葛子強，張顯赫，黃子越，夏浩明，徐藝，王志東

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院膽胰外科，黑龍江 哈爾濱 150086

作為世界上第六大常見的癌癥及全球癌癥死亡率的第二大原因[1]，肝細胞癌(hepatocellular carcinoma， HCC)占原發(fā)性肝癌(primary liver cancer， PLC)的85%～90%[2]。HCC的危險因素包括肝硬化、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒的慢性感染、非酒精性脂肪肝、過度飲酒、遺傳因素、肥胖及吸煙等[3]。目前HCC的診斷方法仍然存在許多局限，血清甲胎蛋白(AFP)被廣泛用于HCC的早期篩查，但在肝炎、肝硬化等非惡性腫瘤的肝臟疾病中也會出現(xiàn)不同程度的升高[4]；且肝臟CT及磁共振成像(MRI)對<2 cm的結(jié)節(jié)顯示不清[5]。由于缺乏特異性高的生物標志物和不良臨床癥狀，大多數(shù)HCC病人發(fā)現(xiàn)時已出現(xiàn)肝內(nèi)或肝外轉(zhuǎn)移，根治性手術(shù)治療仍為HCC的有效治療手段，但術(shù)后高復發(fā)率導致HCC病人總體5年生存率僅為50%～70%，而晚期HCC病人5年生存率則不到15%[5]。

外泌體(exosome)是由機體內(nèi)活細胞分泌的廣泛存在于各種體液中大小約40～160 nm、具有脂質(zhì)雙層膜的細胞外囊泡，通過跨膜蛋白與靶細胞受體直接作用、質(zhì)膜融合或直接接觸將內(nèi)含DNA、RNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及小分子代謝物等生物信息分子傳遞至靶細胞內(nèi)，建立細胞間信息傳遞系統(tǒng)，介導并參與抗原呈遞、細胞分化、生長、腫瘤中的免疫反應、腫瘤細胞的遷移和侵襲等過程從而調(diào)節(jié)受體細胞的生物學行為[6-7]。外泌體最初被認為是清除細胞中降解的和不需要的細胞成分的垃圾箱。基于其獨特分子結(jié)構(gòu)及其低免疫原性與細胞毒性，外泌體攜帶的非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)可免受核糖核酸酶誘導的降解呈穩(wěn)定表達，表明它們可能是細胞間交流的載體[8]；其次外泌體ncRNA的組織特異性與空間特異性提示其可以體現(xiàn)不同腫瘤的特征或在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[9]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA， lncRNA)是一類無蛋白編碼能力的、長度超過200個核苷酸的RNA分子，研究顯示外泌體lncRNA參與介導包括HCC、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌等惡性腫瘤的生物學行為。此文將對外泌體lncRNA調(diào)節(jié)HCC發(fā)生發(fā)展及其在HCC診治、預后中的作用加以綜述。

一、外泌體lncRNA參與HCC惡性生物學行為

1.外泌體lncRNA參與增殖與抗凋亡 腫瘤細胞通過獲得持續(xù)增殖信號達成細胞無限增殖及逃逸程序性的細胞凋亡，最終實現(xiàn)癌細胞的長久存活，但其分子發(fā)生機制不盡相同。Kogure等[10]研究證實HCC腫瘤細胞(Hep3B、PLC/PRF/5)衍生的外泌體可被相鄰細胞吸收，且相比于供體細胞，共有14個超級保守的lncRNA在外泌體中表達發(fā)生顯著變化，其中TUC339在外泌體中高度富集。利用小干擾RNA外源性沉默lncRNA TUC339可抑制腫瘤細胞的增殖以及對細胞外基質(zhì)的黏附能力，提示外泌體介導的lncRNA TUC339可充當細胞間信號傳導介質(zhì)，調(diào)節(jié)腫瘤細胞局部微環(huán)境，進而促進腫瘤的生長發(fā)育。不同的是，Huang等[11]研究證實外泌體lncRNA RP11-85G21.1(lnc85)可靶向吸附miR-324-5p，從而阻礙其發(fā)揮功能，間接促進下游增殖蛋白與基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMP)2和MMP9的表達，進而誘導HCC腫瘤細胞的增殖、抗凋亡及侵襲遷移能力，且lnc85在AFP陽性和AFP陰性的HCC病人中均呈顯著上調(diào)表達，表明其可作為區(qū)分AFP陰性的HCC與健康對照和肝硬化的獨立生物標志物(靈敏度為80.0%，特異度為76.5%)，或與其他腫瘤標志物聯(lián)合以優(yōu)化HCC的診斷。Cao等[12]除證實肝癌高表達轉(zhuǎn)錄本(highly up-regulated in liver cancer，HULC)在HCC的病理組織和腫瘤細胞系(HepG2、SMMC7721)中表達異常上調(diào)外，還發(fā)現(xiàn)HCC病人相比于健康對照組lncRNA HULC在血清外泌體中呈異常高表達。體外細胞實驗中利用siRNA-lncRNA HULC轉(zhuǎn)染HCC細胞系實現(xiàn)了腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移侵襲抑制效應并誘導凋亡發(fā)生。進一步研究揭示了該現(xiàn)象的潛在機制：lncRNA HULC通過靶向吸附miR-372-3p，解除其與下游靶基因Rab11a3′-非翻譯區(qū)(untranslated region， UTR)的結(jié)合，從而阻礙其發(fā)揮功能，間接上調(diào)Rab11a基因的表達，進而促進腫瘤的生長發(fā)育。此研究為HULC在肝癌中的作用機制提供了新的見解。另外，Wang等[13]研究顯示外泌體內(nèi)高表達的lncRNA H19可靶向吸附miR-520a-3p，解除其與下游靶基因LIM結(jié)構(gòu)域激酶1(LIM domain kinase 1， LIMK1) 3′-UTR的結(jié)合，實現(xiàn)LIMK1的上調(diào)表達效應，加速丙泊酚處理HCC細胞的增殖、侵襲和遷移并抑制凋亡發(fā)生。這些研究描述了肝癌中外泌體lncRNA的表達特征，同時確定了其在細胞增殖與抗凋亡調(diào)控中起的重要作用，并促進了外泌體lncRNA相關(guān)生物標志物或治療靶點的開發(fā)。

2.外泌體lncRNA參與侵襲與轉(zhuǎn)移 癌細胞的轉(zhuǎn)移往往是惡性腫瘤不良預后的主要原因。長期以來，對腫瘤轉(zhuǎn)移機制的研究主要集中在腫瘤與機體的相互作用上。然而，近年來發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的外泌體通過在細胞間傳遞特異性信息，在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA ATP-dependent RNA helicase FAL1在HCC組織及HCC腫瘤細胞衍生外泌體內(nèi)高表達，且高表達組病人總體生存期(overall survival， OS)明顯縮短，進一步研究發(fā)現(xiàn)lncRNA FAL1可作為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA， ceRNA)直接結(jié)合miR-1236來阻斷其與下游靶標鋅指E-盒結(jié)合同源異形盒(zinc finger E-box binding homebox， ZEB1)和AFP 3′-UTR的結(jié)合，抑制miR-1236對ZEB1和AFP表達的負向調(diào)控，而高表達的ZEB1和AFP可誘導腫瘤細胞增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition， EMT)的發(fā)生，進而增強其轉(zhuǎn)移侵襲能力。這些發(fā)現(xiàn)提示lncRNA FAL1在HCC中起致癌作用，并可能對未來新的診斷生物標志物或新的治療靶點的開發(fā)有重要價值。同樣，Gramantieri等[15]研究顯示HCC細胞衍生的外泌體lncRNA LUCAT1通過靶向吸附miR-181d-5p從而阻礙其發(fā)揮功能，抑制癌細胞的EMT發(fā)生，進而降低腫瘤細胞的侵襲潛能，且較高的lncRNA CASC9和lncRNA LUCAT1水平與HCC術(shù)后更低的復發(fā)率和更長的復發(fā)時間相關(guān)。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA SENP3-EIF4A在HCC組織和血漿外泌體內(nèi)表達下調(diào)，并且其表達水平與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。正常肝細胞分泌的外泌體SENP3-EIF4A可轉(zhuǎn)移至HCC細胞，通過ceRNA機制競爭性結(jié)合miR-9-5p，解除其對下游靶基因鋅指蛋白36(zinc finger protein 36， ZFP36)的表達抑制，而高表達的ZFP36可誘導細胞凋亡并抑制侵襲和遷移。其結(jié)果表明，SENP3-EIF4A1通過外泌體直接從正常細胞轉(zhuǎn)移到HCC細胞，在體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)HCC的生物學功能。并且，它參與正常細胞和癌細胞在HCC發(fā)生期間的通信過程，是臨床檢測肝癌的一種新的有利生物標志物。

3.外泌體lncRNA參與免疫調(diào)節(jié) 腫瘤的發(fā)生與發(fā)展與腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，外泌體可攜帶lncRNA參與調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境，在腫瘤細胞、免疫細胞和基質(zhì)細胞之間傳遞生物活性分子，幫助癌細胞躲避機體自身的免疫監(jiān)視，誘導免疫耐受。巨噬細胞是先天性免疫防御的關(guān)鍵角色，在腫瘤微環(huán)境中越來越受到重視。外源性沉默lncRNA TUC339可增加巨噬細胞中促炎細胞因子的產(chǎn)生并增強共刺激分子表達及其吞噬作用，且lncRNA TUC339表達與M(IL-4)巨噬細胞極化正相關(guān)，表明lncRNA TUC339可通過外泌體介導轉(zhuǎn)移至HCC腫瘤微環(huán)境內(nèi)巨噬細胞，參與調(diào)控巨噬細胞活化和M1/M2極化，進而誘導腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視并終止免疫攻擊[17]。這項研究不僅加深了我們對lncRNA調(diào)節(jié)巨噬細胞功能的理解，而且還揭示了腫瘤細胞與天然免疫之間復雜的相互作用關(guān)系。不同于巨噬細胞參與免疫調(diào)節(jié)，程序性死亡蛋白-1(programmed death-1， PD-1)是一種免疫檢查點受體，表達于免疫細胞表面，而程序性死亡蛋白配體-1(programmed death-ligand1， PD-L1)和PD-L2是PD-1的配體(PD-Ls)，在多種腫瘤中呈高水平表達。Fan等[18]利用癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫篩選HCC腫瘤組織和正常肝組織中與PD-L1和PD-L2相關(guān)的lncRNAs，其中PCED1B-AS1與其密切相關(guān)且豐度最高，同時其在血漿外泌體中也呈上調(diào)表達。臨床病理數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示PCED1B-AS1表達水平與腫瘤數(shù)量、癌腫大小、晚期TNM分期(Ⅲ期、Ⅳ期)以及病人不良預后密切相關(guān)。進一步研究顯示HCC細胞釋放的外泌體PCED1B-AS1通過靶向吸附hsa-miR-194-5p，以解除其與下游靶基因mRNA3′-UTR的結(jié)合，間接促進PD-L1和PD-L2的高表達，實現(xiàn)PCED1B-AS1與PD-L1和PD-L2的同趨勢表達，進而誘導受體HCC細胞中PD-Ls介導的免疫抑制并損害受體T細胞和巨噬細胞的細胞活性。免疫調(diào)節(jié)機制的研究幫助我們從另一個角度理解腫瘤的發(fā)生過程，從而發(fā)現(xiàn)更多潛在生物標志物和治療靶點。

4.外泌體lncRNA參與化學耐藥性 腫瘤的耐藥性是導致治療失敗的常見原因，腫瘤病人在化療過程中產(chǎn)生耐藥性而導致效果欠佳和腫瘤高復發(fā)率仍然是亟待解決的問題。近年來，越來越多的研究表明，腫瘤細胞通過分泌含有耐藥性lncRNA的外泌體，從而誘導細胞產(chǎn)生對化療藥物的抗性。Takahashi等[19]研究顯示轉(zhuǎn)化生長因子-β可降低HCC細胞對索拉非尼或阿霉素的敏感性，并選擇性富集HCC細胞源性的外泌體內(nèi)長鏈非編碼RNA-重編碼調(diào)控因子(linc-ROR)導致其高表達，同時使具有干細胞表型的腫瘤起始細胞內(nèi)CD133+表達增加和部分群落生長，進而誘導HCC細胞的化學耐受性。利用siRNA外源性敲低linc-ROR可增加化療誘導的細胞毒性和細胞凋亡并抑制肝臟腫瘤干細胞的自我更新、自我分化及成球能力。這些發(fā)現(xiàn)確定了可能針對HCC的部分介質(zhì)及其發(fā)生機制，有助于增強這些細胞間信號機制和介質(zhì)的敏感性，并改善其對用于治療HCC的常規(guī)治療劑的反應。該團隊還發(fā)現(xiàn)外泌體linc-ROR可作為缺氧反應性lncRNA，可通過miR-145/缺氧誘導因子-1α亞單位(hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α)信號傳導軸與HCC中的缺氧信號傳導通路功能性連接，增加下游靶基因miR-145的表達，抑制核糖體s6蛋白激酶1的磷酸化及下調(diào)3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1和HIF-1α的表達，進而在缺氧應激中延長細胞存活時間[20]。另有研究[21]證實在化療應激期間，HCC細胞及其分泌的外泌體內(nèi)linc-VLDLR表達增加，RNA干擾介導的linc-VLDLR基因敲除可抑制三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白G超家族成員2(ATP-binding cassette superfamily G member 2， ABCG2)的表達并誘導細胞周期阻滯及降低細胞生存能力，而ABCG2的過度表達可恢復HCC細胞的化療耐受性。了解化療耐藥機制對于HCC等對化療藥物反應非常差的癌癥尤其重要。索拉非尼是一種多激酶抑制劑，通過阻斷多種生長因子發(fā)揮抗血管生成和抗腫瘤作用[22]。該化療藥物是美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準的治療晚期肝癌的唯一藥物，但由于獲得性耐藥率高，該藥物的有效性受到極大限制[23]，確定HCC的化療耐藥機制有可能改善使用索拉非尼等藥物治療肝癌的療效。

5.外泌體lncRNA參與血管生成 血管生成被認為是腫瘤生長迅速、早期轉(zhuǎn)移和生存不良的主要原因[24]。由于靶向腫瘤血管生成是治療肝癌的關(guān)鍵，所以研究肝癌血管生成的潛在機制具有重要意義。肝癌干細胞通過分泌外泌體激活信號通路，誘導血管生成使其抵抗低氧環(huán)境，而血管微環(huán)境又可以分泌生長因子經(jīng)內(nèi)分泌途徑正反饋作用于肝癌干細胞，加速血管的生成，最終促進腫瘤細胞的增殖與侵襲性細胞表型的形成。Conigliaro等[25]研究顯示CD90+腫瘤干細胞樣肝細胞(CD90+Huh7)可通過分泌富含lncRNA H19的外泌體實現(xiàn)細胞間基因轉(zhuǎn)移，進而影響受體細胞表型。內(nèi)皮細胞將CD90+Huh7釋放的外泌體吸收內(nèi)化，過表達的lncRNA H19可促進血管內(nèi)皮生長因子及其受體、細胞間黏附因子的表達，刺激內(nèi)皮細胞血管生成并通過促進內(nèi)皮細胞和CD90+Huh7異型黏附來加速兩者的結(jié)合。故外泌體可能通過調(diào)控靶細胞相關(guān)mRNA的轉(zhuǎn)錄以促進血管生成，這可能成為減少肝癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移的新治療靶點。另外，除了上述通路，Li等[26]研究表明：外泌體SNHG16(long noncoding RNA small nucleolar RNA host gene 16)通過PI3K/Akt/mTOR通路分泌miR-4500來促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞活化，并調(diào)節(jié)GalNT1表達，從而促進腫瘤血管生成。這項研究強調(diào)了外泌體在肝癌細胞和內(nèi)皮細胞之間通信中的重要作用，并提出外泌體SNHG16可作為肝癌抗血管生成的治療靶點。

二、外泌體lncRNA作為HCC診斷標志物

隱匿性發(fā)病和缺乏準確有效的早期診斷性生物標志物是HCC病人低OS的主要原因。傳統(tǒng)的診斷標志物，如AFP、AFP-L3、鋁巖藻糖苷酶(AFU)和維生素K缺乏或拮抗Ⅱ誘導蛋白質(zhì)(PIVKA-Ⅱ)，對肝癌的診斷具有較低的敏感性和特異性。而外泌體lncRNA對腫瘤微環(huán)境影響廣泛，有特異性高、穩(wěn)定性強、檢測便捷等特點，其非創(chuàng)傷性檢測方式可作為未來診斷及治療的理想生物標志物。在外泌體中，發(fā)現(xiàn)了10個上調(diào)的lncRNA，即LINC00161、ENSG00000248932.1、ENST00000440688.1、ENST00000457302.2、lncRNA-RP11-583F2.2、lncRNA FAM72D-3、lncRNA Jpx、lncRNA ENSG00000258332.1、lncRNA LINC00635、lncRNA HEIH[27-33]，構(gòu)成HCC中潛在的診斷生物標志物。其中，前9個lncRNA的受試者工作特征曲線下面積(AUC)分別為0.794、0.776、0.612、0.720、0.965、0.584、0.865、0.719、0.750。同時，Matboli等[29]研究證實外泌體lncRNA-RP11-583F2.2(96.7%， 91.7%)在HCC診斷中比AFP(90%，85%)具有更高的靈敏度和特異度，而lncRNA Jpx的靈敏度和特異度分別為91.5%和72.7%，相對較差。外泌體中l(wèi)ncRNA的下調(diào)表達也具有很高的診斷價值。Yao等[30]研究顯示外泌體中l(wèi)ncRNA EPC1-4表達下調(diào)，過表達后可抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡，其AUC為0.852，表明其可作為HCC診斷的非侵入性循環(huán)生物標志物。雖然單個外泌體lncRNA可作為HCC的診斷依據(jù)，但對于高危人群，聯(lián)合生物標志物檢測將比單個生物標志物更準確地預測HCC。Xu等[31]比較了55例HCC病人、60例慢性乙型肝炎病人、60例健康對照者的血清外泌體lncRNA ENSG00000258332.1和LINC00635的表達水平：HCC組的lncRNA ENSG00000258332.1和LINC00635的水平顯著高于其他組，且術(shù)后兩種lncRNA均明顯降低，ENSG00000258332.1、LINC00635和AFP的組合區(qū)分HCC病人與慢性丙型肝炎病人的AUC為0.894，靈敏度為83.6%，特異度為87.7%。

三、外泌體lncRNA與HCC預后及復發(fā)

外泌體lncRNA表達失調(diào)與HCC病人的臨床病理特征密切相關(guān)。準確預測肝癌病人的臨床預后有助于指導肝癌治療決策，從而有效提高病人的生存效益。在外泌體中，有5種與預后相關(guān)的lncRNA顯著上調(diào)，即lncRNA-ATB、lncRNA CTD-2116N20.1、lncRNA RP11538D16.2、lncRNA CRNDE、lncRNA ASMTL-AS1[34-37]，所有這些高表達的lncRNA已被證實是肝癌預后不良的潛在生物標志物。臨床上，外泌體中l(wèi)ncRNA-ATB的表達水平與TNM分期及門靜脈血栓形成密切相關(guān)[34]，而lncRNA CRNDE過表達在腫瘤較大、分化較差、TNM分期晚期的HCC病人中更為常見[36]，ASMTL-AS1表達與肝癌分期、轉(zhuǎn)移及預后有關(guān)[37]。其中Lee等[34]報道更高的lncRNA-ATB表達提示更短的OS和無進展生存期(progress free survival， PFS)，進一步Cox回歸多因素分析顯示：lncRNA-ATB表達上調(diào)、腫瘤體積增大、C-反應蛋白升高可作為腫瘤進展或死亡的獨立預測因子。同樣，Hou等[35]研究的Kaplan-Meier生存曲線表明lncRNA CTD-2116N20.1和lncRNA RP11538D16.2過度表達的病人OS和PFS較短(P<0.05)，二者可通過調(diào)節(jié)外泌體中蛋白質(zhì)的表達水平導致HCC病人預后不良。此外，血清外泌體lncRNA CRNDE表達較低的病人的OS和 DFS顯著延長，進一步的單因素和多因素分析表明，高血清外泌體lncRNA CRNDE表達是預后不良的獨立指標[36]。Ma等[37]研究表明，外泌體lncRNA ASMTL-AS1通過miR-342-3p/NLK/YAP信號軸加重射頻消融不足后殘留HCC的惡性程度，為射頻消融不足后肝癌的治療和預防殘留肝癌的復發(fā)或轉(zhuǎn)移提供了新思路。

四、小結(jié)與展望

綜上所述，外泌體可通過攜帶各種lncRNA參與介導腫瘤細胞與周圍細胞的信息交流，進而不同程度地影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時外泌體lncRNA通過調(diào)控細胞信號通路促進腫瘤細胞的增殖與侵襲遷移能力，刺激血管生成及化療耐受性的產(chǎn)生，并可作為HCC診斷和預后的評估指標。然而外泌體lncRNA在HCC中的研究仍較少：當前已發(fā)現(xiàn)的外泌體攜帶的lncRNA較少，且外泌體裝載lncRNA的機制未清晰；關(guān)于外泌體lncRNA應用于臨床的研究仍處于起步階段，且外泌體lncRNA作為HCC新型生物標志物的特異性還需進一步提高。不過相信隨著新技術(shù)的不斷出現(xiàn)及對外泌體研究的深入，人類對HCC的治療效果將大大改善。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突