許麗娟，吳民熙*，雷建華，王 震，劉 標，喻孟元，杜東霞

（1.湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009；2.湖南省嘉禾縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南 嘉禾 424500）

0 引言

隨著我國城鎮(zhèn)化進程的加快，城市生活垃圾的產(chǎn)生量也在不斷增加。據(jù)統(tǒng)計，2019年我國城市生活垃圾產(chǎn)生量達到了3.43億t［1］。垃圾在堆放過程中不斷被腐化分解，不僅散發(fā)出氨氣、硫化氫、甲硫醇等惡臭氣體［2］，而且垃圾中還存有大量對人和動物有害的細菌、真菌、病毒和寄生蟲,這些有害代謝產(chǎn)物和有害微生物會隨著垃圾的收集、清理、轉(zhuǎn)運接收等作業(yè)活動而擴散、傳播到周圍的大氣環(huán)境中，形成微生物氣溶膠或有毒氣體，再通過呼吸道、消化道和皮膚等通道侵入人類的肌體，嚴重危害作業(yè)人員和周圍居民的身體健康［3］。微生物氣溶膠作為大氣氣溶膠的重要組成部分，不僅會影響公眾的身體健康，還可以作為云凝結(jié)核(cloud condensation，CCN)［4］和冰核(ice nuclei，IN)［5］對當?shù)睾腿蚍秶鷥?nèi)的生態(tài)和氣候產(chǎn)生重大影響，因此，研究微生物氣溶膠對了解人類的健康狀況和氣候變化是很有必要的［6-7］，當今微生物氣溶膠也成為了科學家們研究的焦點。

分布在城市角落里的垃圾中轉(zhuǎn)站是生活垃圾堆放與轉(zhuǎn)運的主要場所。但是迄今利用高通量測序技術(shù)分析垃圾中轉(zhuǎn)站空氣中可培養(yǎng)細菌群落基因組DNA、群落結(jié)構(gòu)、基因多樣性等的研究較少。鑒于此，筆者采用第3代基因組測序技術(shù)分析了垃圾中轉(zhuǎn)站及周圍空氣中細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，探討了環(huán)境溫度、相對濕度等氣象因子對細菌氣溶膠的影響，同時對垃圾站內(nèi)空氣中的優(yōu)勢細菌菌株進行了分離和鑒定，以期為評價垃圾中轉(zhuǎn)站空氣質(zhì)量提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為城市生活垃圾中轉(zhuǎn)站微生物氣溶膠的綜合治理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣地點的選取及取樣點的設(shè)置

選取小型壓縮垃圾轉(zhuǎn)運站作為研究對象，轉(zhuǎn)運站面積為20 m2左右，處于半封閉狀態(tài)，其配置1臺臥式垃圾壓縮機，額定裝載垃圾量為10 t；垃圾清運頻率均為1次/d，垃圾收運量約為10 t/d。在垃圾站的北面是公路，距離垃圾站20 m；在垃圾站的南面是居民區(qū)，距離垃圾站50 m。圖1中的數(shù)字1、2、3為取樣地點代號，分別為公路邊、垃圾站、居民區(qū)。

圖1 采樣點示意圖

1.2 空氣微生物的采集和培養(yǎng)

樣品采集在春季和夏季（4—8月）這5個月進行，每個月取樣1 d，取樣時間為9：00～11：00，每個采樣點每次采集2組平行樣品。2個Andersen-6級撞擊式空氣微生物采樣器（由中國金壇某公司生產(chǎn)）同時工作，收集垃圾中轉(zhuǎn)站及附近區(qū)域空氣中的生物氣溶膠顆粒。該采樣器共有6級，第1級直徑＞7.0 μm，第2級直徑4.7～7.0 μm，第3級直徑3.3～4.7 μm，第4級直徑2.1～3.3 μm，第5級直徑1.1～2.1 μm，第6級直徑0.65～1.10 μm。在每級篩板下面放置1個直徑為90 mm、帶有LB培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)皿。抽吸泵將流量為28.3 L/min的氣流送至各級，空氣流速逐級增大，從而把空氣中的帶菌粒子按粒徑的大小分別捕獲到各級培養(yǎng)皿上。空氣采樣器距離地面1.5 m（約為人體呼吸的高度）。每次取樣3 min，當吸入的空氣量達到所需值時，逐級取出培養(yǎng)皿，將其迅速密封后放入樣品箱，帶回實驗室，置于（37±2）℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在采集樣品的同時，使用溫濕度計監(jiān)測并記錄采樣時的空氣溫度和相對濕度。

1.3 樣品的預(yù)處理

將樣品帶回實驗室后立即進行預(yù)處理。將平皿中所有的菌落用水反復(fù)清洗后收集于無菌處理的EP管中，采用Eppendorf離心機以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，收集菌體。將收集的菌體送至菲沙基因信息有限公司在PacBio Sequel平臺上進行測序。挑取平皿中的優(yōu)勢單菌落于LB培養(yǎng)基中，進行分離純化，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過高通量測序得到的原始數(shù)據(jù)為Polymerase Reads，存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)。為了使分析結(jié)果更加準確，利用SMRT Link v7.0軟件對原始測序數(shù)據(jù)進行了數(shù)據(jù)預(yù)處理和過濾，從而得到了高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，并計算了空氣中微生物群落的豐度［8］。

1.4.1 OTU(operational taxonomic units)聚類分析用Qiime軟件對垃圾中轉(zhuǎn)站不同月份空氣中的細菌群落進行OTU分析，通常將相似度≥97%的聚為一類，進行生物信息學統(tǒng)計分析。

1.4.2 Alpha分析主要分析反映微生物群落物種豐度的Chao 1指數(shù)，以及反映微生物多樣性的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)；此外還有Coverage指數(shù)，它反映測序結(jié)果是否代表了樣本中微生物的真實情況，其值越高，測序結(jié)果越具有代表性。Observed species是指觀測到的OTU數(shù)目。

1.4.3 多樣性分析利用多樣性指數(shù)統(tǒng)計表，分析樣品中細菌群落的豐度和多樣性；再對OTU數(shù)據(jù)進行分析，并利用柱狀圖對樣品中的細菌進行統(tǒng)計分析，最終確定優(yōu)勢菌屬。

1.4.4 冗余(RDA)分析該分析方法將對應(yīng)分析與多元回歸分析相結(jié)合，所得結(jié)果主要用來反映菌群與環(huán)境因子之間的關(guān)系，樣本與環(huán)境因子間的夾角越小，說明菌群受環(huán)境因子的影響越大。

1.5 細菌的鑒定方法

將平皿中的優(yōu)勢單菌落用接種環(huán)挑取少許至LB培養(yǎng)基中，于35 ℃下培養(yǎng)24～48 h，然后選取單菌落反復(fù)分離劃線，直至菌株完全純化。觀察待測菌落的特征，包括菌落的顏色、形狀等；通過革蘭氏反應(yīng)、葡萄糖的氧化發(fā)酵測定、過氧化氫酶等生理生化試驗，確定細菌種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 垃圾中轉(zhuǎn)站細菌微生物組成及群落多樣性分析

從樣品中隨機抽取一定測序數(shù)量的個體，統(tǒng)計它們的OTUs數(shù)目，以隨機抽取的測序數(shù)據(jù)量為橫坐標，以對應(yīng)的OTUs即物種數(shù)為縱坐標繪制稀釋曲線（圖2），圖2中不同的樣品使用不同圖例的曲線表示。當曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量是合理的，增加測序的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的物種(OTUs)。因此，稀釋曲線可以反映不同樣品的測序深度情況。

圖2 不同樣品的稀釋曲線

通過高通量測序數(shù)據(jù)對測序結(jié)果進行比對，并進行α-多樣性分析，得出垃圾中轉(zhuǎn)站不同空氣樣品的細菌多樣性指數(shù)。由表1可知：所有樣品的覆蓋度均在0.99以上，表明測序數(shù)據(jù)有效，可以作為分析的依據(jù)；樣品D1、D2和D3（7月份的所有取樣點）的Observed species指數(shù)較高，表明這3個點實際觀測到的OTU數(shù)目要高于其他取樣點的；樣品D1、D2和D3的Shannon指數(shù)要高于其他樣品的，且它們的Simpson指數(shù)也較高，表明7月份的細菌多樣性要明顯高于其他4個月的；就7月份的3個取樣點來說，樣品D2的Shannon指數(shù)高于D1和D3的，說明7月份垃圾站內(nèi)的細菌多樣性要高于附近馬路邊取樣點及居民區(qū)取樣點的，這合情合理；就Chao 1指數(shù)而言，7月份的3個取樣點居前3位，其次是4月份（A2）和5月份（B3），表明不同月份這幾個位置細菌物種的豐富度較高。

表1 不同樣品的細菌多樣性指數(shù)

根據(jù)物種注釋結(jié)果，對OTU進行物種分類，選取每個樣品在門水平(Phylum)上最大豐度排名前6位的物種，繪制了15個樣品細菌物種組成的柱形圖。從圖3可以看出：所有樣品在門水平上以變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度最高，相對豐度為12.9%～78.0%；擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度為0.3%～66.1%；厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度為7.2%～61.6%；放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度為0.68%～39.70%；其余物種的相對豐度均小于0.74%。

圖3 不同樣品在門水平上的物種相對豐度

選取每個樣品在屬(Genus)水平上的物種繪制了柱形圖，結(jié)果（圖4）顯示：在15個樣品中，除了樣品C3、E1和E2外，其他樣品中都發(fā)現(xiàn)有不動桿菌屬(Acinetobatcer)，而且在這些樣品中還檢測到了芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、泛菌屬(Pantoea)等機會性致病菌或潛在致病菌，這與李榮宗等［9］的研究結(jié)果“在垃圾收集點、吊裝點、壓縮站和垃圾焚燒作業(yè)點均可檢測出大腸菌群、沙門菌、變形桿菌等致病菌”是一致的。含有致病菌的微生物氣溶膠會導(dǎo)致人類感染呼吸系統(tǒng)疾病、腸道不適和皮膚過敏等［10］。于文凱等［11］對肺囊性纖維化患者的痰液進行細菌體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)主要致病菌有銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)。史廷明等［12］的研究表明：一線作業(yè)工人的慢性咽炎患病率為21.1%，肺功能輕度下降比例達11.5%，遠高于行政管理等對照人員的。垃圾填埋場附近人群的癌癥發(fā)病率比非暴露地區(qū)明顯升高，且在垃圾填埋場周圍患先天缺陷性疾病、脊柱裂的嬰兒明顯增多［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，在垃圾中轉(zhuǎn)站檢測到的不動桿菌屬(Acinetobacter)和芽孢桿菌屬(Bacillus)在馬路邊及居民區(qū)也檢測到，這可能是因為垃圾中轉(zhuǎn)站內(nèi)的微生物氣溶膠借助空氣的流動擴散到了周圍環(huán)境中。

圖4 不同樣品在屬水平上的物種相對豐度

2.2 垃圾中轉(zhuǎn)站氣象因子對細菌群落組成與多樣性的影響

通過冗余分析研究了氣象因子溫度、相對濕度對細菌氣溶膠逸散的影響。結(jié)果顯示，垃圾中轉(zhuǎn)站空氣中細菌多樣性和豐富度與環(huán)境溫度和相對濕度都相關(guān)。不同月份垃圾中轉(zhuǎn)站的環(huán)境溫度和相對濕度也不一樣（表2）。7月份垃圾中轉(zhuǎn)站內(nèi)空氣平均溫度為30.7 ℃，相對濕度平均為71.3%，明顯高于其他月份的，且該月細菌群落多樣性及豐度也是最高的，這可能是因為在高溫、高濕的環(huán)境中，微生物利用垃圾中的有機物大量生長繁殖，從而導(dǎo)致更多的微生物逸散到周圍空氣中。這與馬嘉偉等［14］的研究結(jié)果一致。

表2 垃圾中轉(zhuǎn)站4～8月的氣象因子平均值

從圖5可以看出：與溫度關(guān)系較大的是B（5月）、C（6月）和D（7月）的細菌群落；與相對濕度關(guān)系較大的是A（4月）、C（6月）和E（8月）的細菌群落。雖然有些月份的平均溫度和相對濕度條件相近，如5月份與6月份，但是這些月份的細菌群落結(jié)構(gòu)和豐度存在差異，這可能與垃圾中物質(zhì)的組成及有機質(zhì)含量不同有關(guān)。

圖5 氣象因子和細菌豐度的RDA分析結(jié)果

2.3 優(yōu)勢細菌的初步鑒定

為了進一步探明垃圾中轉(zhuǎn)站空氣中有哪些機會性致病菌或潛在致病菌，以便更好地預(yù)防和治理，對空氣中的優(yōu)勢細菌進行了初步的鑒定。

2.3.1 菌落及菌體形態(tài)通過對垃圾中轉(zhuǎn)站的多次取樣，發(fā)現(xiàn)在LB培養(yǎng)基上有4個菌株為可培養(yǎng)的優(yōu)勢微生物，對這4個菌株的菌落及菌體形態(tài)進行了觀察，結(jié)果（圖6）顯示：H-1菌株的菌落顏色鮮紅、表面光滑、圓形、中間凸起、濕潤、易挑起，其菌體為細橢圓形，兩兩一起，無芽孢；F-1菌株的菌落呈亮黃色、圓形、中間凸起、濕潤、易挑起，其菌體為細小圓形，無芽孢；F-2菌株的菌落呈金黃色、圓形、濕潤、中間凸起、易挑起，其菌體細桿狀；B-1菌株的菌落呈灰白色、圓形、中間凸起、易挑起，其菌體細桿狀，有橢圓形芽孢。

圖6 4個菌株的菌落形態(tài)

2.3.2 菌種的理化特性在觀察菌株形態(tài)的基礎(chǔ)上，進一步對上述4個菌株進行了理化特性試驗，結(jié)果（表3）表明：除F-2的革蘭氏染色為陰性外，其他3個菌株均為陽性；菌株H-1的過氧化氫酶、VP試驗、MR試驗及H2S試驗均為陽性，其他試驗均為陰性；菌株F-1除葡萄糖產(chǎn)氣、吲哚試驗和檸檬酸鹽的利用試驗為陰性外，其他試驗均為陽性；菌株F-2的過氧化氫酶、葡萄糖產(chǎn)氣、MR試驗和吲哚試驗均為陽性，其他幾項試驗均為陰性；菌株B-1除葡萄糖不產(chǎn)氣外，其他試驗均為陽性。結(jié)合菌株的形態(tài)和生理生化試驗結(jié)果，初步判斷菌株H-1屬于微球菌屬，F(xiàn)-1屬于葡萄球菌屬，F(xiàn)-2屬于埃希氏菌屬，B-1屬于芽孢桿菌屬。

表3 4個菌株的理化特性試驗結(jié)果

3 小結(jié)

本研究結(jié)果表明：垃圾中轉(zhuǎn)站內(nèi)空氣細菌無論是多樣性還是群落豐富度，均在7月份最高，其次是4月份和5月份；垃圾中轉(zhuǎn)站內(nèi)細菌相對豐度最高的門是變形菌門(Proteobacteria)，其次是擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)；垃圾中轉(zhuǎn)站內(nèi)存在潛在或機會性致病菌屬，如不動桿菌屬(Acinetobatcer)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)；細菌氣溶膠的多樣性和豐富度除受垃圾組分影響外，還受到環(huán)境溫度、相對濕度的影響。