苗靜波，王燕如，楊勇，張清明

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院/山東省植物病蟲(chóng)害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266109)

收稿日期：2021-08-31

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金(ZR2016CM11)；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2017GSF21112)

作者簡(jiǎn)介：苗靜波(1995—)，男，河北張家口人，在讀碩士，主要從事農(nóng)藥環(huán)境毒理與污染修復(fù)。E-mail：1365952338@qq.com

通信作者：張清明(1978—)，男，山東博興人，教授，博士，主要從事農(nóng)藥環(huán)境毒理與污染修復(fù)研究。E-mail：qmzhang@qau.edu.cn

咪唑乙煙酸是由美國(guó)氰胺公司開(kāi)發(fā)的咪唑啉酮類(lèi)除草劑中的一種，通過(guò)抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)或乙酸羥酸合成酶(AHAs)的活性，阻礙氨基酸合成使植物停止生長(zhǎng)而死亡[1]。咪唑乙煙酸主要用于防治一年生和多年生禾本科與闊葉雜草，因其在大豆體內(nèi)能快速分解，故被廣泛應(yīng)用于大豆田除草[2]，是咪唑啉酮類(lèi)除草劑在我國(guó)銷(xiāo)售的主要商品。但是咪唑乙煙酸在土壤中殘效期長(zhǎng)，長(zhǎng)期大面積使用不僅會(huì)對(duì)油菜、水稻、玉米等后茬敏感作物產(chǎn)生藥害，造成減產(chǎn)、甚至絕產(chǎn)的嚴(yán)重后果[3]，還會(huì)影響輪作的正常進(jìn)行，使大豆產(chǎn)量與質(zhì)量顯著下降[4]；土壤中殘留的咪唑乙煙酸還會(huì)通過(guò)淋溶或揮發(fā)作用對(duì)大氣和地下水造成污染[5-7]。除此之外，咪唑乙煙酸的大量使用，還有可能減少生物多樣性、降低土壤質(zhì)量、減少生物固氮等[8]。所以，如何快速、有效、環(huán)保的修復(fù)咪唑乙煙酸殘留污染成為亟待解決地問(wèn)題。

目前，對(duì)咪唑乙煙酸殘留污染的治理方法主要有生物降解和非生物降解[9]，但傳統(tǒng)治理方法往往存在治理周期長(zhǎng)、清除速度慢、易造成二次污染等問(wèn)題，不適宜在大豆田中大面積應(yīng)用。Jerry等[10]利用14C標(biāo)記法研究證明，土壤中的咪唑乙煙酸主要通過(guò)微生物降解，而且微生物降解除草劑對(duì)環(huán)境污染小，安全性較高，所以分離篩選出能高效降解咪唑乙煙酸的微生物是解決其污染問(wèn)題的有效途徑[11]。目前已經(jīng)有丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、海球菌屬(Marinococcus)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、無(wú)色桿菌屬(Photorhabdus)等細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)對(duì)咪唑乙煙酸有降解作用[12]。

為了進(jìn)一步豐富咪唑乙煙酸降解菌菌庫(kù)，優(yōu)化菌株降解條件，本研究利用高壓富集馴化的方法從山東農(nóng)田土壤中分離篩選出1株可降解咪唑乙煙酸的細(xì)菌(MZ-1)，并對(duì)其分類(lèi)地位和降解特性進(jìn)行了研究。同時(shí)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化其對(duì)咪唑乙煙酸的降解條件以提高降解效率，并且利用油菜種子作為生物材料，通過(guò)比較降解前后的含咪唑乙煙酸培養(yǎng)液對(duì)油菜種子的毒性差別，來(lái)驗(yàn)證菌株對(duì)咪唑乙煙酸的去毒效果，以期為咪唑乙煙酸殘留污染的生物修復(fù)提供材料和方法基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑及儀器

咪唑乙煙酸原藥(98%)，由山東先達(dá)農(nóng)化股份有限公司提供。甲醇和乙腈均為色譜級(jí)，試驗(yàn)中所需的其他試劑均為分析純。

超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Vanquish 超高效液相色譜儀和LTQ XL質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技公司，美國(guó))；恒溫振蕩器(THZ-98AB，上海-恒科)；CP214電子天平(奧豪斯儀器公司，上海)；SevenCompact型pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器公司，瑞士)；UV-2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津儀器公司，日本)。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：5 g蛋白胨，5 g酵母粉，1 g K2HPO4，1 g葡萄糖，1 000 mL蒸餾水。

選擇培養(yǎng)基：1 g NH4NO3，1 g NaCl，0.5 g KH2PO4，1.5 g K2HPO4，1 g (NH4)2SO4，0.1 g MgSO4·7H2O，0.1 g 蛋白胨，蒸餾水 1 000 mL。

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基：1 g NH4NO3，1 g NaCl，0.5 g KH2PO4，1.5 g K2HPO4，0.1 g MgSO4·7H2O，1 000 mL蒸餾水。

LB培養(yǎng)基：5 g酵母膏，10 g蛋白胨，10 g NaCl，1 000 mL蒸餾水。

所有培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)至7.0，固體培養(yǎng)基添加2.0%的瓊脂粉，并在高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌25 min。

1.2 降解菌的富集馴化、分離及純化

試驗(yàn)土壤采集于山東某長(zhǎng)期施用咪唑乙煙酸的農(nóng)田中，采用逐級(jí)加量馴化的方法進(jìn)行高效降解菌的馴化篩選[13]。取5 g土壤加入50 mL LB培養(yǎng)基中，30 ℃，160 r/min培養(yǎng)24 h，取上述培養(yǎng)液10 mL加入100 mL的選擇培養(yǎng)基中(咪唑乙煙酸初始濃度為100 mg/L)培養(yǎng)，5 d后轉(zhuǎn)接至咪唑乙煙酸濃度更高的選擇培養(yǎng)基中(濃度每次提高100 mg/L)，逐級(jí)提高培養(yǎng)基中咪唑乙煙酸的濃度，直至達(dá)到500 mg/L。吸取50 μL上述培養(yǎng)液涂布于咪唑乙煙酸濃度為500 mg/L的固體選擇培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)，待平板上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的菌落，挑取菌落進(jìn)一步分離純化，共分離得到4株形態(tài)差異的菌株。采用高效液相色譜法確定純化后的菌株對(duì)咪唑乙煙酸的降解能力，選取降解能力最強(qiáng)的降解菌(命名為MZ-1)進(jìn)行后續(xù)的研究，并且采用甘油管冷凍保存法于-20 ℃下保存。

1.3 降解菌MZ-1的鑒定

參照趙婷等[14]的方法，通過(guò)形態(tài)、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析對(duì)降解菌MZ-1進(jìn)行鑒定。16S rRNA擴(kuò)增序列引物為細(xì)菌通用引物：27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1541R (5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。將PCR產(chǎn)物送至上海生工公司進(jìn)行測(cè)序，用RNAman拼接，將拼接結(jié)果與Genbank上已公布的基因序列進(jìn)行比較，采用MEGA 7軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。所得序列上傳至Genbank獲得序列號(hào)為MW541635。

1.4 咪唑乙煙酸降解菌降解率測(cè)定

1.4.1 咪唑乙煙酸的提取

參照楊鑫[15]的方法進(jìn)行，取待測(cè)培養(yǎng)液5 mL于50 mL離心管中，按培養(yǎng)液與二氯甲烷體積比為1∶4的比例加入二氯甲烷。充分震蕩后，靜置5 min，用移液槍棄去上層水層，將有機(jī)相倒入50 mL圓底燒瓶，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40 ℃蒸發(fā)近干，用5 mL色譜純甲醇反復(fù)潤(rùn)洗，用1 mL一次性注射器吸取，過(guò)0.22 μm濾膜，加入自動(dòng)進(jìn)樣小瓶待測(cè)。

1.4.2 超高效液相色譜檢測(cè)條件

參照賈福艷等[16]的方法進(jìn)行，液相色譜柱：Thermo Hypersll GOLD C18 (3 μm, 2.1 × 100 mm)；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相：乙腈與1%冰乙酸體積比為80∶20溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。此條件下，咪唑乙煙酸的保留時(shí)間為1.17 min。

1.4.3 降解菌MZ-1降解性能的測(cè)定

將平板上的菌落接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃，160 r/min培養(yǎng)12 h后，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液在600 nm處的吸光度(OD600)，用滅菌的新鮮培養(yǎng)液將OD600調(diào)節(jié)至1.0，制成母液，按照5 %接菌量，接種至50 mL基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中，其中咪唑乙煙酸初始濃度為200 mg/L，培養(yǎng)溫度 30 ℃，160 r/min，黑暗培養(yǎng)5 d。按照1.4.1方法提取咪唑乙煙酸，按照1.4.2的方法測(cè)定咪唑乙煙酸剩余含量，以不接菌培養(yǎng)液作為對(duì)照。咪唑乙煙酸降解率的計(jì)算公式[17]：

其中：R為降解率，%；c0為對(duì)照培養(yǎng)樣品咪唑乙煙酸殘留量，g/mL；c1為處理樣品咪唑乙煙酸殘留量，g/mL。

1.5 降解菌MZ-1降解條件的優(yōu)化

結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，影響降解菌降解效率的主要環(huán)境因素有pH、溫度、接菌量[18]，采用響應(yīng)面法利用Design-Expert8.0.6 軟件中 Box-Behnken design (BBD)模型進(jìn)行 3 因素 3 水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)以上3個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，以溫度(A)、pH(B)、接菌量(C)為自變量，以5 d后降解率為唯一響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Factors and levels of experiment design

1.6 降解菌Z-1在最優(yōu)條件下生長(zhǎng)和降解曲線測(cè)定

在最優(yōu)pH、溫度、接菌量的條件下將降解菌MZ-1接種于100 mL的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，咪唑乙煙酸初始濃度為200 mg/L，每隔24 h測(cè)定菌液的OD600值和咪唑乙煙酸的降解率，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，分別以O(shè)D600值和降解率為縱坐標(biāo)，根據(jù)時(shí)間與OD600值和降解率的對(duì)應(yīng)關(guān)系繪制降解菌的生長(zhǎng)曲線和降解曲線。

1.7 降解菌MZ-1對(duì)咪唑乙煙酸的去毒效應(yīng)

采用培養(yǎng)皿濾紙法，測(cè)定了菌株MZ-1對(duì)油菜的咪唑乙煙酸的去毒效應(yīng)[2]。選取大小均勻一致的油菜種子10粒，置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，以滅菌的基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液處理為對(duì)照組，將含相同濃度的咪唑乙煙酸培養(yǎng)液分為接菌和不接菌兩組處理，5 d后，分別稀釋10倍、500倍、1 000倍處理種子，30 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)3 d后測(cè)量根長(zhǎng)，計(jì)算各稀釋倍數(shù)咪唑乙煙酸培養(yǎng)處理后對(duì)油菜種子根生長(zhǎng)的抑制率[19]，每組3次重復(fù)。通過(guò)抑制率的大小來(lái)評(píng)價(jià)菌株MZ-1對(duì)咪唑乙煙酸的去毒效應(yīng)。

其中：Y為抑制率，%；g0為對(duì)照組總根長(zhǎng)，cm；g1為處理組總根長(zhǎng)，cm。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

運(yùn)用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，并進(jìn)行LSD差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)；運(yùn)用Origin 2018和Design-Expert11進(jìn)行繪圖和響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌MZ-1鑒定

2.1.1 降解菌MZ-1的形態(tài)及生理生化特性

通過(guò)逐級(jí)加量馴化的方法，分離篩選出1株對(duì)咪唑乙煙酸具有降解能力的細(xì)菌，命名為MZ-1，菌落呈近圓形，灰白色，粗糙無(wú)光澤，中央稍凸起，邊緣不整齊，有的呈缺刻狀，在液體LB培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)迅速，常有菌膜或壁環(huán)形成。生理生化特性測(cè)定結(jié)果如表2所示：降解菌MZ-1為革蘭氏陽(yáng)性菌，具芽孢，產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶和淀粉水解酶，不產(chǎn)生吲哚。

表2 降解菌MZ-1部分生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of degradation bacteria MZ-1

2.1.2 降解菌MZ-1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

將PCR測(cè)序產(chǎn)物拼接后，在GenBank中的注冊(cè)號(hào)為(MW541635)，經(jīng)過(guò)BLAST對(duì)比顯示，菌株MZ-1的16S rRNA與蠟狀芽孢桿菌(N999893)相似度為100%，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖1所示。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特性及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，初步鑒定該菌株為蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)。

圖1 降解菌MZ-1的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 1 Phylogenetic tree of degradation bacteria MZ-1 on the 16S rRNA sequence

2.2 降解菌MZ-1降解咪唑乙煙酸響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1 模型建立及顯著性檢驗(yàn)

綜合考慮各因素對(duì)降解菌MZ-1降解咪唑乙煙酸效率的影響，利用響應(yīng)面分析法對(duì)降解溫度(A)、pH(B)、接菌量(C)三個(gè)因素分析得到最佳降解條件。菌MZ-1響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。由表3可以看出零點(diǎn)試驗(yàn)點(diǎn)的降解率較穩(wěn)定，在72 %左右。利用Design Expert 8.06軟件進(jìn)行回歸擬合，得到咪唑乙煙酸降解回歸方程：咪唑乙煙酸降解率Y(%)=71.63+4.85 A-9.62 B+2.02 C+5.5 AB-1.47 AC + 2.26 BC - 8.84 A2-

23.56 B2- 4.46 C2。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Design results and analysis of Box-Behnken experiment

2.2.2 響應(yīng)面分析與最優(yōu)條件確定

溫度、pH和接菌量交互作用對(duì)咪唑乙煙酸降解率均有顯著影響。當(dāng)接菌量固定時(shí)，隨著溫度和pH的增大，降解率都呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，但隨溫度變化較平緩，說(shuō)明溫度對(duì)降解率影響比pH小，等高線呈閉合的橢圓形說(shuō)明溫度和pH交互作用明顯(圖2A、2B)；當(dāng)pH固定時(shí)，降解率隨溫度和接菌量的增大，均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，但隨接菌量變化平緩，說(shuō)明接菌量對(duì)降解率影響比溫度小，等高線近圓形，說(shuō)明溫度和接菌量交互作用不明顯(圖2C、2D)；當(dāng)溫度固定時(shí)，pH和接菌量的等高線呈閉合橢圓形，說(shuō)明pH和接菌量交互作用明顯(圖2E、2F)。上述分析和表3中方差分析一致。由Design Expert 8.0.6軟件分析計(jì)算，獲得MZ-1降解咪唑乙煙酸的最優(yōu)條件，為了方便操作對(duì)所獲得的最優(yōu)條件進(jìn)行了修正：降解溫度為32 ℃，pH為6.6，接菌量為3%，降解率預(yù)測(cè)值為73.12%。

圖2 各因素交互作用對(duì)降解率影響Fig. 2 Response surface and contour of each factors on degradation of imazethapyr

2.3 最優(yōu)條件下生長(zhǎng)和降解曲線測(cè)定

在最優(yōu)降解條件下，菌株MZ-1在咪唑乙煙酸濃度200 mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中，生長(zhǎng)快速，24 h時(shí)OD600值達(dá)到最大(圖3)。隨著菌株MZ-1的快速生長(zhǎng)，咪唑乙煙酸的降解率逐漸升高，在110 h后，降解率為74.34%，與預(yù)測(cè)值偏差為1.64%，進(jìn)一步說(shuō)明所得優(yōu)化模型能夠較好地預(yù)測(cè)菌株對(duì)咪唑乙煙酸的降解情況。

圖3 菌株MZ-1在最優(yōu)條件下的生長(zhǎng)及降解曲線Fig. 3 Growth and degradation curves of strain MZ-1 under optimal conditions

2.4 降解菌MZ-1對(duì)咪唑乙煙酸的去毒效應(yīng)

菌株MZ-1在稀釋倍數(shù)較高時(shí)對(duì)咪唑乙煙酸有一定的去毒效應(yīng)(圖4)，稀釋倍數(shù)較低時(shí)，由于咪唑乙煙酸濃度過(guò)高，對(duì)油菜產(chǎn)生藥害極嚴(yán)重，根生長(zhǎng)緩慢，兩組處理的差異不明顯。隨著稀釋倍數(shù)的增加，經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)，不同處理對(duì)油菜種子根生長(zhǎng)的抑制率差異顯著。當(dāng)稀釋倍數(shù)為500倍(500×)時(shí)，不接菌處理對(duì)油菜根長(zhǎng)抑制率為51.95%，接菌處理組對(duì)根長(zhǎng)抑制率為45.40%，而當(dāng)稀釋倍數(shù)為1 000倍(1 000×)時(shí)，接菌處理組的抑制率為18.91%，僅為不接菌處理抑制率的52.45%。表明降解菌MZ-1能有效降低咪唑乙煙酸對(duì)后茬敏感作物油菜的毒性，對(duì)咪唑乙煙酸有明顯的去毒效果。

圖4 兩種處理對(duì)油菜種子生長(zhǎng)的影響Fig. 4 Effects of two treatments on seed growth of rape seeds注：圖中不同字母表示同一稀釋濃度下接菌處理與不接菌處理在p≤0.05水平上差異顯著。

3 結(jié)論與討論

本研究篩選出一株對(duì)咪唑乙煙酸有降解能力的蠟狀芽孢桿菌MZ-1。利用響應(yīng)面法得到該菌對(duì)咪唑乙煙酸的最佳降解條件：溫度為32 ℃，pH為6.6，接菌量為3%，在此最優(yōu)條件下，菌株MZ-1在5 d后對(duì)初始濃度為200 mg/L的咪唑乙煙酸預(yù)測(cè)降解率為73.12%。經(jīng)過(guò)菌株MZ-1對(duì)咪唑乙煙酸去毒效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，稀釋倍數(shù)較高即咪唑乙煙酸濃度較低時(shí)，兩組處理差異顯著，接菌處理組對(duì)油菜種子根生長(zhǎng)抑制率顯著低于不接菌處理組，表明菌株MZ-1對(duì)咪唑乙煙酸殘留毒性有去毒效應(yīng)。

蠟狀芽孢桿菌是一類(lèi)兼性好氧、能產(chǎn)生抗逆性芽孢的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，具有遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)、耐高溫和抗逆性強(qiáng)等特性，是一類(lèi)重要的資源微生物，在農(nóng)藥及難降解有機(jī)物殘留污染的生物修復(fù)中有十分廣泛的應(yīng)用前景[20]。目前，關(guān)于蠟狀芽孢桿菌降解農(nóng)藥等難降解有機(jī)物的報(bào)道較多，如陳貝貝等[21]，從棉田土壤中分離得到一株蠟狀芽孢桿菌D8，3 d后對(duì)氟樂(lè)靈的降解率達(dá)59.89%；張成等[22]篩選出一株蠟狀芽孢桿菌WL08，對(duì)烯酰嗎啉有較高降解能力，在最優(yōu)條件下游離的WL08在72 h內(nèi)可將初始濃度為50 mg/L的烯酰嗎啉降解66.95%。此外，蠟狀芽孢桿菌對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留污染的修復(fù)也有較好效果[23]。本研究分離得到的蠟狀芽孢桿菌對(duì)咪唑乙煙酸有較高降解能力，目前未見(jiàn)其他有關(guān)蠟狀芽孢桿菌降解咪唑乙煙酸的報(bào)道。

微生物對(duì)除草劑降解的研究已經(jīng)取得較大進(jìn)展，降解菌菌庫(kù)也得到不斷的補(bǔ)充，但在實(shí)際應(yīng)用中還面臨許多問(wèn)題，主要就是這些降解微生物往往易受到復(fù)雜環(huán)境條件的影響[24]，如pH和土壤中有機(jī)質(zhì)含量。有研究表明，盡管在不同 pH 的熟化土壤中咪唑乙煙酸保持相似的含量，但低pH條件下被土壤吸附的咪唑乙煙酸很快釋放, 而高pH條件下土壤吸附的咪唑乙煙酸難以快速解吸附[25]。本研究從溫度、pH和接菌量三個(gè)方面對(duì)菌株MZ-1降解條件進(jìn)行優(yōu)化，探究其在不同條件下的降解能力。結(jié)果表明pH對(duì)咪唑乙煙酸降解效率的影響最大，且最優(yōu)條件下的pH為6.6，呈弱酸性。因此，菌株MZ-1在實(shí)際應(yīng)用中可以通過(guò)調(diào)節(jié)環(huán)境pH呈弱酸性，保持菌株的降解條件在較優(yōu)水平，使咪唑乙煙酸更易釋放，從而進(jìn)一步提高降解效率。

本研究對(duì)降解菌MZ-1的分類(lèi)學(xué)地位，降解特性進(jìn)行了初步研究，對(duì)其降解條件進(jìn)行了優(yōu)化，并以油菜種子根生長(zhǎng)抑制率為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其去毒效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。但有關(guān)該菌株的代謝途徑，降解產(chǎn)物的成分以及其有關(guān)降解基因的克隆和降解酶制劑等相關(guān)方面還有待進(jìn)一步深入研究。