王東旭，劉倍汐，葉慧敏，高月，于岸弘，張穎，孔亮

磁性材料在酶固定化領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展

王東旭，劉倍汐，葉慧敏，高月，于岸弘，張穎，孔亮*

（大連海洋大學(xué) 海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧 大連 116023）

與化學(xué)催化相比，游離酶作為生物催化劑，以獨(dú)特的性質(zhì)使生物酶的工業(yè)化得到快速發(fā)展。但是游離酶在工業(yè)生產(chǎn)時(shí)有諸多的不足，比如穩(wěn)定性差、無法重復(fù)利用、不易保存、自動(dòng)化生產(chǎn)難度高等。因此，固定化酶技術(shù)的出現(xiàn)加快了酶催化領(lǐng)域的發(fā)展。近年來，人們從多學(xué)科交叉的角度提出以磁性材料為載體固定酶制劑的固定化方法，利用高效、易分離、重復(fù)利用率高等優(yōu)勢研發(fā)出新型的功能化磁性固定化酶材料，提高了酶催化效率，使該領(lǐng)域日益受到廣泛的關(guān)注。對應(yīng)用于酶固定化的磁性材料合成、磁性材料固定化酶進(jìn)行全面的綜述，并扼要對其各自特點(diǎn)進(jìn)行了比較，最后介紹了磁性固定化酶的應(yīng)用。

固定化酶；固定化方法；磁性載體材料；固定化酶的應(yīng)用

生物酶催化高效且單一性強(qiáng)，于溫和的反應(yīng)條件下即可發(fā)生生物催化作用。但是游離態(tài)酶的穩(wěn)定性較差，活性保存時(shí)間短，在工業(yè)生產(chǎn)中無法多次使用，因此酶固定化作為重要的生物工程技術(shù)快速發(fā)展起來。固定化酶技術(shù)是指將游離的酶通過相應(yīng)方法固定在一定空間或不溶性載體上，進(jìn)而限制游離酶自由運(yùn)動(dòng)，并能保持酶的生物結(jié)構(gòu)和活性的完整性，使酶能夠長時(shí)期發(fā)揮催化作用，并且可以重復(fù)利用的生物工程技術(shù)[1]。固定化酶技術(shù)早在1916年由Nelosn和Griffin等建立，他們發(fā)現(xiàn)蔗糖酶吸附到骨炭微粒后仍與游離酶的催化活性一致[2]，并初步提出了固定化酶的思想。到20世紀(jì)60年代末，千煙一郎等通過固定化?；被饷覆鸱至税被嵝猱悩?gòu)體，并成功實(shí)現(xiàn)了該技術(shù)的工業(yè)化[3]，隨后固定化酶技術(shù)進(jìn)入了飛速發(fā)展的階段。傳統(tǒng)的固定化材料存在固定化效率低下，固定化方式造成固定化酶活性降低等不足之處，因此，新型的固定化材料及合成技術(shù)不斷涌現(xiàn)，并成為研究熱點(diǎn)，其中磁性載體材料因制備簡便、成本低、性質(zhì)穩(wěn)定、可控性好、易于分離回收等特點(diǎn)，作為新型載體應(yīng)用于固定化酶，并成為近些年快速發(fā)展的新方向。本文對磁性載體材料合成方法和磁性固定化酶應(yīng)用的兩方面進(jìn)行了綜述。

磁性材料的制備

磁性材料在生產(chǎn)生活中應(yīng)用廣泛，在現(xiàn)代科技和工業(yè)領(lǐng)域，特別是在電氣工程領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用。磁性材料種類很多，其中Fe3O4顆粒因制備方法比較簡單、成本低、毒性小、結(jié)構(gòu)和功能的可預(yù)期性、易于調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)而被大力發(fā)展[4]。相對于高分子材料，磁性材料對生物酶具有較好的吸附性能，對生物酶的捕集能力強(qiáng)，諸多官能團(tuán)如巰基(—SH)、氨基(—NH2)、羧基(—COOH)、磺酸基(—SO3H)、羥基(—OH)等均可以被用于吸附材料的改性。以上的活性基團(tuán)對生物酶具有很強(qiáng)的固定化作用，通過改性后的磁性材料可有效地選擇性吸附生物酶形成固定化酶。磁性材料制備方法主要有物理法和化學(xué)法，其中物理法又可分為研磨法、包埋法、超聲波沉淀法等；化學(xué)法可分為共價(jià)沉淀法、水熱法、溶膠-凝膠法、快速燃燒法等[5-7]等。

1.1 物理法

1.1.1 研磨法

Papell首先提出了研磨法[8-9],在該法中，首先將合金按照一定比例進(jìn)行機(jī)械混合，再加入適量無水乙醇等有機(jī)試劑形成漿料，通過研磨將合金制成粗顆粒，經(jīng)長時(shí)間球磨后進(jìn)行濃縮得到非晶粉，然后在一定的條件下結(jié)晶得到磁性材料。在該研磨法基礎(chǔ)上成功地制備了庚烷、油酸和粉狀磁鐵礦的磁性膠體以及其他磁性液體復(fù)合材料。研磨法具有制備技術(shù)簡單的特點(diǎn)，但其制備時(shí)間長、成本高、材料使用效率低，材料中雜質(zhì)過多，獲得高濃度的磁體較為困難，因此使用性能不佳。

1.1.2 超聲波沉淀法

該方法是利用超聲波的機(jī)械擾動(dòng)合成磁流體。當(dāng)超聲波能量達(dá)到一定程度時(shí), 就會(huì)產(chǎn)生“超聲空化”現(xiàn)象, 即溶液中氣泡在聲場作用下產(chǎn)生的一系列動(dòng)力學(xué)過程，當(dāng)足夠強(qiáng)度的超聲波通過液體時(shí),在聲波負(fù)壓半周期的聲壓幅值超過液體內(nèi)部靜壓強(qiáng)時(shí),存在于液體中的微小氣泡形成“空化核”，并迅速增大[10], 能得到粒徑均一穩(wěn)定的磁性粒子。研究表明，隨著超聲頻率的增加，粒徑減小，比表面積增大，晶面的衍射強(qiáng)度較小[10]。Sivarajan[11]等以Al2(SO4)3-尿素-水為研究體系，研究了超聲波對磁粒的粒徑、形狀的影響。超聲波能有效防止顆粒聚集，從而促進(jìn)新晶相的形成。通過超聲波沉淀法獲得的磁粒具有很好的結(jié)構(gòu)特性和磁性。

1.1.3 包埋法

此法運(yùn)用機(jī)械攪拌、超聲分散等方法使磁性顆粒均勻懸浮在溶液中，利用范德華力、共價(jià)鍵或氫鍵等作用，使磁性顆粒均勻分布在天然或者合成聚合物中[12]，然后經(jīng)過乳化等處理過程，可在磁性粒子表面形成高分子殼層。為增加磁粒的穩(wěn)定性，使用交聯(lián)劑對高分子殼層進(jìn)行穩(wěn)定化處理。安小寧[13]等采用殼聚糖包埋磁粉，經(jīng)戊二醛修飾、環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)制得高磁性殼聚糖微粒，應(yīng)用于胰蛋白酶的親和純化，但粒徑不均一且不呈球形。利用該法的優(yōu)點(diǎn)是制備操作簡便，易于進(jìn)行，磁粒表面官能團(tuán)不易損失。缺點(diǎn)是無法有效的控制磁性材料的粒徑，磁性顆粒分布寬，并且形成的磁粒的結(jié)構(gòu)不規(guī)則。

1.2 化學(xué)法

1.2.1 共價(jià)沉淀法

共價(jià)沉淀法[14]是合成磁性材料的一種簡便且有效經(jīng)濟(jì)的一種方法，該方法首先將含有Fe2+和Fe3+混合溶液與氨水進(jìn)行反應(yīng)，然后經(jīng)干燥脫水，得到了不溶于水的Fe3O4磁粒。由于Fe3O4磁?；瘜W(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，需要加入沉淀劑保護(hù)磁粒防止其變性，并需要氮?dú)獗Ｗo(hù)。楊玉東使用該法，通過氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在堿性條件下，將氯化鐵和氯化亞鐵均勻混合制備得到粒徑5 nm的磁性粒子[15]。最后將Fe3O4磁粒與表面活化劑充分反應(yīng)獲得鐵氧體磁性液體。該方法操作簡單、反應(yīng)時(shí)間短、制備成本低，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，但是在制備中磁性材料的粒徑不易控制，粒徑分布不均勻，磁體中容易引入一定的雜質(zhì)。

1.2.2 水熱法

水熱法也稱熱液法，反應(yīng)需在特定的反應(yīng)釜中進(jìn)行，通過加熱在密閉的容器中產(chǎn)生一個(gè)高溫高壓的環(huán)境制備材料的方法，使不溶物質(zhì)開始溶解并且重新結(jié)晶，即加熱重結(jié)晶。Mizutani等制備了粒徑均勻的磁性顆粒，是在初始溶液里加入硫酸鹽來調(diào)節(jié)粒徑的尺寸。粒徑大小根據(jù)溶劑的濃度而變化，范圍在9.5～38.6 nm之間[16]。該法制備磁性材料工藝簡單，無須高溫煅燒，可以得到的產(chǎn)物純度高、粒徑均勻。但由于反應(yīng)容器需要使用耐高溫高壓的材料，在一定程度影響了應(yīng)用前景。

1.2.3 溶膠-凝膠法

溶膠-凝膠法[17]是后期發(fā)展起來的代替高溫固相合成反應(yīng)陶瓷、玻璃和固體材料的一種方法。該方法是將易于水解的金屬醇鹽或無機(jī)鹽等化合物與水發(fā)生反應(yīng),經(jīng)水解與縮聚反應(yīng) 逐漸凝膠化,在進(jìn)一步干燥燒結(jié)等處理后得到氧化物或其他化合物的晶形薄膜。Sarah[18]等用該法制備了多晶鐵氧體，經(jīng)均勻混合后制成復(fù)核材料，磁粒的磁性與BaTiO3含量的增加而減弱。該法工藝流程簡單、產(chǎn)物粒徑小且均勻，易于制備較大面積的薄膜，原料成本低，但是實(shí)驗(yàn)周期長，在凝膠時(shí)容易裂開，有機(jī)試劑易揮發(fā)，對人體有一定毒副作用，且該方法易受到反應(yīng)環(huán)境影響。

表1 常見的磁性材料制備方法的比較

1.2.3 快速燃燒法

該法也稱溶液燃燒法，是一種新興的制備磁性材料的方法，該法是鐵鹽和有機(jī)鐵鹽均勻溶解在可燃的有機(jī)溶劑中，點(diǎn)燃溶劑燃燒至熄滅，然后按一定的反應(yīng)條件下煅燒形成磁性材料。Dinesha[19]等制備了Co和ZnO納米磁性材料，具有結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)，磁性材料的磁性隨溫度上升而提高，隨Co含量上升而下降。該法優(yōu)點(diǎn)是不需添加助溶劑，也無須洗滌，制備簡便且周期短，材料成本低，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，通過調(diào)控反應(yīng)條件可以控制磁性材料的粒徑[20]。

2 磁性材料固定化酶的應(yīng)用

2.1 阿魏酸酯酶固定化應(yīng)用

阿魏酸酯酶[21]在工業(yè)中的應(yīng)用非常廣泛，主要用于水解植物細(xì)胞壁中半纖維素間、半纖維素與木質(zhì)素之間的阿魏脂鍵，如在造紙行業(yè)中使用阿魏酸酯酶可減少制漿的化學(xué)藥品用量，還可提高紙品的機(jī)械強(qiáng)度。另一重要應(yīng)用是用來制備食品醫(yī)藥領(lǐng)域中的抗氧化劑——阿魏酸，如果在工業(yè)生產(chǎn)中一次性投放阿魏酸脂酶，則無法回收，造成不必要的浪費(fèi)。與游離酶相比，磁性材料固定化的阿魏酸酯酶在重復(fù)使用3次后的酶活仍保持85%，7次使用后保留有35.54%的酶活。酶經(jīng)過固定化之后各項(xiàng)性質(zhì)均得到了提高，并且磁性固定化阿魏酸酯酶能夠非?？旖莸貜姆磻?yīng)體系中回收重復(fù)使用。

2.2 磁性材料固定化脂肪酶的應(yīng)用

生物柴油是以油料作物、餐飲垃圾油等油脂原料通過酯交換或熱化學(xué)工藝得到的脂肪酸單酯，是極具前景的可替代石化柴油的再生性柴油燃料[22]。因反應(yīng)條件溫和、對環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)，生物酶法是合成生產(chǎn)生物柴油的主流方法。其中脂肪酶是合成生物柴油的生物催化劑[23]，研究表明固定化脂肪酶具有穩(wěn)定性高、反應(yīng)在室溫下進(jìn)行、工業(yè)成本低、催化效率高等優(yōu)勢。張宇等采用磁性納米Fe3O4材料固定化脂肪酶在最優(yōu)反應(yīng)條件下制備生物柴油，結(jié)果表明酯轉(zhuǎn)換率達(dá)到86.69%[24]，進(jìn)一步證明了磁性材料固定化脂肪酶在生物柴油產(chǎn)業(yè)化過程中的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2.3 在有機(jī)廢水處理上的應(yīng)用

隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展，工業(yè)廢物等伴生的各種有機(jī)污染物不斷進(jìn)入環(huán)境水體中，漆酶可以有效降解水體中苯酚和芳香胺等有機(jī)污染物，固定化漆酶在工業(yè)利用過程中要比游離態(tài)漆酶的使用時(shí)間更長，穩(wěn)定性更高，耐受性更強(qiáng)，是一種高效催化劑，并且價(jià)格低廉，來源廣泛，因此被大規(guī)模的應(yīng)用在工業(yè)廢水處理中，尤其應(yīng)用于食品工業(yè)廢水處理中，處理后的廢水明顯得到改善。王苗苗等將介孔SiO2/ Fe3O4磁性中空微球當(dāng)載體，運(yùn)用物理吸附進(jìn)行固定化漆酶，吸附3 h后，對漆酶的有效固定化量達(dá)到689 mg·g-1，以此固定化酶處理濃度為10 mg·g-1的2,4-二氯化酚水溶液，6 h之后固定化漆酶對其去除率達(dá)到81.6%[25]，表現(xiàn)出優(yōu)良的分離和重復(fù)利用的特性。

2.4 磁性材料固定化乳糖酶應(yīng)用

乳糖酶是一種無味、綠色的生物酶，廣泛存在動(dòng)植物及微生物體內(nèi)[26]。在全球范圍內(nèi)70%的成人缺乏腸道乳糖酶，該酶把乳糖在一定條件下分解[27]。磁性固定化乳糖酶的反應(yīng)溫度和pH范圍一定程度上大于游離態(tài)酶，并且具有便于從反應(yīng)體系中回收、乳糖酶的活性保持率高等優(yōu)勢，固定化酶反復(fù)使用5次后酶活仍保持了65%，磁性材料固定化乳糖酶在活力及穩(wěn)定性上有所提升[28]。

3 總結(jié)和展望

生物酶在現(xiàn)代工業(yè)中起著至關(guān)重要的作用，游離酶的在工業(yè)生產(chǎn)中出現(xiàn)的各種問題，致使固定化酶應(yīng)運(yùn)而生，并使生物酶工程快速發(fā)展。因此在生物醫(yī)學(xué)、食品行業(yè)、環(huán)境工程中具有廣泛的應(yīng)用前景。磁性材料固定化酶在反應(yīng)過程中保持了較高穩(wěn)定性和酶活性，利用磁性載體，在酶催化反應(yīng)中引入磁場，能夠改變固定化酶的方向，可以進(jìn)一步提高固定化酶的降解效率，同時(shí)便于反應(yīng)體系中固定化酶的分離，回收后的固定化酶可反復(fù)使用，降低了酶催化成本。在固定化技術(shù)中，磁性酶催化正形成一個(gè)新的領(lǐng)域。

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Research Progress in Application of Magnetic Materials in Enzyme Immobilization

,,,,,,*

(College of Marine Technology and Environment, Dalian Ocean University, Dalian Liaoning 116023, China)

Compared with chemical catalysts, free enzymes have developed rapidly in industry because of their unique advantages. However, free enzymes have many deficiencies in industrial production, such as poor stability, non-reuse, difficult preservation, poor automatic production level. Therefore, the immobilized enzyme technology has accelerated the development of enzyme catalysis. Recently, the method of immobilizing enzyme with magnetic carrier material was proposed based on the interdisciplinary. Using the advantages of high efficiency, easy separation and high reuse rate, many new functional magnetic immobilized enzyme materials have been developed to improve the enzyme catalytic efficiency. It has become one of the research hotspots in the field of immobilized enzymes. In this paper, the synthesis of magnetic materials for enzyme immobilization and the methods of enzyme immobilization by magnetic materials were comprehensively reviewed, and their characteristics were briefly compared. Finally, the application of magnetic immobilized enzyme was introduced.

Immobilized enzyme; Immobilization method; Magnetic carrier material; Application of enzyme immobilization

TQ426.97

A

1004-0935（2022）02-0251-04

2021-11-24

王東旭（1994-），男，吉林省白城市人，碩士研究生，研究方向：海洋化學(xué)。

孔亮（1970-），男，教授，博士，研究方向：分析化學(xué)。