王海燕，王釗華，馬 波

宮頸癌是臨床常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，現(xiàn)已成為全球第四大女性癌癥。隨著宮頸癌篩查計(jì)劃的開(kāi)展及HPV疫苗的推廣，部分早期宮頸癌及癌前病變患者得到及時(shí)治療，發(fā)病率和病死率都顯著降低。對(duì)于晚期及復(fù)發(fā)宮頸癌患者，化療是最常用的治療手段。順鉑是最有效的化療藥物之一，以其高效、低毒性的特征，在宮頸癌治療中發(fā)揮重要作用，但其耐藥性會(huì)降低化療效果，是晚期及復(fù)發(fā)宮頸癌患者預(yù)后不良的主要原因。青藤堿是從傳統(tǒng)中藥青風(fēng)藤中提取的生物堿，常用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及神經(jīng)疼痛，發(fā)揮其鎮(zhèn)痛、抗炎的功效，且近期研究發(fā)現(xiàn)其具有一定抗癌活性。有報(bào)道顯示，青藤堿可通過(guò)抑制卵巢癌細(xì)胞活力，誘發(fā)細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)。然而，目前關(guān)于其對(duì)于宮頸癌細(xì)胞化療耐藥的作用及相關(guān)可能機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)建立Hela細(xì)胞順鉑耐藥模型，研究青藤堿對(duì)順鉑耐藥性的影響，并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 人卵巢癌Hela細(xì)胞系，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物、主要試劑、儀器 青藤堿(純度≥98%，上海麥克林生化科技有限公司)，Notch通路特異性激活劑Jagged1蛋白(美國(guó)MCE公司)，順鉑注射液(江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20040813，規(guī)格：30 mg)，MTT試劑盒(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)全蛋白提取試劑盒(上海研生實(shí)業(yè)有限公司)，兔抗人神經(jīng)源性基因Notch同源蛋白1(Neurogenic locus notch homolog protein 1，Notch1)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and ac- tivator of transcription 3，STAT3)、發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1(hairy and enhancer of split 1，Hes1)蛋白一抗(美國(guó)R&D公司)。

Synergy H4全功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Tek公司)，Accuri C6流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，PowerPac Basic電泳儀、Gel Doc XR一體式凝膠成像分析儀(美國(guó)Bio-rad公司)

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將人卵巢癌Hela細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清、1%青霉素+鏈霉素雙抗)中，標(biāo)準(zhǔn)條件(37 ℃，5% CO)培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.4 建立Hela細(xì)胞順鉑耐藥模型 取對(duì)數(shù)期Hela細(xì)胞加入完全培養(yǎng)液，分別加入不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2 μg/ml)順鉑溶液，1周后耐藥性誘導(dǎo)完成。

1.5 MTT法檢測(cè)不同濃度順鉑對(duì)Hela、Hela/順鉑細(xì)胞的增殖抑制率 取對(duì)數(shù)期Hela、Hela/順鉑細(xì)胞，加入含順鉑(2、4、8、16、32 μg/ml)DMEM培養(yǎng)液，干預(yù)48 h后每孔加20 μl MTT溶液(5.00 g/L)，2 h后棄上清，每孔加150 μl DMSO溶液，振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-不同濃度順鉑 A值/空白對(duì)照A值)×100%，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC)。

1.6 細(xì)胞分組、干預(yù)取對(duì)數(shù)期Hela/順鉑細(xì)胞，PBS洗滌，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10個(gè)/ml，接種于6孔板，待細(xì)胞融合至60%，采用簡(jiǎn)單隨機(jī)分組的方式分為對(duì)照組、青藤堿組、激活劑組、青藤堿聯(lián)合激活劑組。對(duì)照組不處理，青藤堿組加入青藤堿DMSO溶液(40 μmol/L終濃度)，激活劑組加入Jagged1蛋白DMSO溶液(500 ng/ml)，青藤堿聯(lián)合激活劑組加入青藤堿DMSO溶液(40 μmol/L終濃度)+Jagged1蛋白生理鹽水溶液(500 ng/ml)。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，干預(yù)48 h后繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 MTT法檢測(cè)不同濃度順鉑對(duì)各組細(xì)胞的增殖抑制率 取各組細(xì)胞，加入含順鉑(2、4、8、16、32 μg/ml)DMEM培養(yǎng)液，同1.5操作，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-不同濃度順鉑 A值/空白對(duì)照A值)×100%，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC)。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取各組細(xì)胞，調(diào)整密度至1×10個(gè)/ml，接種于6孔板。更換為含8 μg/ml順鉑的DMEM培養(yǎng)液，干預(yù)48 h后PBS充分洗滌，2800 r/min離心10 min(離心半徑12 cm)，預(yù)冷binding buffer標(biāo)記液重懸細(xì)胞，加入5 μl AnnexinV-FITC混合均勻，4 ℃遮光孵育15 min，加入5 μl PI染液染色5 min，過(guò)濾，60 min內(nèi)經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。

1.9 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達(dá) 取各組細(xì)胞，加入預(yù)冷的RIPA裂解液裂解，注入離心管中，3500 r/min離心15 min(離心半徑10 cm)，收集沉淀物，采用BCA法定量蛋白。取50 μg待測(cè)蛋白，與SDS-PAGE上樣緩沖液按1∶5的體積比均勻混合，100 ℃金屬浴加熱5 min，注入離心管中，8000 r/min離心10 min(離心半徑8 cm)，取其上清液，恒壓下行上樣電泳分離，30 min后經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗膜，加入兔抗人Notch1、Stat3、Hes1一抗(1:500)，4 ℃搖床孵育2 h，TBST洗膜，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜，加入ECL發(fā)光液顯色，暗室曝光，采用一體式凝膠成像系統(tǒng)掃描、分析結(jié)果，以Notch1、Stat3、Hes1蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度順鉑對(duì)Hela、Hela/順鉑細(xì)胞的增殖抑制率、IC值 不同順鉑濃度對(duì)Hela、Hela/順鉑細(xì)胞增殖抑制率、IC值細(xì)胞間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)；不同順鉑濃度對(duì)Hela/順鉑細(xì)胞的增殖抑制率高于Hela細(xì)胞，IC值低于Hela細(xì)胞(<0.05，表1)。

表1 不同順鉑濃度對(duì)Hela、Hela/順鉑細(xì)胞增殖抑制率及IC50值比較

2.2 不同濃度順鉑對(duì)各組細(xì)胞的增殖抑制率、IC值 與對(duì)照組比較，青藤堿組不同順鉑濃度對(duì)細(xì)胞增殖抑制率升高，IC降低，激活劑組不同順鉑濃度對(duì)細(xì)胞增殖抑制率降低，IC升高(<0.05)；與青藤堿組比較，青藤堿聯(lián)合激活組不同順鉑濃度對(duì)細(xì)胞增殖抑制率降低，IC升高(<0.05)；與激活劑組比較，青藤堿聯(lián)合激活組不同順鉑濃度對(duì)細(xì)胞增殖抑制率升高，IC降低(<0.05，表2)。

表2 不同順鉑濃度對(duì)各組細(xì)胞增殖抑制率及IC50值比較

2.3 凋亡率 對(duì)照組、青藤堿組、激活劑組、青藤堿聯(lián)合激活組凋亡率分別為(11.59±1.33)%、(24.68±3.96)%、(3.57±0.45)%、(16.12±3.01)%，與對(duì)照組比較，青藤堿組凋亡率升高(<0.05)，激活劑組凋亡率降低(<0.05)；與青藤堿組比較，青藤堿聯(lián)合激活組凋亡率降低(<0.05)；與激活劑組比較，青藤堿聯(lián)合激活組凋亡率升高(<0.05，圖1)。

圖1 各組Hela細(xì)胞凋亡流式圖

2.4 細(xì)胞Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較，青藤堿組Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達(dá)量降低(<0.05)，激活劑組Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達(dá)量升高(<0.05)；與青藤堿組比較，青藤堿聯(lián)合激活劑組Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達(dá)量升高(<0.05)；與激活劑組比較，ATL聯(lián)合轉(zhuǎn)染組Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達(dá)量降低(<0.05，表3，圖2)。

表3 各組細(xì)胞Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達(dá)量比較

圖2 Western Blot法檢測(cè)各組Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達(dá)量

3 討 論

宮頸癌是發(fā)生在子宮陰道部及宮頸管的惡性腫瘤，多產(chǎn)生于子宮頸黏膜上皮層內(nèi)，后侵入黏膜下間質(zhì)，逐步進(jìn)展為腫瘤侵入陰道及生殖器官。其早期癥狀與宮頸炎相似，表現(xiàn)為陰道接觸性出血及陰道排液增多，后期則表現(xiàn)為輸尿管梗阻、腎盂積水，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)尿毒癥。性生活過(guò)早、患有性傳播疾病、病毒或真菌感染等均是其危險(xiǎn)因素。晚期及復(fù)發(fā)宮頸癌患者通常采用以化療為主的非手術(shù)治療方式。癌細(xì)胞在順鉑的長(zhǎng)期作用下，會(huì)產(chǎn)生抵抗適應(yīng)性反應(yīng)，順鉑對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性降低，產(chǎn)生耐藥性。目前關(guān)于宮頸癌細(xì)胞順鉑耐藥機(jī)制尚不明確，通常認(rèn)為與DNA修復(fù)功能增強(qiáng)、順鉑在癌細(xì)胞內(nèi)積累過(guò)少、抗凋亡相關(guān)通路激活及細(xì)胞自噬功能減弱有關(guān)。因此，探尋宮頸癌細(xì)胞化療耐藥性的原因，尋找有效提升順鉑敏感性的治療手段，對(duì)于提高化療成功率、改善患者預(yù)后意義重大。

順鉑類(lèi)化療藥物為攻伐之品，易耗氣傷陰，導(dǎo)致臟器虧損、脾胃虛弱、氣血不足等證，雖然抑制了腫瘤生長(zhǎng)，但對(duì)機(jī)體也造成損傷。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的抗癌新藥物大多與中草藥有關(guān)，部分中草藥提取物可發(fā)揮抗腫瘤及改善腫瘤細(xì)胞耐藥性的功效，已成為臨床研究熱點(diǎn)。青風(fēng)藤是《本草綱目》《本草圖經(jīng)》等多個(gè)古代醫(yī)書(shū)記載的傳統(tǒng)中草藥，取自防己科植物青藤、毛青藤藤莖，性平，味苦、辛，歸肝、脾經(jīng)，可舒筋活血，正骨利髓。青藤堿是其主要活性物質(zhì)，具有抗癌、抗病毒、抗血管生成、保護(hù)器官損傷等作用。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，青藤堿組不同順鉑濃度對(duì)細(xì)胞增殖抑制率、IC均升高，凋亡率升高，提示青藤堿可減弱宮頸癌細(xì)胞化療耐藥性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Chen等研究認(rèn)為，青藤堿通過(guò)激活細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路，減弱人膀胱癌253J細(xì)胞化療多藥耐藥性，本研究結(jié)果與其相似。

Notch信號(hào)通路是機(jī)體內(nèi)高度保守的信號(hào)通路，由受體、配體、DNA結(jié)合蛋白及效應(yīng)分子組成，參與增殖、凋亡等細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，Notch1是其受體蛋白，與Notch配體結(jié)合后被金屬蛋白酶分解生成亞基NEC，在γ-分泌酶的作用下，產(chǎn)生Notch胞內(nèi)段，其直接進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，作用于下游靶基因Hes1，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。STAT家族是JAKs下游底物蛋白，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，作為關(guān)鍵激活轉(zhuǎn)錄因子參與癌細(xì)胞增殖、自噬、凋亡等多種生理過(guò)程，STAT3是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)與激活轉(zhuǎn)錄因子，廣泛分布于多種細(xì)胞質(zhì)中，被細(xì)胞因子受體激活后形成二聚體，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與相關(guān)基因序列結(jié)合，轉(zhuǎn)錄下游靶基因，與Notch信號(hào)通路串聯(lián)，共同作用調(diào)控腫瘤細(xì)胞化療敏感性。有研究表明，下調(diào)STAT3、Notch1基因可提高耐藥性MDA-MB-231三陰性乳腺癌細(xì)胞系化療敏感性。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，青藤堿組Notch1、Stat3、Hes1蛋白表達(dá)量降低，且在青藤堿的基礎(chǔ)上增加Notch通路特異性激活劑Jagged1蛋白可減弱青藤堿對(duì)宮頸癌細(xì)胞的化療增敏作用，提示青藤堿可能通過(guò)介導(dǎo)該通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而降低宮頸癌細(xì)胞化療耐藥性。

綜上所述，青藤堿可提高化療藥物對(duì)宮頸癌細(xì)胞的增殖抑制率，并促進(jìn)其凋亡，從而減弱宮頸癌細(xì)胞化療耐藥性，可能通過(guò)抑制Notch1/STAT3信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。