趙淑果，彭 竹，黃 麗，劉苗苗，趙慧婷

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801）

昆蟲(chóng)在漫長(zhǎng)的進(jìn)化中形成了靈敏的嗅覺(jué)感受機(jī)制，利用嗅覺(jué)確定食物來(lái)源，選擇產(chǎn)卵場(chǎng)地、同伴、配偶和找尋寄主及躲避天敵等。嗅覺(jué)能夠探測(cè)外界環(huán)境中的各種氣味分子，如信息素、植物花香及動(dòng)物體表?yè)]發(fā)物，對(duì)昆蟲(chóng)的生存至關(guān)重要[1]。昆蟲(chóng)主要通過(guò)觸角上分布的各種嗅覺(jué)蛋白執(zhí)行不同功能來(lái)進(jìn)行嗅覺(jué)識(shí)別，各種嗅覺(jué)蛋白相互聯(lián)系共同作用完成昆蟲(chóng)嗅覺(jué)有關(guān)的生理活動(dòng)，并引起昆蟲(chóng)相應(yīng)的行為反應(yīng)。例如當(dāng)昆蟲(chóng)的觸角識(shí)別到空氣環(huán)境中各種氣味物質(zhì)時(shí)，分布在感器淋巴液的氣味結(jié)合蛋白（odorant binging proteins，OBPs）會(huì)與氣味物質(zhì)形成OBP-氣味物質(zhì)的復(fù)合體并轉(zhuǎn)運(yùn)到嗅覺(jué)感受神經(jīng)元的樹(shù)突，這時(shí)就會(huì)激活在樹(shù)突膜分布的嗅覺(jué)受體（odorant receptors，ORs），最后將信號(hào)傳遞到中樞嗅覺(jué)系統(tǒng)引起昆蟲(chóng)的相應(yīng)行為[2]。除此之外，還有化學(xué)感受蛋白（chemosensory proteins，CSPs）、感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白（sensory neuron membrane proteins，SNMPs）和氣味降解酶（odorant degrading enzyme，ODEs）等[3]。OBPs 是一類(lèi)可溶性蛋白，負(fù)責(zé)外界氣味分子與嗅覺(jué)受體之間的聯(lián)系，是嗅覺(jué)識(shí)別的關(guān)鍵蛋白[4]。1981年，VOGT等[5]用同位素標(biāo)記法首次在多音天蠶（Antheraea polyphemus）雄性觸角的毛形感器淋巴液中發(fā)現(xiàn)了第1 個(gè)昆蟲(chóng)氣味結(jié)合蛋白。目前 OBPs 已在鱗翅目[6]、鞘翅目[7]、雙翅目[8]、膜翅目[9]、直翅目[10]和半翅目[11]等11個(gè)目的50多種昆蟲(chóng)中鑒定出800多個(gè)OBPs。

蜜蜂是一種群居的社會(huì)性昆蟲(chóng)，屬于膜翅目（Hymenoptera）細(xì)腰亞目（Apocrita）蜜蜂科（Apidae）蜜蜂屬（Apis）[12]。它們與人類(lèi)的生活息息相關(guān)，多種顯花植物都依靠蜜蜂授粉，在提高農(nóng)作物產(chǎn)量的同時(shí)[13]，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)平衡的維持也具有重要作用[14]。此外，蜜蜂還能為人類(lèi)提供各種天然健康、營(yíng)養(yǎng)豐富的蜂產(chǎn)品，如所熟悉且可食用的蜂蜜、蜂王漿、蜂花粉和蜂膠等[15]。蜂產(chǎn)品在增加人類(lèi)日常飲食種類(lèi)之外，對(duì)人的身體健康也有很大的益處[16]。中華蜜蜂（Apis cerana cerana）簡(jiǎn)稱(chēng)中蜂，是東方蜜蜂的一個(gè)亞種，是我國(guó)飼養(yǎng)的當(dāng)家蜂種，因其具有適應(yīng)低溫、飛行敏捷、嗅覺(jué)靈敏、善于采集零星蜜粉源，適合山區(qū)植物傳粉及抗螨抗病能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，深受廣大養(yǎng)蜂者的歡迎[17]。

目前，中華蜜蜂氣味結(jié)合蛋白的研究已經(jīng)從基因水平深入到蛋白水平，利用基因克隆、重組蛋白原核表達(dá)與純化、熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合及RNA 干擾等技術(shù)揭示了氣味結(jié)合蛋白的功能。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究團(tuán)隊(duì)前期克隆獲得了AcerOBP14基因序列，采用生物信息學(xué)軟件分析了其序列特征，采用qRT-PCR 分析了時(shí)空表達(dá)模式[18]；成功構(gòu)建了Pet28a/AcerOBP14原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)出重組蛋白，通過(guò)熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)鑒定了AcerOBP14重組蛋白對(duì)13種配體物質(zhì)有較強(qiáng)的結(jié)合能力[19]。

基于前期熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果，本研究通過(guò)飼喂法對(duì)中蜂采集蜂AcerOBP14基因干擾前后進(jìn)行qRT-PCR 及觸角電生理試驗(yàn)，旨在為以后深入研究中蜂嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制提供理論參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試中華蜜蜂飼養(yǎng)在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)的蜂場(chǎng)。于8：00—10：00 在無(wú)分蜂、無(wú)病、群勢(shì)強(qiáng)的中蜂巢門(mén)口隨機(jī)捕抓后足攜帶花粉的采粉蜂，用消毒鑷輕輕夾住中蜂采粉蜂胸部，放至木盒中，之后將木盒置于溫度為（28±1）℃、濕度為75%±5%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑Trizol 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；T7 RiboMAX TM Express RNAi System 購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；熒光定量試劑盒2×Realtime PCR Super mix（SYBRgreen，with anti-Taq）購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司；cDNA 合成試劑盒PrimeScript? RT Reagent Kit with gDNA Eraser 購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek 公司；DNA 凝膠回收試劑盒Omega DNA Gel Extraction Kit 購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek 公 司 ；D2000 DNA marker Ladder、核 酸 染 料GoldView、RNase-free water購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；50×TAE Buffer購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；氣味標(biāo)品均購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

利用在線工具 Primer 3（https：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/），輸入AcerOBP14的核苷酸序列，設(shè)計(jì)2個(gè)相對(duì)分子量不同的片段。用于RNAi的對(duì)照基因是NCBI 上獲得的綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）（登錄號(hào)：JQ064510.1）；用于qRT-PCR的內(nèi)參基因是NCBI上獲得的AcerArp1（登錄號(hào)：HM640276.1）。表1為本試驗(yàn)所用的引物序列。

表1 本試驗(yàn)合成的引物Tab.1 Primers synthesized in this study

1.4 體外合成dsRNA

以山西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究團(tuán)隊(duì)保存的含目的基因的質(zhì)粒（Pet28a/AcerOBP14）為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增之后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后參照瓊脂糖凝膠試劑盒的說(shuō)明回收純化，并測(cè)定回收產(chǎn)物質(zhì)量以備后續(xù)合成dsRNA。按照T7 RiboMAX TM Express RNAi System 說(shuō)明書(shū)合成dsRNA，具體的過(guò)程：第1 步在室溫的條件下合成ssRNA；第2步退火合成dsRNA；第3步dsRNA的純化。將dsRNA的濃度測(cè)定后于-80 ℃保存待用。

1.5 dsRNA的飼喂

收集中華蜜蜂采集蜂進(jìn)行dsRNA 的飼喂。RNAi試驗(yàn)設(shè)置：待放置于培養(yǎng)箱中的中蜂饑餓0.5 h后飼喂含有dsAcerOBP14-1的30%糖水的試驗(yàn)組、含有dsAcerOBP14-2 的30%糖水的試驗(yàn)組、含有dsGFP的30%糖水的試驗(yàn)組和只飼喂30%糖水的對(duì)照組。經(jīng)過(guò)前期預(yù)試驗(yàn)每只中蜂需飼喂8μg 的dsRNA。一個(gè)生物學(xué)重復(fù)20只中蜂，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。置于人工培養(yǎng)箱溫度（28±1）℃、濕度75%±5%培養(yǎng)。

1.6 qRT-PCR測(cè)定AcerOBP14的表達(dá)量

收集飼喂dsRNA 24、48、72、96 h的蜜蜂各6只液氮速凍，參照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取RNA，進(jìn)行質(zhì)量和濃度測(cè)定，以1μg 總RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)飼喂dsRNA 后蜜蜂體內(nèi)AcerOBP14的表達(dá)情況，選取沉默效率高的AcerOBP14片段和合適的沉默時(shí)間。參照2×Realtime PCR Super mix（SYBRgreen，with anti-Taq）試劑盒說(shuō)明操作。反應(yīng)體系為：2×Realtime PCR Super mix 7.5μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.6μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 補(bǔ)充至 15 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s，62 ℃ 34 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。選取中蜂AcerArp1基因?yàn)閮?nèi)參基因。每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

1.7 觸角電生理試驗(yàn)

通過(guò)山西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究團(tuán)隊(duì)前期熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)篩選出13 種與AcerOBP14 重組蛋白結(jié)合能力較強(qiáng)的氣味物質(zhì)（表2），將待測(cè)的氣味物質(zhì)溶于石蠟中，終質(zhì)量濃度為300μg/μL。按照1.5中RNAi干擾效率的分析，選取沉默效率較高的dsRNA片段（dsAcerOBP14-1）及最佳干擾時(shí)間（48 h）對(duì)目的基因再次進(jìn)行沉默，然后采中蜂進(jìn)行觸角電位試驗(yàn)。用眼科剪將蜜蜂一側(cè)觸角自基部剪下后，將觸角固定在涂有導(dǎo)電膠的金屬電極上，保證觸角和導(dǎo)電膠充分接觸。移液槍吸取10μL待測(cè)樣品均勻滴加在折疊成“V”形的條狀濾紙（長(zhǎng)3 cm，寬1 cm）上，將濾紙塞入巴斯德管，進(jìn)行EAG測(cè)定。本試驗(yàn)以石蠟為對(duì)照，每根觸角為1次重復(fù)，至少重復(fù)10次。

表2 供試的氣味物質(zhì)Tab.2 Odorant material used in this study

1.8 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)2-ΔΔCt法對(duì)熒光定量結(jié)果Ct值進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析；單因素方差分析使用SPSS 25.0軟件；作圖采用GraphPad Prism 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外合成dsRNA結(jié)果分析

參照T7 RiboMAX TM Express RNAi System 試劑盒說(shuō)明書(shū)體外合成AcerOBP14-1和AcerOBP14-2的dsRNA。測(cè)定濃度和質(zhì)量之后，取1 μL dsRNA經(jīng)20 倍稀釋后電泳檢測(cè)。AcerOBP14-1 的片段長(zhǎng)度為 168 bp，AcerOBP14-2 的片段長(zhǎng)度為 189 bp。從圖1 可以看出，dsRNA 片段條帶清晰，大小均與預(yù)期相一致，經(jīng)核酸定量?jī)x測(cè)定后的dsRNA用于后續(xù)基因沉默介導(dǎo)試驗(yàn)。

2.2 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果分析

qRT-PCR 檢 測(cè)AcerOBP14-1 和AcerOBP14-2在不同時(shí)間處理組中mRNA 的表達(dá)差異，確定最佳的干擾條件。從圖2 可以看出，AcerOBP14-1 和AcerOBP14-2 的dsRNA 片段均能夠在不同程度上降低mRNA 的表達(dá)水平。dsAcerOBP14-1 和dsAcerOBP14-2 在飼喂24、48、72、96 h 后dsRNA 的表達(dá)量均極顯著低于糖水組和dsGFP組（P＜0.05），dsAcerOBP14-1 在飼喂 48 h 時(shí)沉默效果最好，沉默效率達(dá)68.9%。

2.3 觸角電生理結(jié)果分析

根據(jù)2.2 中RNAi 介導(dǎo)的基因沉默效率的比較結(jié)果，本研究選取干擾效果較好的dsAcerOBP14-1再次飼喂采集蜂，并于飼喂48 h 后進(jìn)行EAG 試驗(yàn)如圖3所示。

由圖3可知，飼喂dsRNA后的中華蜜蜂觸角對(duì)2-庚酮、α-法尼烯、β-羅勒烯和檸檬醛的EAG相對(duì)值極顯著降低（P＜0.01），橙花醇和胡椒酮的EAG相對(duì)值顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明這幾種氣味物質(zhì)是AcerOBP14結(jié)合特異性較高的配體物質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是在動(dòng)植物中廣泛存在的一種序列特異性的基因表達(dá)抑制，它通過(guò)降解mRNA、抑制翻譯和重構(gòu)染色質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，是一種廣泛且高效的研究昆蟲(chóng)發(fā)育、生殖、行為和免疫相關(guān)基因功能的試驗(yàn)方法[20]。目前，已在鞘翅目[21]、半翅目[22]、鱗翅目[23]、蜱螨目[24]等生物體上都得到了廣泛應(yīng)用。RNAi 主要有注射法、浸泡法、飼喂法、轉(zhuǎn)基因、病毒感染等方式，由于飼喂法操作簡(jiǎn)單，對(duì)受試?yán)ハx(chóng)機(jī)械損傷小等原因，是較常用的一種RNAi方式。陳藝杰[25]通過(guò)飼喂法沉默意大利蜜蜂AmTO1基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾組（AmTO1）目的基因的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組；范文艷[26]通過(guò)飼喂法探究AccT5H-1基因沉默后中華蜜蜂體內(nèi)抗氧化基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示，沉默后中華蜜蜂體內(nèi)其他抗性基因的表達(dá)量均上調(diào)。晁玉珍[27]通過(guò)飼喂法沉默中華蜜蜂體內(nèi)AccMKP3和AccApoD基因，發(fā)現(xiàn)有抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄水平變化明顯，并且POD、SOD 和CAT 這些抗氧化酶的活性也明顯增加。從這些研究結(jié)果可見(jiàn)，通過(guò)飼喂法沉默蜜蜂體內(nèi)基因的表達(dá)可以產(chǎn)生良好的效果。本試驗(yàn)通過(guò)飼喂法干擾中蜂采集蜂AcerOBP14的基因表達(dá)量，通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)在不同時(shí)間處理組中mRNA的表達(dá)差異，最終篩選出了最佳的干擾片段及確定了最佳的干擾條件，即dsAcerOBP14-1 較dsAcerOBP14-2 沉默效果更好，且在飼喂48 h 時(shí)沉默效果最好，沉默效率達(dá)68.9%。WICHER 等[28]在對(duì)果蠅（Drosophila melanogaster）胚胎進(jìn)行RNA 干擾時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著dsRNA 鏈的增長(zhǎng)RNAi 干擾效果增強(qiáng)，片段長(zhǎng)的dsRNA干擾活性較大。郭麗娜等[29]研究了中華蜜蜂氣味受體AcerOr2，設(shè)計(jì)并合成了3個(gè)不同大小的dsRNA 片段進(jìn)行RNAi，發(fā)現(xiàn)短鏈dsRNA 沉默效果最好。而本試驗(yàn)中AcerOBP14同樣是片段短的dsRNA沉默效果較好，這可能是因?yàn)橥葱院芨叩幕?，長(zhǎng)鏈dsRNA造成了非靶標(biāo)基因沉默，故短鏈dsRNA的干擾效果更好。

觸角電生理（EAG）可以靈敏記錄昆蟲(chóng)觸角對(duì)微量信息物的反應(yīng)，通過(guò)測(cè)試刺激引起的受體電位反應(yīng)值的大小可以判斷刺激物對(duì)昆蟲(chóng)是否有活性，或者昆蟲(chóng)是否對(duì)刺激物產(chǎn)生反應(yīng)，它代表了觸角對(duì)所測(cè)試化合物的嗅覺(jué)靈敏度，是昆蟲(chóng)嗅覺(jué)、信息素生物測(cè)定研究的重要技術(shù)之一[30]。徐偉等[31]通過(guò)EAG 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，β-石竹烯和芳樟醇對(duì)中華弧麗金龜甲（Popillia quadriguttata）的雌蟲(chóng)有明顯的引誘作用；蘋(píng)果小吉丁蟲(chóng)雌雄成蟲(chóng)觸角對(duì)（-）-α-蒎烯、壬醛、（+）-α-蒎烯、苯甲醛、癸醛、丙烯酸丁酯產(chǎn)生較強(qiáng)觸角電位反應(yīng)[32]。

本研究結(jié)合前期熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果，選擇干擾效果較好的dsRNA 片段再次飼喂中蜂采集蜂進(jìn)行EAG試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中蜂觸角對(duì)2-庚酮、α-法尼烯、β-羅勒烯和檸檬醛的EAG 反應(yīng)值極顯著降低（P＜0.01），橙花醇和胡椒酮的EAG 反應(yīng)值顯著降低（P＜0.05），法尼醇、油酸甲酯、β-石竹烯、亞麻酸、（+）-3-蒈烯、1-辛醇和丁香酚的EAG反應(yīng)值變化不顯著。研究表明，2-庚酮是一種報(bào)警信息素，當(dāng)工蜂成為守衛(wèi)蜂或采集蜂時(shí)，它們的上顎腺就能產(chǎn)生類(lèi)似干乳酪氣味的化合物2-庚酮。蜂群發(fā)生盜蜂或有其他蜂王入侵時(shí)，守衛(wèi)蜂或采集蜂就會(huì)產(chǎn)生2-庚酮這種危險(xiǎn)的信號(hào)，接受到信號(hào)的本群工蜂也分泌這種信息素，召集富于攻擊性的工蜂以驅(qū)趕入侵者保護(hù)蜂巢[33]。橙花醇和檸檬醛屬于那氏信息素，它是由工蜂那氏腺分泌的、具有特殊氣味的信息化學(xué)物質(zhì)，在蜜蜂的許多活動(dòng)中起引導(dǎo)和定向作用有利于工蜂確定巢位[34]。NICHOLAS等[35]研究發(fā)現(xiàn)，橙花醇對(duì)工蜂具有高度吸引力。另外，那氏腺分泌物可以調(diào)節(jié)分蜂及蜂群移動(dòng)，還能夠吸引散團(tuán)的工蜂重新集結(jié)[36]。因此，推測(cè)AcerOBP14可能參與蜂群的有序進(jìn)行，對(duì)蜂群的穩(wěn)定起到重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)了另一種蜜蜂幼蟲(chóng)信息素β-羅勒烯，它有抑制蜜蜂工蜂的卵巢成熟，提高工蜂采粉行為及增加哺育蜂訪問(wèn)巢房頻率的作用[37]。吳帆[38]通過(guò)EAG試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，漿蜂和意蜂哺育蜂觸角可以在3 ms 內(nèi)識(shí)別幼蟲(chóng)揮發(fā)物β-羅勒烯，漿蜂哺育蜂對(duì)低濃度的β-羅勒烯有很強(qiáng)的反應(yīng)，說(shuō)明漿蜂哺育蜂對(duì)幼蟲(chóng)揮發(fā)性信息素β-羅勒烯識(shí)別很靈敏。這對(duì)于工蜂飼喂幼蟲(chóng)發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，工蜂可以根據(jù)β-羅勒烯這種信號(hào)調(diào)節(jié)幼蟲(chóng)食物分配。另外，β-羅勒烯還是蘭科石斛花的重要成分，胡椒酮和α-法尼烯也屬于植物花香揮發(fā)物，它們的花香在蜂蝶類(lèi)授粉中發(fā)揮著重要作用。由此推測(cè)，AcerOBP14可能參與工蜂的采集、幼蟲(chóng)食物分配等相關(guān)行為。然而，對(duì)于蜜蜂這種具有高度社會(huì)性特征的群體，參與其生命活動(dòng)的一些行為不單單由一個(gè)基因調(diào)控，需要多個(gè)基因協(xié)同作用，因此，了解OBPs在蜜蜂行為活動(dòng)中承擔(dān)的角色，對(duì)探究蜜蜂嗅覺(jué)分子機(jī)制具有重要的作用。

綜上所述，中華蜜蜂氣味結(jié)合蛋白AcerOBP14-1和AcerOBP14-2 的dsRNA 片段均能在不同程度上降低目的基因mRNA表達(dá)水平。dsAcerOBP14-1有較好的沉默效果，且在飼喂48 h 時(shí)沉默效果最好。EAG 試驗(yàn)表明，中蜂觸角對(duì)2-庚酮、α-法尼烯、β-羅勒烯和檸檬醛的EAG反應(yīng)值在飼喂dsRNA前后極顯著降低（P＜0.01），橙花醇和胡椒酮的EAG 反應(yīng)值顯著降低（P＜0.05）。推測(cè)AcerOBP14可能參與了工蜂采集、幼蟲(chóng)食物分配及蜂群秩序維護(hù)等相關(guān)行為。