馬德彪，張小舟，韓常雨，劉洋，劉欣

AuNCs@BSA/抗生素的制備及性能研究

馬德彪，張小舟，韓常雨，劉洋，劉欣

（齊齊哈爾大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

研究制備了一種微波輔助制備牛血清白蛋白包封熒光金納米團(tuán)簇(AuNCs@BSA)。通過熒光光譜，透射電子顯微鏡等對(duì)其最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了探究。分別改變其反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間，測(cè)試其粒徑及熒光強(qiáng)度的變化，以此來探究出最佳反應(yīng)條件。蛋白質(zhì)可以作為保護(hù)劑用于金納米簇合成。這些生物大分子本身具有優(yōu)良的生物相容性，與抗生素相結(jié)合，對(duì)部分抗生素具有藥效增強(qiáng)的作用，并且對(duì)AuNCs@BSA的熒光性能沒有大的影響，又提供了藥物熒光示蹤的可能。

AuNCs@BSA； 青霉素； 阿莫西林； 大腸桿菌； 金黃色葡萄球菌

金納米材料是最早出現(xiàn)的納米材料，具有制備方便、生物相容性好、易于進(jìn)行表面修飾和性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)分析和成像中有廣泛應(yīng)用。金納米簇(AuNCs)是近年來出現(xiàn)的一種新型發(fā)光材料，其性質(zhì)類似于分子，生物相容性好且具有較強(qiáng)熒光，將具有廣闊的應(yīng)用前景。熒光金納米團(tuán)簇(AuNCs)由幾個(gè)到幾十個(gè)金原子組成。由于它們具有類似分子的特性，因此被認(rèn)為是具有多種生物應(yīng)用價(jià)值的材料[1]。金納米簇的合成主要有兩種策略：自下到上和自上到下。第一種自下到上的策略是把金離子還原成金原子再通過成核作用形成金納米簇，化學(xué)還原法、生物還原法、光致還原法、電化學(xué)還原法和光致還原法屬于這一類。另一種自上到下的策略是把較大的金納米粒子或金納米簇蝕刻以產(chǎn)生超小型的金納米簇，例如化學(xué)蝕刻法。這些合成方法中最常用的還是化學(xué)還原法、光致還原法和化學(xué)蝕刻法三種。除此以外，金屬納米簇的合成方法還有微波合成法、電致合成法、電化學(xué)法、微乳法、相轉(zhuǎn)移法和低溫氣相沉淀法等[2-5]。

2009年，Xie等首次展示了一種制備熒光牛血清白蛋白(BSA)保護(hù)AuNCs (BSA-AuNCs)的簡(jiǎn)單方法[6-7]。這些AuNCs含有25個(gè)金原子，它們呈現(xiàn)出紅色發(fā)射。但它們需要較長(zhǎng)的制備時(shí)間，且pH值為8.0。最近，又有一種通過蝕刻和鈍化合成烷硫醇保護(hù)的AuNCs@BSA的方法被開發(fā)出來。所使用的烷硫醇的性質(zhì)以及金屬-硫醇相互作用是決定這些AuNCs@BSA結(jié)構(gòu)和電子性質(zhì)的關(guān)鍵因素，因?yàn)樗鼈儗?dǎo)致AuNCs@BSA中不同程度的熒光增強(qiáng)。上述方法可用于制備從藍(lán)色到紅外的離散高質(zhì)量熒光發(fā)射的AuNCs@BSA，但AuNCs@BSA仍需要較長(zhǎng)的蝕刻時(shí)間[8-10]。2017年首次報(bào)導(dǎo)出一種利用微波加熱技術(shù)開發(fā)了一種更高效的微波加熱系統(tǒng)AuNCs@BSA的制備方法。微波加熱不僅將反應(yīng)時(shí)間從幾十小時(shí)減少到幾分鐘，而且還抑制了副反應(yīng)，從而提高了特定合成方案的收率和重現(xiàn)性[11-14]。此外，由于小型AuNCs@BSA的合成對(duì)反應(yīng)條件高度敏感，所以鎢輔助的方法可以對(duì)AuNCs@BSA的生長(zhǎng)提供更大的控制，從而提高其光學(xué)性能。并且，用這種方法得到的AuNCs@BSA仍然呈現(xiàn)紅色發(fā)射。感染性疾病一直嚴(yán)重威脅著人類健康的，對(duì)細(xì)菌性傳染病的早期診斷來說，細(xì)菌病原體準(zhǔn)確鑒別是關(guān)鍵，然而，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如細(xì)胞培養(yǎng)、生化檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)和遺傳學(xué)分析都是耗時(shí)耗力的，對(duì)于危重病人來說可能會(huì)錯(cuò)過最佳治療機(jī)會(huì)。熒光金納米簇已經(jīng)開始被應(yīng)用于細(xì)菌感染診斷和生物成像。具有良好水溶性和高熒光量子產(chǎn)率的以甘露糖為保護(hù)劑的金納米簇可以被用于檢測(cè)大腸桿菌，其利用表面上的甘露糖殘基與大腸桿菌細(xì)胞上的甘露糖受體相互作用而結(jié)合在大腸桿菌細(xì)胞上。Chan和Chen報(bào)道了一種基于人血清白蛋白為保護(hù)劑的熒光金納米簇HSA- AuNCs的檢測(cè)細(xì)菌的方法，HSA-AuNCs可以特異性地與金黃色葡萄球菌結(jié)合[15]。

本研究探索了制備AuNCs@BSA最佳反應(yīng)條件。結(jié)合AuNCs@BSA抑菌的特性，并與抗生素相結(jié)合，以此來測(cè)試是否可以提高部分抗生素藥效，有效地抑制病菌的生長(zhǎng)，并且測(cè)試了AuNCs@BSA的熒光特性，結(jié)果表明在與抗生素結(jié)合后對(duì)其熒光性能沒有大的影響，又提供了藥物熒光示蹤的可能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

四氯金酸（北京伊諾凱科技有限公司），牛血清白蛋白（北京伊諾凱科技有限公司），硫酸奎寧（北京伊諾凱科技有限公司）、核黃素-5?-磷酸鹽（寧波貝伽爾新材料有限公司）、氫氧化鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），去離子水。

1.2 AuNCs@BSA的制備

2.5 mL的50 mg·mL-1BSA溶液加入2.5 mL 10 mM的HAuCl4溶液，在室溫下攪拌。然后滴加0.25 mL 1.0 M NaOH溶液。溶液混合物在300 W下加熱至80 ℃ 4 min。自然冷卻至室溫，離心除去大顆粒，放入透析袋，每隔6 h換1次水，提純48 h后凍干，4 ℃保存。

1.3 大腸桿菌/金黃色葡萄球菌的制備

將大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng) 12 h。隨后10 000 g 離心5 min，棄去上清液，菌泥用PBS重懸并稀釋，得到適宜濃度的大腸桿菌菌液。將保護(hù)劑，加入大腸桿菌菌液后，將保護(hù)劑分裝至棕色西林瓶中。液體LB培養(yǎng)基，稱取10 g胰蛋白胨，5 g酵母粉，10 g氯化鈉，121℃，滅菌30 min。將大腸桿菌接種到冷卻后的LB后放置搖床中，37 ℃，220 r·min-1, 培養(yǎng)12 h。

將金黃色葡萄球菌接種到TSA+YE(0.6%酵母浸粉的胰蛋白胨大豆瓊脂)上，在37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)挑取單菌落至TSB+ YE (0.6%酵母浸粉的胰蛋白胨大豆肉湯)中，在37 ℃，150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)12 h至穩(wěn)定前期，放置4 ℃冰箱中備用。

0.2 g的抗生素溶于5 mL去離子水，加入0.1 mL AuNCs@BSA, 混合完全后滴加到大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中，24 h后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同比例下的AuNCs@BSA熒光對(duì)比圖

由表1可知，本研究設(shè)計(jì)了四種物料比，分別改變HAuCl4，BSA，NaOH的量，比例分別為1∶1∶0.25，1∶1∶0.5，2∶1∶0.25，1∶2∶0.25四種物料比。并直觀的在365 nm紫外燈下觀察熒光的強(qiáng)弱。

表1 制備AuNCs@BSA的原料配比

圖1 不同配比下AuNCs@BSA的高清圖及在紫外燈下的熒光對(duì)比圖

圖1可明顯看出，改變物料比，產(chǎn)物的顏色有明顯不同，在365 nm：紫外光下可明顯看出，深棕色的溶液熒光明顯。

圖2 AuNCs@BSA熒光光譜圖

圖2是使用熒光光譜儀測(cè)試的強(qiáng)度，分別將不同物料比的AuNCs@BSA取10 μL AuNCs@BSA溶于10 mL去離子水中，進(jìn)行熒光測(cè)試，在375 nm激發(fā)下，在550～650紅外光區(qū)達(dá)到最高值，在物料比為1∶1∶0.25時(shí)，AuNCs@BSA熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。

圖3 AuNCs@BSA與消炎藥結(jié)合原理圖

采取一種簡(jiǎn)單的辦法，將AuNCs@BSA與消炎藥結(jié)合，充分混合后，滴到含有致病菌的培養(yǎng)基上，24 h后，觀察抑菌圈的大小，可以直觀地觀察到AuNCs@BSA是否對(duì)抗生素有無增強(qiáng)作用，本研究選用了兩種常見的致病菌，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌用來做對(duì)照試驗(yàn)。

圖4（a）選用的菌種為大腸桿菌，由圖可明顯看出，AuNCs@BSA與青霉素結(jié)合雖并未增強(qiáng)對(duì)大腸桿菌的抑制作用，但是阿莫西林與AuNCs@BSA的結(jié)合對(duì)大腸桿菌的抑制作用有明顯增強(qiáng)。圖4（b）選用的菌種為金黃色葡萄球菌，由圖可明顯看出，AuNCs@BSA與兩種消炎藥的結(jié)合均大幅提高了對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。

圖4 AuNCs@BSA/青霉素和AuNCs@BSA/阿莫西林抑菌實(shí)驗(yàn)效果圖

圖5 （a）AuNCs@BSA/青霉素結(jié)合后8 h內(nèi)的熒光強(qiáng)度變化圖;（b）AuNCs@BSA/阿莫西林結(jié)合后8 h內(nèi)的熒光強(qiáng)度變化圖

圖5為AuNCs@BSA/青霉素/阿莫西林結(jié)合后8 h內(nèi)的熒光光譜圖，分別混合后，2 h，4 h，6 h，8 h測(cè)試其熒光強(qiáng)度，AuNCs與青霉素相結(jié)合后8 h內(nèi)熒光強(qiáng)度沒有太大變化，可以依舊保持AuNCs@BSA的熒光特性，雖然在與阿莫西林的幾個(gè)小時(shí)后熒光強(qiáng)度發(fā)生了微量減弱，但是依舊保持著很高的熒光強(qiáng)度，所以為藥物示蹤提供了可能。

3 結(jié) 論

本研究探索了制備AuNCs@BSA最佳反應(yīng)條件。并與抗生素相結(jié)合，以此來提高部分抗生素藥效，可以有效地抑制病菌的生長(zhǎng)，發(fā)展快速簡(jiǎn)便的方法，對(duì)解決基層臨床和野外等特殊場(chǎng)合的細(xì)菌問題有重要意義。選擇合適的指示物用于標(biāo)記細(xì)菌細(xì)胞是大多數(shù)細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)，很多具有鮮艷的顏色的染料和能發(fā)出特定熒光的熒光物質(zhì)陸續(xù)被選作細(xì)菌細(xì)胞標(biāo)記物。金納米材料具有廉價(jià)易制備易保存的優(yōu)點(diǎn)，其中金納米粒子溶液具有鮮艷的顏色，金納米簇能在被激發(fā)后發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，分別可以用于熒光標(biāo)記。并且測(cè)試了AuNCs@BSA的熒光特性，結(jié)果表明在與抗生素結(jié)合后對(duì)其熒光性能沒有大的影響，又提供了藥物熒光示蹤的可能。

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Study on the Preparation and Properties of AuNCs@BSA/Antibiotics

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（College of Materials Science and Engineering, Qiqihar University, Qiqihar Heilongjiang 161006, China)

Bovine serum albumin encapsulated fluorescent gold nanoclusters (AuNCs@BSA) wwere prepared by microwave-assisted process. The optimum experimental conditions were investigated by fluorescence spectrum and transmission electron microscope. Through changing reaction temperature and reaction time,the changes of particle size and fluorescence intensity were tested to explore the best reaction conditions. Proteins can be used as protective agents for the synthesis of gold nanoclusters. These biomacromolecules themselves have excellent biocompatibility and can be combined with antibiotics to enhance the efficacy of some antibiotics, and have no significant impact on the fluorescence properties of AuNCs@BSA, and provide the possibility of drug fluorescence tracing.

AuNCs@BSA; Penicillin; Amoxicillin; Escherichia coli; Staphylococcus aureus

TQ050.4+1

A

1004-0935（2022）02-0190-04

2021-10-28

馬德彪（1997-），男，黑龍江省大慶市人，齊齊哈爾大學(xué)碩士研究生在讀，研究方向：熒光納米粒子的制備及性能研究。

張小舟（1974-），女，教授，研究方向：生物基聚碳酸酯及其復(fù)合材料的研究。