吳會斌，武小冬

分析檢測

Clinimix E（克靈麥）中4-胍基丁酸的測定

吳會斌，武小冬

（遼寧海思科制藥有限公司，遼寧 興城 125100）

目的：建立Clinimix E（克靈麥）中氨基酸注射液4-胍基丁酸的測定方法。方法：采用HPLC法測定，以HILIC為填充劑；以乙腈-0.02 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液（用氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH值至5.50）（75∶25）為流動相，流速為每分鐘1.0 mL；檢測波長為200 nm；柱溫為35 ℃。結(jié)果：在1.232～24.631 μg·mL-1范圍內(nèi)，4-胍基丁酸的濃度與峰面積之間線性關(guān)系良好；該方法的重復(fù)性和準確度的 RSD 值分別為2.9%、0.8%。結(jié)論：該方法專屬性、重現(xiàn)性、準確度良好，可用于Clinimix E（克靈麥）中氨基酸腔袋4-胍基丁酸的測定。

4-胍基丁酸；HPLC法；克靈麥

Clinimix E（克靈麥）是一種氨基酸葡萄糖注射液雙室袋腸外營養(yǎng)制劑，原研公司為Baxter公司，適用于口服或腸內(nèi)營養(yǎng)供給不能、不足或禁忌者，通過腸外營養(yǎng)補充熱量、蛋白質(zhì)和電解質(zhì)，還可用于負氮平衡的治療[1]。本品含有人體合成蛋白質(zhì)所需的15種氨基酸，包含8種必需氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸），2種半必需氨基酸(精氨酸、組氨酸)，以及5種其他非必需氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸)。本品所含氨基酸組成與優(yōu)質(zhì)蛋白相似，必需氨基酸/總氨基酸=41.3%，必需氨基酸/總氮=2.5，支鏈氨基酸/總氨基酸=19%，本品不含有亞硫酸鹽抗氧化劑，符合目前通用的優(yōu)質(zhì)營養(yǎng)型復(fù)方氨基酸的標準[2-7]。

復(fù)方氨基酸注射液在生產(chǎn)及貯藏過程中有可能會產(chǎn)生多種氨基酸雜質(zhì)。目前報道較多的為色氨酸的相關(guān)雜質(zhì)，檢測方法大多為液質(zhì)聯(lián)用法和高效液相色譜法[8-16]。通過氨基酸降解試驗可知，精氨酸氧化降解可產(chǎn)生4-胍基丁酸。本研究建立了一種高效液相色譜法檢測制劑中精氨酸的降解雜質(zhì)4-胍基丁酸，為完善質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（Agilent）、PB-10 pH計（Sartorius）、SQP電子天平（Sartorius）、4-胍基丁酸對照品（Sigma，批號：MKBK4239V）、磷酸二氫鈉、乙腈。

1.2 供試品

Clinimix E（克靈麥）氨基酸腔袋藥液（Baxter Healthcare Corporation，批號：P377481）。

1.3 實驗方法

1.3.1 操作步驟

取本品原液作為供試品溶液；取4-胍基丁酸對照品約10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，以75%乙腈溶解并稀釋至刻度，作為對照品貯備液；精密量取對照品貯備液1 mL，置10 mL量瓶中，以75%乙腈稀釋至刻度，作為對照品溶液。照高效液相色譜法測定，以HILIC為填充劑；以乙腈-0.02 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液（用氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH值至5.50）（75∶25）為流動相，流速為每分鐘1.0 mL；檢測波長為200 nm；柱溫為35 ℃。

1.3.2 方法學考察

1.3.2.1 色譜條件篩選

通過對緩沖鹽pH、流動相的比例、洗脫方式、色譜柱以及進樣體積的篩選，最終確定4-胍基丁酸的檢測方法。

1.3.2.2 檢測波長選擇

取4-胍基丁酸對照品適量，以75%乙腈溶解制成適當濃度的溶液。采用高效液相色譜儀（HPLC-DAD）在190～400 nm波長處進行測定，記錄色譜圖。

1.3.2.3 專屬性

按處方配制除精氨酸以外的陰性樣品，取樣品及陰性樣品分別在酸、堿、氧化、高溫、光照條件下破壞，按照1.3.1中的色譜條件測定。

1.3.2.4 線性

取4-胍基丁酸的對照品適量，用75%乙腈溶解并稀釋制成不同濃度的對照品溶液，進樣進行考察。記錄色譜圖，以濃度作為橫坐標，峰面積作為縱坐標，計算標準曲線方程。

1.3.2.5 重復(fù)性試驗

按照1.3.1中操作步驟，制備對照品溶液及供試品溶液。精密量取對照品溶液和供試品溶液各2 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算6份供試品溶液中4-胍基丁酸含量的相對標準偏差（RSD%）。

1.3.2.6 準確度試驗

取4-胍基丁酸對照品適量，以75%乙腈制成每1 mL約含50 μg的對照品溶液，分別取上述對照品溶液1.0、2.0、3.0 mL置于10 mL量瓶中，使用樣品溶液稀釋至刻度。每個濃度平行制備3份樣品，精密量取2 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算9份回收率及其相對標準偏差（RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件篩選

通過對緩沖鹽pH、流動相的比例、洗脫方式、色譜柱以及進樣體積的篩選，最終確定4-胍基丁酸的檢測方法為：以HILIC為填充劑；以乙腈-0.02 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液（用氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH值至5.50）（75∶25）為流動相，流速為每分鐘1.0 mL；檢測波長200 nm；柱溫35 ℃，進樣體積2 μL。

表1 色譜條件篩選試驗結(jié)果

2.2 檢測波長選擇

采用高效液相色譜儀（HPLC-DAD）在190～400 nm波長處進行測定對照品溶液，結(jié)果顯示4-胍基丁酸在200 nm附近處有最大收峰，因此選擇200nm作為4-胍基丁酸的測定波長。

2.3 專屬性

按處方配制除精氨酸以外的陰性樣品，取樣品和陰性樣品分別于酸、堿、氧化、高溫、光照條件下破壞后，產(chǎn)生的降解雜質(zhì)與4-胍基丁酸峰分離良好，不干擾4-胍基丁酸的測定；陰性、空白溶劑均不干擾樣品中4-胍基丁酸的檢測，說明該色譜條件專屬性良好。

2.4 線性

取4-胍基丁酸對照品適量，用75%乙腈溶解并稀釋制成不同濃度的對照品溶液，進樣考察。記錄色譜圖，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，計算標準曲線方程。結(jié)果表明，4-胍基丁酸進樣濃度在1.232～24.631 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，其線性方程為= 4.003 3-0.622 8 (= 0.999 )。

圖1 4-胍基丁酸紫外光譜圖

圖2 4-胍基丁酸標準曲線

2.5 重復(fù)性

按照1.3.1中操作步驟，制備對照品溶液和供試品溶液。精密量取對照品溶液和供試品溶液各2 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算6份供試品溶液中4-胍基丁酸含量的相對標準偏差（RSD%），結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.6 準確度

取4-胍基丁酸對照品適量，以75%乙腈制成每1 mL約含50 μg的對照品溶液，分別取上述對照品溶液1.0、2.0、3.0 mL置于10 mL量瓶中，用樣品溶液稀釋至刻度。每個濃度平行制備3份樣，精密量取2 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算9份樣品回收率及其相對標準偏差（RSD）。結(jié)果表明，該方法回收率高，滿足分析測定的要求。

表3 回收率試驗結(jié)果

3 結(jié) 論

本研究建立了腸外營養(yǎng)制劑Clinimix E（克靈麥）中氨基酸注射液精氨酸雜質(zhì)4-胍基丁酸的測定方法。采用高效液相法，選擇Hilic為填充劑的色譜柱，磷酸鹽乙腈緩沖系統(tǒng)作為流動相。

試驗結(jié)果表明，氨基酸注射液經(jīng)酸破壞、堿破壞、氧化破壞、高溫破壞和光照破壞后，產(chǎn)生的降解產(chǎn)物均對4-胍基丁酸的測定無干擾。該方法專屬性好、線性范圍廣、簡便快捷結(jié)果準確，為Clinimix E（克靈麥）及同類產(chǎn)品中精氨酸雜質(zhì)4-胍基丁酸的測定提供一定的參考。

[1]Clinimix E（克靈麥）說明書[R]. Baxter Healthcare Corporation, 2019.10．

[2]郭雷, 周長明, 李輝, 等．復(fù)方氨基酸注射液(18AA-Ⅱ)中焦谷氨酸雜質(zhì)的研究[J]．華西藥學雜志，2020，35 (6)：668-671．

[3]FUKUWATARI T, SHIBATA K．Nutritional aspect of tryptophan metabolism[J]．, 2013, 6 (Suppl 1): 3-8．

[4]劉蕾，姜峰，歐陽漢霖，等．HPLC-ELSD法測定氨基酸原料藥中5種糖類雜質(zhì)[J]．中國藥科大學學報，2021，52 (1)：66-70.

[5]MARDONES O，DEVIA E，LABBE B S，et a1．Effect of L-trypto- phan and melatonin supplementation on the serotonin gastroin- testinal content and digestive enzymatic activity for Salmo satar and Oncorhynchus kisutch[J]．，2018，1 (1)：482-485．

[6]MIEHALOWSKA M，ZNORKO B，KAMINSKI T，et a1．New insights into tryptophan and its metabolites in the regulation of bone metabolism[J]．，2015，66 (6)：779-784．

[7]賀穎，梁宇紅，楊志杰，等. 腸外營養(yǎng)液處方分析及機構(gòu)知識庫建立研究進展[J]. 中國臨床新醫(yī)學，2021，14（3）：325-328．

[8]劉悅，賈曼，崔婧，等. 超高效液相色譜一三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測細胞培養(yǎng)基中3種色氨酸代謝物[J]．中國食物與營養(yǎng)，2019，25 (2)：37-40．

[9]王瑞, 唐愛國. 高效色譜法同時測定血清中的犬尿氨酸和色氨 酸[J]. 色譜, 2006, 24 (2): 140-143

[10]謝紀珍，崔師睿，周沖，等. 高效液相色譜法測定復(fù)方氨基酸（15）腹膜透析液中色氨酸降解產(chǎn)物[J]. 食品與藥品，2019，21（4）：298-303

[11]BAXTER J H, LAI C S, PHILLIPS R R, et al. Direct determination of methionine sulfoxide in Milk proteins by enzyme hydrolysis/ highperformance liquid chromatography[J]., 2007, 1157 (1-2): 10-16.

[12]潘望平, 徐小玲, 蔡蓓, 等. 鳥氨酸雜質(zhì)的小鼠急性毒性和細胞毒性考察[J].中國藥師，2018，21（2）：346-348.

[13]王靜，姜凌娟.脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液氨基酸注射液中吲哚-3-甲醛的測定[J]. 遼寧化工，2021，50（06）：907-911.

[14]樓永明，林敏，陳秀琳.HPLC測定復(fù)方氨基酸注射液（18AA）有關(guān)物質(zhì)的初步研究[J].中國藥品標準，2019，20（1）：37-41.

[15]楊萬運, 冷嘉琦, 羅艷玲，等.HPLC法測定(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸、焦谷氨酸和環(huán)-(甘氨酰谷氨酰胺)含量的方法[J].山東化工，2020，49（20）：64-66.

[16]李莉, 周穎, 崔紅艷，等.復(fù)方氨基酸注射液(18AA)中焦谷氨酸的限量檢查方法研究[J].云南化工，2018，45（6）：124-127．

Determination of 4-Guanidinobutyric Acid Content in Clinimix E

,

（Liaoning Haisco Pharmaceutical Co., Ltd., Xingcheng Liaoning 125100, China）

A method for determination of 4-guanidinobutyric acid in amino acid injection of Clinimix E by HPLC was established. Hilic was used as filler, acetonitrile-0.02 mol·L-1buffer solution（regulating pH to 5.50）(75∶25) was used as mobil phase,the flow rate was 1.0 mL·min-1,the test wave length was 200 nm, the column temperature was 35 ℃. The results showed that, there was a good linear between the mass concentration of 4-guanidinobutyric acid and peak area at the range of 1.232～24.631 μg·mL-1.Thevalues of the reproducibility test and the precision test were 2.9% and 0.8%, respectively. So, the method has good indentification, reproducibility and accuracy, and can be used to determine the 4-guanidinobutyric acid in aminic acid injection of Clinimix E.

4-Guanidinobutyric acid; HPLC; Clinimix E

TQ46

A

1004-0935（2022）02-0281-03

2021-08-16

吳會斌（1973-），男，遼寧省葫蘆島市人，工程師，1997年畢業(yè)于沈陽藥科大學藥物制劑專業(yè)，研究方向：藥品生產(chǎn)、質(zhì)量、研發(fā)。