張方博，唐璇，唐仕歡*，楊洪軍

1.中國中醫(yī)科學院 中藥研究所，北京 100700；

2.中國中醫(yī)科學院 醫(yī)學實驗中心，北京 100700

“一帶一路”倡議旨在形成“陸海內(nèi)外聯(lián)動、東西雙向互濟”的開放格局，構(gòu)建國內(nèi)國際雙循環(huán)相互促進的新發(fā)展格局，打造健康絲綢之路，推進全球公共衛(wèi)生平臺建設(shè)[1]。自古以來，東南亞各國就是“海上絲綢之路”的重要組成部分，傳統(tǒng)醫(yī)藥在“海上絲綢之路”沿線國家和地區(qū)應用歷史悠久，并各具本地特色。隨著醫(yī)藥貿(mào)易和服務行業(yè)的不斷發(fā)展，傳統(tǒng)醫(yī)藥成為眾多東南亞國家新的經(jīng)濟增長點。

“一帶一路”倡議給沿線各國傳統(tǒng)醫(yī)藥研究帶來全新的機遇，促進了我國與沿線國家在傳統(tǒng)醫(yī)藥研究領(lǐng)域中的交流與合作，共同提升傳統(tǒng)醫(yī)藥研究的科技創(chuàng)新能力和行業(yè)技術(shù)水平，推進中醫(yī)藥的國際傳播、交流和應用。在“一帶一路”倡議的背景下，應加強中醫(yī)藥與各國傳統(tǒng)醫(yī)藥相關(guān)的科研合作，同時結(jié)合各國本地的特色和優(yōu)勢中醫(yī)藥，在中醫(yī)藥的國際化發(fā)展方面達到合作共贏[2]。

感染性疾病嚴重危害人類的健康和生命，抗生素在防治感染性疾病中發(fā)揮重大的作用，但細菌耐藥性的產(chǎn)生、病毒的快速變異和抗生素的濫用使抗感染藥物的研究面臨巨大的挑戰(zhàn)。在感染性疾病中，病毒感染是全球傳染病致死的主要病因。自20 世紀70 年代以來，新發(fā)傳染病不斷涌現(xiàn)，種類繁多，其中大部分是病毒性疾病，從埃博拉病毒感染、艾滋病、拉沙熱，到人禽流感、重癥急性呼吸綜合征（SARS）和新型冠狀病毒肺炎，傳播速度快、影響范圍廣、發(fā)病率和病死率高，嚴重威脅了公共衛(wèi)生安全，影響了世界經(jīng)濟的發(fā)展?，F(xiàn)有的抗病毒藥物存在易產(chǎn)生耐藥性、不良反應大等問題，因此亟須研制出療效確切、針對性強、不良反應小的新型抗病毒藥物。

中藥治療病毒性疾病已有數(shù)千年歷史，在治療感染性疾病方面具有獨特效果，近年來國際上也掀起研究抗病毒中藥的熱潮，從而挖掘出更多有效的抗病毒藥物[3]?！耙粠б宦贰眹胰嗣裨谂R床實踐中積累的豐富的傳統(tǒng)藥物知識是新藥研發(fā)的重要信息來源。本研究構(gòu)建了抗感染傳統(tǒng)藥物信息數(shù)據(jù)庫，并選取代表性藥物，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法解析其作用機制，以形成“一帶一路”國家抗感染傳統(tǒng)藥物篩選的研究范例，為外來藥物的研發(fā)提供借鑒。

1 方法

1.1 “一帶一路”國家抗感染傳統(tǒng)藥物信息數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

1.1.1 數(shù)據(jù)收集和整理 基于“一帶一路”國家的范圍，以《世界藥用植物速查辭典》為基礎(chǔ)[4]，搜集相關(guān)的藥用植物文獻資料，整理其基本信息，并確定藥物入選原則。所選取的藥物必須滿足以下2 點：1）藥用植物分布范圍在“一帶一路”國家，包括印度、泰國、緬甸、印度尼西亞、馬來西亞、老撾、柬埔寨、越南、菲律賓等；2）藥物的主治病癥中至少包括感染性相關(guān)疾病或相關(guān)癥狀，如發(fā)熱、感冒、肺炎、咳嗽、腹瀉等，或藥理作用如抗炎、抗菌、抗病毒等。通過以上原則篩選藥物并整理其基本信息，藥物名稱、拼音、別名、拉丁名、產(chǎn)地、藥用部位、功效、臨床應用、毒性和藥理作用等。

1.1.2 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建 基于篩選得到的藥物基本信息逐條錄入系統(tǒng)，構(gòu)建“一帶一路”國家抗感染傳統(tǒng)藥物信息數(shù)據(jù)庫。

1.2 “一帶一路”國家抗感染傳統(tǒng)藥物機制研究

1.2.1 化學成分整理 檢索中國知網(wǎng)、萬方、PubMed等數(shù)據(jù)庫文獻，對1.1.1 項下篩選得到的藥物中有明確藥理作用的藥物進行化學成分的收集。

1.2.2 藥物選擇 根據(jù)化學成分收集的情況，結(jié)合其功效及其藥理研究，選取代表性的藥物，選取條件為收集的化學成分數(shù)＞30 個，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法進行作用機制的預測。

1.2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學研究 根據(jù)篩選條件，以蘭桑山檨子、牛蒡鳳毛菊及錫蘭鴨嘴花為例進行網(wǎng)絡(luò)藥理學研究。

1.2.3.1 靶點收集與篩選 將搜集到的3 味藥材中含有的化合物輸入SwissTargetPrediction網(wǎng)站（http://www.swisstargetprediction.ch/）進行藥物靶點篩選，根據(jù)篩選條件為Probability＞0，得到藥物靶點。以關(guān)鍵詞“influenza”在DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/）中檢索流感相關(guān)靶點，以基因的疾病特異性指數(shù)（DSI，disease specificity index for the gene）＞0.5為篩選標準。

1.2.3.2 核心靶點篩選與富集分析 將藥物靶點與流感病毒靶點分別取并集后導入STRING 11.0 數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，最低要求的互動分數(shù)（minimum required interaction score）為0.7，計算網(wǎng)絡(luò)中度（degree）、中心性（betweenness centrality）、緊密度（closeness centrality）值，依次根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中度值≥2 倍中位數(shù)，中心性值和緊密度值也分別不低于各自中位數(shù)，最終篩選得到核心靶點。將篩選得到的核心靶點導入Metascape數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org/gp/#/main/step1）進行基因本體（gene ontology，GO）功能的生物學過程（biological process，BP）富集分析。將篩選得到的核心靶點導入Metascape數(shù)據(jù)庫進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析。

1.2.3.3 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 篩選得到的核心靶點由藥物核心靶點和疾病核心靶點組成，根據(jù)收集得到的化合物與靶點屬性文件中的對應關(guān)系，靶點與富集通路形成屬性文件，運用Cytoscape 3.7.1 軟件繪制網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 “一帶一路”國家抗感染傳統(tǒng)藥物信息數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

通過1.1.1項下原則共篩選得到384個藥物，對藥物的基本信息進行梳理，選取其中50 個藥物的主要信息作為研究示例，見表1?；谝陨纤幬锘拘畔?，構(gòu)建了“一帶一路”國家抗感染傳統(tǒng)藥物信息數(shù)據(jù)庫，除了藥物的查詢功能外，還添加了分析功能，可以分別統(tǒng)計分析發(fā)熱、咳嗽、腹瀉等癥狀的傳統(tǒng)藥物，為篩選抗感染傳統(tǒng)藥物提供參考（圖1）。

圖1 “一帶一路”國家抗感染傳統(tǒng)藥物信息數(shù)據(jù)庫界面

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 “一帶一路”國家抗感染傳統(tǒng)藥物機制研究

2.2.1 化學成分的整理及代表性藥物選擇 對已收集的384 個藥物，檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫和文獻報道，對有明確藥理作用的65 個藥物進行化學成分的收集，其中24 個藥物的化學成分數(shù)量超過30 個（表2）。有文獻報道蘭桑山檨子、牛蒡鳳毛菊及錫蘭鴨嘴花在防治流感方面均具有潛在的藥理活性[5-7]，因此，以此3 種藥物為例，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法開展抗流感的作用機制研究。

表2 化學成分數(shù)超過30個的“一帶一路”國家抗感染傳統(tǒng)藥物

2.2.2 藥物靶點-疾病靶點網(wǎng)絡(luò) 為闡明蘭桑山檨子、牛蒡鳳毛菊及錫蘭鴨嘴花的作用機制，首先分別構(gòu)建3 味藥材的藥物靶點-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)，利用網(wǎng)絡(luò)拓撲特征，篩選得到3 味藥材藥物靶點-疾病靶點的核心靶點網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中包含的靶點數(shù)量見表3。

表3 “一帶一路”國家抗感染傳統(tǒng)藥物中3種代表性藥物的藥物-流感核心靶點網(wǎng)絡(luò)的靶點數(shù)量與共有靶點名稱

蘭桑山檨子與流感病毒的共有靶點為CXC 趨化因子受體1（CXCR1）、血小板激活因子受體（PTAFR）、鞘氨醇1 磷酸酯受體1（S1PR1），分別與免疫反應、炎癥和平滑肌收縮、細胞黏附及血管生成等生物學過程有關(guān)。錫蘭鴨嘴花與流感病毒的重疊靶點與蘭桑山檨子相同。牛蒡鳳毛菊與流感病毒的重疊靶點共有2 個，分別為PTAFR 和信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子2（STAT2），抗流感機制主要與炎癥通路有關(guān)。

2.2.3 核心靶點GO-BP分析 分析結(jié)果顯示，蘭桑山檨子、牛蒡鳳毛菊及錫蘭鴨嘴花治療流感的作用機制均不相同。蘭桑山檨子主要與炎癥和免疫相關(guān)（圖2A），如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯(lián)反應的正調(diào)控（GO：0043410）及白細胞遷移（GO：0051223）等。牛蒡鳳毛菊（圖2B）主要與抗病毒通路相關(guān)，如對病毒的反應（GO：0009615）及γ-干擾素介導的信號通路（GO：1901699）等。錫蘭鴨嘴花（圖2C）主要與抗病毒及抗氧化活性相關(guān)，如Ⅰ型干擾素信號通路（GO：0060337）及活性氧代謝過程的正調(diào)控（GO：2000379）。

圖2 “一帶一路”國家抗感染傳統(tǒng)藥物中3種代表性藥物的藥物-流感核心靶點GO-BP富集分析

2.2.4 核心靶點KEGG 通路富集分析 根據(jù)P值由大到小排名前20 位的生物學過程分析，結(jié)果顯示，蘭桑山檨子與甲型流感的關(guān)系更為明顯（圖3A），如甲型流感A（ko05164：influenza A）。牛蒡鳳毛菊（圖3B）主要與病毒感染相關(guān)，如對病毒性心肌炎（has05416：viral myocardial）等。錫蘭鴨嘴花（圖3C）抗病毒活性主要與丙型肝炎（hsa05160：hepatitis C）、EB病毒感染（ko05169：Epstein-Barr virus infection）相關(guān)。KEGG 富集分析結(jié)果表明，蘭桑山檨子治療流感主要與炎癥和免疫通路相關(guān)，牛蒡鳳毛菊主要與抗病毒通路相關(guān)，錫蘭鴨嘴花主要與抗病毒及抗氧化活性相關(guān)，與GO-BP的分析結(jié)果較為一致。

圖3 “一帶一路”國家抗感染傳統(tǒng)藥物中3種代表性藥物的藥物-流感核心靶點KEGG富集分析

2.2.5 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò) 為了篩選治療流感的活性化合物，構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。3 味代表藥材的潛在活性物質(zhì)與作用的潛在靶點見圖4。蘭桑山檨子與炎癥及免疫相關(guān)的活性化合物共有21 個（圖4A 和表4），其潛在活性主要與MAPK 的正調(diào)控、白細胞遷移、防御的積極調(diào)節(jié)等環(huán)節(jié)有關(guān)。且其含有的化學成分，如強心酸、山柰酚、槲皮素、肉豆蔻酸也與上述生物學過程的調(diào)控相關(guān)，這4 個化合物在抗流感的相關(guān)實驗中證明具有一定活性[8-10]。牛蒡鳳毛菊與抗病毒相關(guān)的活性化合物共有11 個（圖4B 和表5），關(guān)聯(lián)靶點數(shù)量最多的胡蘿卜素主要對干擾素的產(chǎn)生及信號轉(zhuǎn)導具有潛在活性（γ-干擾素信號通路、Ⅰ型干擾素生成的調(diào)節(jié)、α-干擾素生成的正性調(diào)節(jié)）。錫蘭鴨嘴花與抗病毒及抗氧化相關(guān)的活性化合物共有24 個（圖4C 和表6），其中也包括山柰酚及槲皮素。此外，木犀草素對干擾素的信號轉(zhuǎn)導及白細胞也具有潛在活性，對病毒具有一定的抑制活性[11]。

表4 蘭桑山檨子的化學成分與流感關(guān)聯(lián)靶點

表5 牛蒡鳳毛菊的化學成分與流感關(guān)聯(lián)靶點

表6 錫蘭鴨嘴花的化學成分與流感關(guān)聯(lián)靶點

圖4 “一帶一路”國家抗感染傳統(tǒng)藥物中3種代表性藥物抗流感的成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

傳統(tǒng)醫(yī)藥是各國人民與自然和疾病作斗爭的寶貴經(jīng)驗總結(jié)，具有地域性、人文性、實踐性和傳承性等特點[12]。各國傳統(tǒng)醫(yī)藥存在不同程度的交流和影響，對傳統(tǒng)藥物的研究不僅可以促進優(yōu)秀的中醫(yī)藥產(chǎn)品和文化輸出，同時也可以吸收和融合外來的優(yōu)質(zhì)資源，對外來的傳統(tǒng)藥物加以開發(fā)利用。以臨床應用為導向，從“一帶一路”國家傳統(tǒng)藥物中篩選出具有開發(fā)前景的藥物，產(chǎn)生良好的社會價值和經(jīng)濟效益。感染性疾病仍是全球面臨的重大疾病，2019 年新型冠狀病毒肺炎的全球爆發(fā)向抗病毒藥物的研發(fā)提出了新的挑戰(zhàn)。如何快速篩選并利用“一帶一路”國家傳統(tǒng)藥物資源，值得探索和研究。

3.1 信息化促進研發(fā)

對“一帶一路”國家傳統(tǒng)藥物的開發(fā)研究，首先需要整理已有的藥物資料，用信息化的手段構(gòu)建相應的數(shù)據(jù)庫，便于查詢、檢索和分析。在資料整理的過程中，除了藥物的基本信息外，還應對具體藥物的傳承歷史、分布范圍、藥物基原、藥材標本等進行考察，結(jié)合當?shù)貍鹘y(tǒng)認識，重視應用經(jīng)驗的收集，將其進行信息化處理，構(gòu)建“一帶一路”國家傳統(tǒng)藥物數(shù)據(jù)庫，為后期的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學預測篩選

中藥抗感染性疾病的研究取得成效，但有效成分的研究較薄弱，物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，成為中醫(yī)藥現(xiàn)代化和國際化的主要障礙。因此，應當以臨床應用為導向，結(jié)合專業(yè)知識的判斷，對“一帶一路”國家傳統(tǒng)藥物進行有針對性的初步篩選，以獲得深度研發(fā)的藥物對象。網(wǎng)絡(luò)藥理學方法是利用計算機模擬和各種數(shù)據(jù)庫篩選藥物分子作用靶點，預測其發(fā)揮作用的信號通路，經(jīng)過拓撲參數(shù)分析篩選關(guān)鍵節(jié)點，篩選防治某類疾病的藥物或發(fā)現(xiàn)藥物的新作用，可為新藥研發(fā)節(jié)約成本[13]。在初步篩選的基礎(chǔ)上，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法對研發(fā)對象的作用機制進行預測分析，為實驗驗證提供了分子靶標，提高了實驗的準確性，為新藥研發(fā)提供了新的研究策略。

經(jīng)過文獻調(diào)研，“一帶一路”國家傳統(tǒng)藥材的研究較少，從文獻中獲取相關(guān)數(shù)據(jù)較為困難。本研究采用“溯源+模擬”整合的網(wǎng)絡(luò)預測手段對“一帶一路”國家傳統(tǒng)藥材進行活性挖掘。溯源指2 個方面：1）品種溯源。結(jié)合藥用資源分析方法，對“一帶一路”國家傳統(tǒng)藥物進行相近品種調(diào)研，通過相近品種的已知活性特點推測其可能的藥理作用；2）化合物溯源。具有相似化學結(jié)構(gòu)的化合物活性也可能相同，借助分析化學手段進行化合物分析，解析化合物結(jié)構(gòu)，與已知活性的化合物進行比對，預測“一帶一路”國家傳統(tǒng)藥物的藥理作用。溯源后結(jié)合分子對接等模擬方法，篩選預防某類疾病的藥物或發(fā)現(xiàn)藥物新的作用。

3.3 模型構(gòu)建與實驗驗證

動物模型是研究傳染病致病機制及開發(fā)疫苗和藥物的重要研究手段，對于加深對傳染病的科學認知、研制有效的防治措施等發(fā)揮重要作用[14]。確定合適的動物模型后，對候選藥物進行實驗驗證，是必不可少的階段。例如，流感病毒感染的動物模型構(gòu)建需選擇與傳播方式類似的感染方式。目前流感的傳播方式主要有3 種，分別為氣溶膠、飛沫和直接接觸。滴鼻和氣溶膠感染是流感病毒感染動物模型構(gòu)建較為合理的感染方式，研究表明氣溶膠感染建立的小鼠模型可用于疾病預防和發(fā)病機制的研究，滴鼻方式建立的小鼠模型用于不通過氣溶膠傳播的流感病毒研究[15]。本研究收集抗感染傳統(tǒng)藥物的相關(guān)信息，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學對代表性藥物進行抗流感作用機制的預測和篩選，以選擇合適的動物模型進行藥效評價和作用機制研究，為后續(xù)研發(fā)提供實驗依據(jù)。

3.4 藥用資源的評估

對于“一帶一路”國家抗感染傳統(tǒng)藥物的篩選和研發(fā)，還需考察藥用資源的整體情況是否滿足資源的可持續(xù)利用。對于中藥產(chǎn)品，國家有關(guān)部門提出該產(chǎn)品須固定其原料藥來源和產(chǎn)地，以加強對產(chǎn)品原料藥質(zhì)量的源頭控制。同時中藥注冊申請時，申請人應進行臨床價值和資源評估，突出以臨床價值為導向，促進資源可持續(xù)利用。因此對于外來的傳統(tǒng)藥物研發(fā)，還應參考和遵循《中藥資源評估技術(shù)指導原則》，即堅持資源保護與產(chǎn)業(yè)發(fā)展相結(jié)合原則，堅持藥材資源的供給與消耗平衡原則，堅持動態(tài)評估原則，通過資源評估促進原料藥產(chǎn)地的固定，結(jié)合藥材規(guī)范化生產(chǎn)、采收及加工，有效控制藥材質(zhì)量變異及有害污染物，從源頭確保藥材安全生產(chǎn)和應用[16]。

中醫(yī)藥作為“一帶一路”倡議的重要文化載體，不僅為中國文化提供了新傳播途徑，也為祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥提供發(fā)展創(chuàng)新的新背景和對外交流的新機遇[17]。大量理論研究和臨床實踐表明，傳統(tǒng)醫(yī)藥對病毒性疾病、代謝性疾病、心腦血管疾病等多種疾病的防治具有良好的療效[18]。傳統(tǒng)藥物具有提高療效、縮短療程、降低耐藥性、減輕不良反應等優(yōu)勢，對提高生存質(zhì)量、減少不良反應及減輕臟器損害等有協(xié)同作用。傳統(tǒng)醫(yī)藥中大量有待開發(fā)和研究的內(nèi)容是醫(yī)學理論研究和診療方案創(chuàng)新的資料庫。本研究收集和整理“一帶一路”沿線國家和地區(qū)的傳統(tǒng)藥物信息，歸納總結(jié)涉及傳統(tǒng)草藥的用藥情況，在此基礎(chǔ)上整合分析現(xiàn)有的各類基本信息，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學分析，建立“一帶一路”國家抗感染傳統(tǒng)藥物信息數(shù)據(jù)庫，為科研人員和臨床醫(yī)生提供傳統(tǒng)藥物信息，為開發(fā)和使用“一帶一路”國家和地區(qū)的傳統(tǒng)藥物提供依據(jù)。