè)速度快，數(shù)據(jù)電子化、易存儲(chǔ)、易描述的優(yōu)點(diǎn)。電子鼻、電子舌等現(xiàn)代仿生技術(shù)結(jié)合化學(xué)分離分析的方法為中藥藥性物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供了客觀化、定量化的手段[3-6]。杜瑞超等[7]選取了5種苦味藥、6種甜味藥、6種酸味藥、6 種咸味藥，采用不同煎煮方法進(jìn)行處理，利用電子舌檢測(cè)，并采用主成分分析和判別因子分析分別對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果表明，相同味道的中藥能夠很好地聚類，建立的滋味區(qū)域能夠很好地辨別中藥的酸、苦、甜、咸。馬文鳳等[8]以延胡索為例探討仿生技術(shù)在中藥五味辨識(shí)研究中的應(yīng)用，利用季銨堿型生物堿小檗堿及叔胺堿型生物堿延胡索乙素與構(gòu)建的苦味受體hTAS2R10 結(jié)合，其對(duì)接分值較高，故認(rèn)為延胡索藥材中的苦味物質(zhì)基礎(chǔ)為叔胺堿型及季銨堿型化合物。梁曉光等[9]研究了苦味藥黃連的物質(zhì)基礎(chǔ)，采用電子舌技術(shù)對(duì)色譜分離得到的6 個(gè)化合物進(jìn)行苦度評(píng)價(jià)，并結(jié)合大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)除非洲防己堿外，苦度越大的成分抑菌效果越好，并進(jìn)一步證實(shí)苦味化合物應(yīng)為苦味藥的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。曾燕等[10]采用電子舌技術(shù)考察不同來源黃芩藥材味覺信息和主要化學(xué)成分之間的相關(guān)性，黃芩的苦味、澀味、苦回味、澀回味、酸味與黃芩苷含量呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)，說明黃芩苷為黃芩苦味的物質(zhì)基礎(chǔ)。

厚樸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.或凹葉厚樸M.offcinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮[11]。其性溫，味苦、辛，具有燥濕消痰、下氣除滿之功，用于治療濕滯傷中、脘痞吐瀉、食積氣滯、腹脹便秘、痰飲喘咳等[12]?；瘜W(xué)成分研究表明，厚樸主要含有厚樸酚類、生物堿和苯乙醇苷類成分[13]。本實(shí)驗(yàn)在前期建立厚樸中8個(gè)指標(biāo)性成分含量測(cè)定方法工作的基礎(chǔ)上[14]，采用電子舌對(duì)厚樸苦味藥性進(jìn)行定量化表征，并與其8 個(gè)成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析，闡述其苦味藥性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試藥

厚樸（編號(hào)：HP01～HP10）采自湖北恩施市華中藥用植物園，凹葉厚樸（編號(hào)：AY01～AY10）采自湖南永州道縣厚樸基地，所有樣品樹齡均約為20 年，均采自胸徑部位，經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院魏鋒研究員鑒定為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.和凹葉厚樸M.offcinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥干皮。

對(duì)照品紫丁香酚苷（批號(hào)：Y28M9H57297）、和厚樸酚（批號(hào)：T28O6B5149）、木蘭苷A（批號(hào)：X16S8L44141）、木蘭箭毒堿（批號(hào)：M29J8S40878）、厚樸酚（批號(hào)：KS0912CB14）、木蘭花堿（批號(hào)：R21M9F61834）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；對(duì)照品木蘭苷B、辣薄荷基厚樸酚為實(shí)驗(yàn)室自制；所有對(duì)照品經(jīng)超高效液相色譜法（UPLC）峰面積歸一化測(cè)定，純度均大于98.0%；乙腈、甲醇（色譜純，Thermo Fisher公司）；純凈水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；氯化鉀、氫氧化鉀、酒石酸等其他試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

Waters ACQUITY H-Class 型超高效液相色譜，光電二極管陣列檢測(cè)器（PDA），Empower 3 工作站；AE 240 型十萬分之一電子天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TS-5000Z 型電子舌[日本Insent 公司，配備5 種基本味（酸、甜、苦、咸、鮮）和澀味的評(píng)價(jià)系統(tǒng)]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為WatersACQUITYUPLC BEH-Cl8（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，9%～11%B；2～5 min，11%～12%B；5～8 min，12%～15%B；8～10 min，15%～39%B；10～13 min，39%～60%B；13～18 min，60%～65%B；18～24 min，65%～96%B；24～25 min，96%～100%B）；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：1.0 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：木蘭箭毒堿為282 nm，紫丁香酚和木蘭花堿為260 nm，木蘭苷A和木蘭苷B為310 nm，和厚樸酚、厚樸酚和辣薄荷基厚樸酚為290 nm，色譜圖見圖1。

圖1 厚樸樣品和混合對(duì)照品色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別取對(duì)照品紫丁香酚苷、木蘭花堿、木蘭箭毒堿、木蘭苷A、木蘭苷B、和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚適量，精密稱定，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為30.72、29.24、37.40、88.32、61.92、49.16、45.60、29.16 mg·L-1的混合對(duì)照品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取厚樸藥材粉末（過三號(hào)篩）0.3 g，精密稱定，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，冷浸24 h，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液各1.0 μL 注入超高效液相色譜儀，按2.1 項(xiàng)下色譜條件采用不同波長(zhǎng)測(cè)定，以紫丁香酚苷等8 個(gè)成分峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，8 個(gè)成分回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）、線性范圍、定量下限（LLOQ）和檢測(cè)下限（LLOD）見表1。結(jié)果表明，在定量范圍內(nèi)各化合物的線性關(guān)系良好。

表1 厚樸中8個(gè)成分回歸方程、r及線性范圍、LLOQ和LLOD

2.4.2 精密度試驗(yàn) 將混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算紫丁香酚苷等8個(gè)成分峰面積的RSD。結(jié)果顯示，紫丁香酚苷、木蘭花堿、木蘭箭毒堿、木蘭苷A、木蘭苷B、和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚峰面積的RSD 均小于2.0%，表明儀器精密度較好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（HP05）分別于0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，計(jì)算紫丁香酚苷等8 個(gè)成分峰面積的RSD。結(jié)果顯示，紫丁香酚苷、木蘭花堿、木蘭箭毒堿、木蘭苷A、木蘭苷B、和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚峰面積的RSD 均小于2.5%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批厚樸藥材樣品（HP05），按2.3項(xiàng)下方法操作，平行制備6份供試品溶液，在2.1 項(xiàng)下色譜條件下測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算各化合物的含量，并計(jì)算測(cè)定結(jié)果的RSD。結(jié)果顯示，紫丁香酚苷、木蘭花堿、木蘭箭毒堿、木蘭苷A、木蘭苷B、和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚含量的RSD均小于2.0%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含量的厚樸（HP05）樣品粉末0.1 g，平行制備6 份，按照100%分別加入8 個(gè)對(duì)照品，按2.3 項(xiàng)下方法制備樣品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算8 個(gè)成分的含量和加樣回收率。結(jié)果顯示，紫丁香酚苷、木蘭花堿、木蘭箭毒堿、木蘭苷A、木蘭苷B、和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚平均回收率分別為100.1%、94.1%、98.5%、97.8%、96.1%、98.7%、99.0%、100.2%，RSD分別為3.02%、2.62%、3.30%、2.53%、2.36%、2.66%、2.42%、1.67%。

2.4.6 含量測(cè)定 按照2.3項(xiàng)下方法制備20批厚樸藥材樣品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，分別測(cè)定紫丁香酚苷、木蘭花堿、木蘭箭毒堿、木蘭苷A、木蘭苷B、和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚的含量（表2）。

表2 厚樸藥材中8個(gè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（n=3）

2.5 厚樸藥材的電子舌味覺分析

精密稱取厚樸樣品1 g，精密加入去離子水（95～100 ℃）100 mL，超聲30 min（300 W，40 Hz），放冷，12 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為8 cm），取上清液70 mL 進(jìn)行測(cè)定，每份樣品平行測(cè)定4 次，取后3 次平均值，結(jié)果見表3。測(cè)試用液：參比溶液（人工唾液）為30 mmol·L-1KCl溶液和0.3 mmol·L-1酒石酸；負(fù)極清洗液為100 mmol·L-1HCl 和30%乙醇混合液；正極清洗液為100 mmol·L-1KCl、100 mmol·L-1KOH 和30%乙醇的混合液。其中，酸味（sourness）的無味點(diǎn)（tasteless）為-13.0，咸味（saltiness）的無味點(diǎn)為-6.00，其余味道的無味點(diǎn)均為0。

表3 厚樸藥材電子舌味覺測(cè)定（n=3）

2.6 厚樸藥材化學(xué)成分含量與電子舌味覺的相關(guān)性分析

為尋找厚樸苦味的藥性物質(zhì)基礎(chǔ)，將厚樸藥材中8 個(gè)成分與苦味、苦味回味傳感器測(cè)定值進(jìn)行皮爾遜（Pearson）相關(guān)性分析，結(jié)果厚樸酚、和厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚與苦味、苦味回味存在顯著的正相關(guān)（P＜0.05，P＜0.01），說明厚樸酚、和厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚為厚樸苦味的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)（表4）。木蘭箭毒堿與苦味、苦味回味存在顯著的負(fù)相關(guān)，此外木蘭花堿、木蘭苷A 未顯示與苦味有直接相關(guān)性，而與苦味回味存在負(fù)相關(guān)，可能這2個(gè)成分對(duì)苦味傳感器不敏感，這與梁曉光等[9]報(bào)道黃連中木蘭花堿苦度響應(yīng)值較低相符合。

表4 苦味和苦味回味值與厚樸中8個(gè)成分含量相關(guān)性分析

2.7 厚樸藥材電子舌測(cè)試液中化學(xué)成分分析

由于電子舌測(cè)定溶液為樣品沸水溶液，厚樸酚、和厚樸酚等成分的水溶性較差，在溶液中質(zhì)量濃度較低，為真實(shí)表征與味覺直接相關(guān)的化學(xué)成分，同時(shí)測(cè)定了20 個(gè)樣品電子舌測(cè)試液中8 個(gè)成分的質(zhì)量濃度。取2.5 項(xiàng)下剩余離心上清液，放置至室溫，直接經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，進(jìn)行UPLC 分析。由于辣薄荷基厚樸酚含量低于定量限，故只檢測(cè)剩余7個(gè)化學(xué)成分的質(zhì)量濃度，結(jié)果見表5。

表5 厚樸藥材電子舌測(cè)試液中7個(gè)成分質(zhì)量濃度

2.8 厚樸藥材電子舌測(cè)定液中化學(xué)成分與響應(yīng)值的相關(guān)性分析

從測(cè)試液的成分和苦味、澀味的相關(guān)性上看（表6），雖然厚樸酚、和厚樸酚的含量較低，但是仍然與苦味、苦味回味有顯著的正相關(guān)，其結(jié)果和藥材中2 種成分與苦味、苦味回味的相關(guān)性結(jié)果一致。由此可知，厚樸酚、和厚樸酚可作為厚樸苦味藥性物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.9 6個(gè)指標(biāo)性單體成分味覺測(cè)定

結(jié)合表4 和表6 結(jié)果，厚樸酚、和厚樸酚與苦味、苦味回味均具有顯著正相關(guān)。木蘭苷A、木蘭花堿和木蘭箭毒堿與苦味回味存在顯著負(fù)相關(guān)。木蘭苷B 未表現(xiàn)出明顯的苦味。由于厚樸飲片臨床多用湯劑，且湯劑中并未檢測(cè)辣薄荷基厚樸酚，因此，為驗(yàn)證厚樸苦味藥性物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)厚樸酚、和厚樸酚、木蘭苷A、木蘭苷B、木蘭花堿和木蘭箭毒堿6個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行味覺測(cè)定。分別精密稱取一定量的6個(gè)化合物，用10%乙醇配制成3×10-4mol·L-1的溶液100 mL，取溶液80 mL 采用電子舌進(jìn)行味覺分析。結(jié)果表明，6 個(gè)化合物基本不存在酸味和咸味，與藥材測(cè)定結(jié)果相同（表7）。其中，厚樸酚、和厚樸酚苦味和苦味回味響應(yīng)值均為最高，結(jié)合藥材及測(cè)試液中厚樸酚、和厚樸酚的質(zhì)量濃度分布情況，可認(rèn)為厚樸酚、和厚樸酚為厚樸苦味的藥性物質(zhì)基礎(chǔ)。

表6 苦味和苦味回味值與厚樸藥材電子舌測(cè)試液中7個(gè)成分質(zhì)量濃度相關(guān)性分析

表7 厚樸中6個(gè)指標(biāo)性單體成分電子舌味覺測(cè)定

3 討論

中藥藥性理論是中醫(yī)藥基本理論研究的分支，而藥性物質(zhì)基礎(chǔ)研究是藥性理論研究的重點(diǎn)。采用多層次、多手段、多方法、多成分的整體研究方法能夠?yàn)橹兴幩幮晕镔|(zhì)基礎(chǔ)及中藥質(zhì)量控制研究尋找到可靠的指標(biāo)性成分。藥性功效的發(fā)揮依托藥材，而自然環(huán)境的變化影響藥材內(nèi)部化學(xué)成分的變化，因此藥性物質(zhì)基礎(chǔ)研究關(guān)鍵在于化學(xué)成分分析[15]。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的化學(xué)成分包含苯乙醇苷類化合物木蘭苷A、木蘭苷B，酚苷類化合物紫丁香酚苷，水溶性生物堿類化合物木蘭花堿、木蘭箭毒堿及木脂素類化合物厚樸酚、和厚樸酚，基本能夠涵蓋厚樸中主要化學(xué)成分類型。結(jié)果顯示，厚樸酚類成分是厚樸苦味的藥性物質(zhì)基礎(chǔ)，這與《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版中以厚樸酚與和厚樸酚作為質(zhì)量分析成分相一致。此外，厚樸酚可提高小鼠胃排空率及小腸推進(jìn)率[16]，這與其苦味能泄、能燥的作用相符合。

厚樸基原有厚樸和凹葉厚樸2 種，有研究結(jié)果表明，厚樸酚、和厚樸酚、厚樸酚類總量、厚樸酚與和厚樸酚比例等品質(zhì)性狀在種源間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[17]。從道地產(chǎn)區(qū)和藥材品質(zhì)上看，厚樸基原優(yōu)于凹葉厚樸，本實(shí)驗(yàn)為保證樣本的多樣性，樣品收集過程兼顧了以上2 種厚樸基原，同時(shí)保證采集年限和采集部位基本保持一致，結(jié)果比較苦味和苦味回味均值發(fā)現(xiàn)，厚樸響應(yīng)值高于凹葉厚樸，這與厚樸中厚樸酚與和厚樸酚含量均值高于凹葉厚樸相一致，也從側(cè)面說明厚樸在苦味藥性上優(yōu)于凹葉厚樸，質(zhì)量較優(yōu)。

厚樸含有揮發(fā)油類成分，其揮發(fā)油主要成分為β-桉葉醇，約占總揮發(fā)油的30%～40%，本課題組在前期工作中也測(cè)定了β-桉葉醇在厚樸藥材和飲片中的含量[18]，本實(shí)驗(yàn)中將藥材中β-桉葉醇含量與其電子舌的響應(yīng)值進(jìn)行相關(guān)性分析，未發(fā)現(xiàn)其與所測(cè)的任何一種味覺有相關(guān)關(guān)系，故未納入統(tǒng)計(jì)分析，其作為揮發(fā)性成分可能為厚樸辛味的物質(zhì)基礎(chǔ)。而在單體化合物的苦味測(cè)試中，2 種水溶性生物堿雖表現(xiàn)出一定的苦味，但是未表現(xiàn)明顯的苦味回味，反而澀味響應(yīng)最好，說明厚樸刺激性來源可能為生物堿類成分。研究表明，厚樸姜炙后，厚樸酚類成分含量變化不明顯，生物堿類成分含量明顯下降，說明炮制主要影響其澀味，對(duì)苦味藥性影響不明顯[18]，但尚需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)成分分析結(jié)合電子舌技術(shù)，初步揭示了厚樸苦味的藥性物質(zhì)基礎(chǔ)，如能結(jié)合藥效學(xué)研究進(jìn)行驗(yàn)證，可為更多中藥藥性物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供參考，能夠更深層地揭示中藥藥性理論的科學(xué)內(nèi)涵，為中藥臨床使用和科學(xué)研究提供理論依據(jù)。