白 敬，吉馨予，趙國群

（河北科技大學(xué)，河北 石家莊 050018）

水稻是世界上重要的糧食作物之一，為全球約半數(shù)以上的人口提供主糧［1］。然而水稻生產(chǎn)面臨著諸多病蟲害的威脅，其中由稻瘟病菌引發(fā)的稻瘟病被列為三大病害之首，每年造成水稻產(chǎn)量損失10%～30%，嚴(yán)重影響了水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)［2-3］。

目前，我國對稻瘟病的控制主要采用化學(xué)防治和抗性品種選育等方法。但化學(xué)農(nóng)藥的長期使用極易引起藥物殘留、環(huán)境污染和病菌耐藥性增強等問題，不利于我國農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展［4］。盡管抗性品種的種植能夠在一定程度上預(yù)防稻瘟病的發(fā)生，但現(xiàn)有的抗病品種通常產(chǎn)量較低、品質(zhì)較差且選育進程較慢，限制了其推廣應(yīng)用。利用拮抗微生物及其代謝產(chǎn)物對稻瘟病進行控制的生物防治方法，因其具有綠色、安全、可持續(xù)等優(yōu)點，現(xiàn)已逐漸成為研究熱點［5-6］。

芽孢桿菌(Bacillus)作為一類重要的生防資源，已被廣泛用于多種植物病害的生物防治。該類菌除了具有良好的環(huán)境相容性、促進農(nóng)作物生長和誘導(dǎo)抗病性等優(yōu)點外，還能夠產(chǎn)生多種脂肽類抗生素、細(xì)胞壁降解酶和抑菌蛋白等，干擾和抑制病原菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的合成，具有廣譜的抗菌活性［7-8］。目前已發(fā)現(xiàn)多種芽孢桿菌對稻瘟病菌表現(xiàn)出良好的拮抗作用，如解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)［9-11］、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)［12］、貝萊斯芽孢桿菌(B. velezensis)［13］、堅強芽孢桿菌(B. firmus)［14］等。沙月霞等［13］從水稻葉片中分離得到1株對稻瘟病菌有抑制作用的植物內(nèi)生菌貝萊斯芽孢桿菌E69，其對分生孢子萌發(fā)、附著胞形成和菌絲生長的抑制率均達到84%以上。韓雨桐等［12］從水稻根系土壤中篩選獲得的枯草芽孢桿菌Sc2對稻瘟病菌的抑制率達73.44%，且當(dāng)其與三環(huán)唑以1∶2的比例復(fù)配使用時，對稻瘟病的防治效果可達90.33%。谷春艷等［9-11］均證實了解淀粉芽孢桿菌具有抑制稻瘟病菌生長的活性，其發(fā)酵液可破壞稻瘟病菌的細(xì)胞膜，造成該病菌的菌絲變形和斷裂。Suryadi等［14］發(fā)現(xiàn)堅強芽孢桿菌能夠有效地抑制稻瘟病菌菌絲的生長，抑制率達73%。因此，利用芽孢桿菌防治稻瘟病菌是一種具有較大應(yīng)用潛力的生物防治手段，篩選高效的拮抗菌株是對稻瘟病菌進行生物防治的關(guān)鍵。

本實驗以稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)菌株Guy11為靶標(biāo)，從實驗室已保存的細(xì)菌中篩選對其具有良好拮抗作用的菌株。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化性質(zhì)測定，以及16S rDNA、gyrA與gyrB基因序列分析，對該菌株進行了分類學(xué)鑒定，并對其抑菌物質(zhì)進行了分析，以期為稻瘟病菌生防菌劑的開發(fā)提供新的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

病原菌：稻瘟病菌菌株Guy11，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所惠贈。

基本培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、番茄燕麥培養(yǎng)基。

幾丁質(zhì)酶檢測培養(yǎng)基：膠體幾丁質(zhì)（1.00%）、K2HPO4（0.03%）、KH2PO4（0.03%）、NaCl（0.40%）、MgSO4·7H2O（0.05%）、酵母浸粉（0.15%）、瓊脂（2.00%）。

β-葡聚糖酶檢測培養(yǎng)基：昆布多糖（1.00%）、K2HPO4（0.065%）、KH2PO4（0.25%）、（NH4）2SO4（0.05%）、NaCl（0.25%）、MgSO4·7H2O（0.012%）、酵母浸粉（0.15%）、瓊脂（2.00%）。

蛋白酶檢測培養(yǎng)基：牛肉膏（0.50%）、蛋白胨（1.00%）、氯化鈉（0.50%）、脫脂奶粉（2.00%）、瓊脂（2.00%）。

1.2 拮抗菌株的篩選

利用平板對峙法篩選對稻瘟病菌具有拮抗作用的菌株。取5 mm稻瘟病菌菌塊，將其接種于新鮮配制的PDA平板中心，在28 ℃下培養(yǎng)3 d。在距離稻瘟病菌2 cm處，利用無菌打孔器對稱打孔，在每個孔中滴加 100 μL待篩選的菌液，在28 ℃下培養(yǎng)7～10 d。以LB空白培養(yǎng)基作為對照；每個處理重復(fù)3次。待菌落長滿平板時測量稻瘟病菌的菌落直徑，并根據(jù)以下公式計算抑菌率：抑菌率（%）=［（對照組病原菌的菌落直徑-處理組病原菌的菌落直徑）/對照組病原菌的菌落直徑］×100%。

1.3 拮抗菌株的分類學(xué)鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察挑取拮抗作用較好的菌株于LB平板上劃線，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察單菌落的形態(tài)、大小、顏色、形狀、褶皺程度等特征，并進行革蘭氏染色實驗。

1.3.2 生理生化性質(zhì)的測定依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，對待測菌株進行明膠液化、淀粉水解、厭氧生長、V-P反應(yīng)、檸檬酸鹽利用、丙酸鹽利用、硝酸鹽還原和不同碳源（D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇）生長等實驗。各項實驗均重復(fù)3次。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定基于16S rDNA、gyrA和gyrB基因序列，對拮抗菌株進行分子生物學(xué)鑒定。擴增引物參照李生樟等［15］的方法進行設(shè)計，并由金斯瑞生物科技股份有限公司合成，引物序列見表1。利用NCBI中的Blast模塊分別對16S rDNA、gyrA和gyrB基因擴增序列進行Blast比對分析，并通過Mega X軟件中的Neighbor-Joining（鄰接法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 對拮抗菌株進行分子生物學(xué)鑒定所用的擴增引物

1.4 拮抗菌株的生長特性

1.4.1 生長曲線的測定挑取單克隆菌株于LB培養(yǎng)基中，在37 ℃下過夜培養(yǎng)。次日以2%的接種量將菌株轉(zhuǎn)接于100 mL LB培養(yǎng)基中，在37 ℃下以200 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣1次，測定菌液的OD600值。設(shè)置3組平行實驗。

1.4.2 菌株耐鹽能力、對pH值耐受性的測定耐鹽能力：將待測菌株的培養(yǎng)液按2%的接種量分別接種至含不同濃度（0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、7.0%、10.0%、15.0%）NaCl的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)液的渾濁情況，并測定樣品的OD600值，判斷菌體的生長情況。設(shè)置3組平行實驗。

對pH值的耐受性：將待測菌株的培養(yǎng)液按2%的接種量分別接種至具有不同pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0）的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)液的渾濁情況，并測定樣品的OD600值，判斷菌體的生長情況。設(shè)置3組平行實驗。

1.4.3 菌株與化學(xué)殺菌劑的生物相容性測定將40%稻瘟靈和75%三環(huán)唑粉針劑分別配制成一系列濃度的含藥LB平板，其中40%稻瘟靈含量分別為0.01、0.05、0.10、0.50、1.50、2.00 mL/L；75%三環(huán)唑粉針劑含量分別為50、100、200、300、400、500 mg/L。取10 μL拮抗菌的菌懸液，將其均勻涂布于平板表面，以加入等量無菌水為空白對照，在28 ℃恒溫下培養(yǎng)5 d，利用平板稀釋法測定菌體的生長情況并統(tǒng)計數(shù)量。每個處理設(shè)置 3組平行實驗。

1.5 拮抗菌株抑菌物質(zhì)的分析

1.5.1 抗生素合成相關(guān)基因的PCR檢測參考Joshi等［16-17］的方法，分別合成了表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)、豐原素(Fengycin)、溶桿菌素(Bacylisin)、桿菌霉素(Bacillomycin)、抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)和假定蛋白(YndJ)等合成相關(guān)基因的引物，詳見表2。以拮抗菌的基因組DNA為模板進行PCR檢測。PCR反應(yīng)體系：Taq Mix 10 μL、引物（10 μmol/L）各0.5 μL、模板DNA（60 ng/μL）1 μL，用ddH2O補足至20 μL。PCR的擴增條件按照說明書進行設(shè)置，其中基因的退火溫度為52 ℃。

表2 用于檢測拮抗菌株抗生素合成相關(guān)基因的引物

1.5.2 細(xì)胞壁降解酶編碼基因的PCR檢測基于CAZy和Uniprot數(shù)據(jù)庫，設(shè)計葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶編碼基因的擴增引物，并參考李界秋等［18］的方法合成枯草桿菌蛋白酶基因(qk)的擴增引物（表3）。PCR反應(yīng)體系和擴增條件與上述抗生素合成相關(guān)基因的檢測條件一致。

表3 用于檢測拮抗菌株中細(xì)胞壁降解酶編碼基因的引物

1.5.3 拮抗菌株胞外酶活性的檢測利用蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶特異性檢測平板，測定拮抗菌株的胞外酶活性。取10 μL拮抗菌發(fā)酵液，分別接種于上述3種特異性檢測平板上，在28 ℃下培養(yǎng)2 d，然后觀察菌落周圍是否有透明圈產(chǎn)生。對于幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶檢測平板，先用剛果紅溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%）覆蓋染色15 min，再用1 mol/L NaCl溶液處理15 min，最后觀察是否有透明圈形成。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選

以稻瘟病菌Guy11為靶標(biāo)，利用平板對峙法從26株細(xì)菌菌株中篩選獲得18株具有拮抗性能的菌株，其中抑菌率大于50%的菌株共有4株，以菌株HKD-6的抑菌效果最好（表4）。HKD-6能夠顯著抑制稻瘟病菌菌絲的生長（圖1）。

表4 供試細(xì)菌菌株對稻瘟病菌的抑制率

圖1 菌株HKD-6對稻瘟病菌的抑制效果

2.2 拮抗菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征將菌株HKD-6劃線于LB固體培養(yǎng)基表面，在37 ℃下培養(yǎng)24 h后，菌落呈現(xiàn)淺黃色且不透明形態(tài)，表面干燥，有褶皺分布，菌落邊緣不規(guī)則（圖2A）。通過革蘭氏染色實驗，菌株呈陽性（圖2B）。

圖2 菌株HKD-6的形態(tài)學(xué)特征

2.2.2 生理生化特征生理生化實驗結(jié)果（表5）表明：菌株HKD-6可以在厭氧條件下生長；能夠利用D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇作為碳源；能夠水解明膠和淀粉；其檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原反應(yīng)和V-P反應(yīng)均呈陽性，但不能利用丙酸鹽。據(jù)此初步將菌株HKD-6判定為芽孢桿菌。

表5 菌株HKD-6的生理生化實驗結(jié)果

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定利用細(xì)菌通用引物從菌株HKD-6基因組中擴增獲得了1500 bp左右的16S rDNA基因片段，測序后于NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對。該菌株與貝萊斯芽孢桿菌(B. velezensis)、萎縮芽孢桿菌(B. atrophaeus)和解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)的親緣關(guān)系最近，相似性均達到99.9%以上?；?6S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹（鄰接法）結(jié)果（圖3），將HKD-6判定為芽孢桿菌屬細(xì)菌。

圖3 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株HKD-6的系統(tǒng)發(fā)育樹

為了進一步分析菌株HKD-6的進化地位，對該菌株的gyrA和gyrB基因分別進行PCR擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其基因全長分別為966和1152 bp?；诨騡yrA和gyrB構(gòu)建的序列進化樹（鄰接法）結(jié)果均表明，菌株HKD-6與貝萊斯芽孢桿菌(B. velezensis)的親緣關(guān)系最近，且處于同一分支（圖4）。

圖4 基于gyrA（A）和gyrB（B）基因序列構(gòu)建的菌株HKD-6的系統(tǒng)發(fā)育樹

綜合系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果，并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果和生理生化特征實驗結(jié)果，將菌株HKD-6鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(B. velezensis)。

2.3 貝萊斯芽孢桿菌HKD-6的生長特性

2.3.1 HKD-6的生長曲線拮抗菌株HKD-6的生長變化趨勢如圖5所示：培養(yǎng)20 h后，HKD-6菌株結(jié)束對數(shù)生長期；培養(yǎng)20～28 h期間為穩(wěn)定生長期；培養(yǎng)28 h后進入衰退期。在培養(yǎng)時間為24 h時該菌株的生物量達到最大。

圖5 菌株HKD-6的生長曲線

2.3.2 HKD-6的耐鹽及耐pH值特性為了進一步分析菌株HKD-6對鹽濃度和pH值的耐受性，分別測定了其在0.5%～15.0% NaCl濃度、pH值為4～10的LB培養(yǎng)基中的生長狀況。從圖6可以看出：菌株HKD-6可耐受15% NaCl濃度的高鹽環(huán)境，其中在NaCl濃度為0.5%～7.0%的培養(yǎng)基上均能正常生長；同時該菌株在pH值為4～10的LB培養(yǎng)基中均可生長，其中在pH值為5～9的環(huán)境下生長良好，當(dāng)pH值為6時生長狀況最好。由此可知，菌株HKD-6對環(huán)境中的鹽度和pH值均表現(xiàn)出較強的耐受能力。

圖6 菌株HKD-6的耐鹽及耐pH值能力

2.3.3 HKD-6與化學(xué)殺菌劑的相容性為了分析貝萊斯芽孢桿菌HKD-6與防治稻瘟病的化學(xué)殺菌劑的相容性，分別測定了福仕一號（40%稻瘟靈）和75%三環(huán)唑2種化學(xué)殺菌劑對HKD-6菌落生長的影響。由表6可見：在40%稻瘟靈濃度為0.01～2.00 mL/L范圍內(nèi)，HKD-6菌株均能夠生長；當(dāng)40%稻瘟靈濃度為0.01～0.50 mL/L時，該菌株的生長正?；蚵缘陀趯φ战M；當(dāng)40%稻瘟靈濃度達到2.00 mL/L時，HKD-6菌株在培養(yǎng)2 d后的菌落數(shù)約為對照組的1/10，在培養(yǎng)5 d后其菌落數(shù)較之前有明顯增加，表明在該濃度下HKD-6菌株能夠繼續(xù)緩慢生長。

表6 化學(xué)殺菌劑對HKD-6菌株生長的影響

對于75%三環(huán)唑而言，當(dāng)其質(zhì)量濃度為50～ 500 mg/L時，拮抗菌HKD-6均能夠生長，其中在50～100 mg/L濃度下菌株生長基本正常；此后隨著濃度的增加，該菌株的菌落數(shù)逐漸下降，但在培養(yǎng)5 d后仍能保持原有的活菌數(shù)量。因此，HKD-6菌株與稻瘟靈、三環(huán)唑均具有較好的相容性。

2.4 貝萊斯芽孢桿菌HKD-6的抑菌物質(zhì)

2.4.1 抗生素合成相關(guān)基因的檢測以HKD-6菌株的基因組DNA為模板，分別對已報道的芽孢桿菌中7種抗生素合成相關(guān)基因進行PCR擴增，其中包括表面活性素Surfactin的合成相關(guān)基因sfrAB、伊枯草菌素Iturin的合成相關(guān)基因ituC、豐原素Fengycin的合成相關(guān)基因fenD、溶桿菌素Bacylisin的合成相關(guān)基因bacA、桿菌霉素Bacillomycin的合成相關(guān)基因bamC、抗霉枯草菌素的合成相關(guān)基因mycB以及抑菌相關(guān)假定蛋白基因yndJ。PCR擴增結(jié)果如圖7所示，從拮抗菌株HKD-6的基因組中可以擴增出上述7種目的基因，表明該菌株具有產(chǎn)生這7種脂肽類抗生素的潛力。

圖7 HKD-6抗生素合成相關(guān)基因的PCR凝膠電泳結(jié)果

2.4.2 細(xì)胞壁降解酶編碼基因的檢測使用設(shè)計的5對引物（表3）對真菌細(xì)胞壁相關(guān)降解酶編碼基因進行PCR擴增，包括1種葡聚糖酶、3種幾丁質(zhì)酶和1種蛋白酶編碼基因。PCR擴增結(jié)果如圖8所示，除了沒有擴增出幾丁質(zhì)酶中g(shù)h18-1和蛋白酶qk基因的特異性條帶外，其余3對基因(bglu1、ydhD、YaaH)的引物均可以擴增出單一明亮條帶，且條帶的大小與理論大小一致。經(jīng)測序，證實這3對引物的擴增產(chǎn)物均與對應(yīng)的目標(biāo)基因一致，說明HKD-6菌株具有合成葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶的潛力。

圖8 HKD-6中細(xì)胞壁降解酶編碼基因的PCR結(jié)果

2.4.3 胞外酶活性的檢測菌株HKD-6胞外酶活性的檢測結(jié)果（圖9）顯示：在蛋白酶、葡聚糖酶檢測平板上均可產(chǎn)生明顯的透明圈，表明該菌株可以分泌蛋白酶和葡聚糖酶；但在幾丁質(zhì)酶檢測平板上沒有產(chǎn)生可見的透明圈，表明該菌株不能向胞外分泌幾丁質(zhì)酶。

圖9 拮抗菌株HKD-6胞外酶活性的檢測結(jié)果

3 討論

篩選并利用高效生防菌株抑制稻瘟病菌，已成為水稻稻瘟病防治的研究熱點。貝萊斯芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的1個新成員，近年來已被證實在多種植物病害防治中表現(xiàn)出良好的效果，包括條斑?。?5］、枯萎?。?9-20］、稻瘟病［13］和白絹?。?8］等。李生樟等［15］從空心菜根際土壤中篩選得到的貝萊斯芽孢桿菌504對水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo)具有顯著的抑菌效果。萬青等［19-20］分離得到的貝萊斯芽孢桿菌B18、YX-11對香蕉枯萎病病原菌Foc4均表現(xiàn)出明顯的拮抗作用，在盆栽試驗中的防效均達到64%以上。李界秋等［18］測定的6株貝萊斯芽孢桿菌對尖孢鐮刀菌等6種土傳病原菌均表現(xiàn)出抑菌活性。沙月霞等［13］從水稻葉片分離得到的E69菌株，除對立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌等多種病原菌具有拮抗作用外，對稻瘟病菌也表現(xiàn)出顯著的抑制作用，在溫室條件下測定其對稻瘟病的預(yù)防效果，達83.24%。因此，貝萊斯芽孢桿菌在水稻稻瘟病防治中具有較大的應(yīng)用潛力。

雖然已有多種貝萊斯芽孢桿菌被發(fā)現(xiàn)并用于多種植物病害的生物防治，但是由其制成的生防菌劑仍然不能滿足市場的需求，且對貝萊斯芽孢桿菌抑菌機制的探討也尚不深入。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬細(xì)菌的抑菌機制主要包括拮抗、營養(yǎng)和空間競爭等，其中拮抗作用的產(chǎn)生與其合成和分泌的抑菌物質(zhì)密切相關(guān)［7,21］。

以表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)和豐原素(Fengycin)為代表的脂肽類抗生素，能夠破壞致病真菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，從而抑制病原真菌菌絲的生長和發(fā)育［8］。李生樟等［15,18］均發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌基因組中含有與豐原素、表面活性素、伊枯草菌素等多種脂肽類物質(zhì)合成相關(guān)的基因片段。Chowdhury等［22］發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌FZB42（原解淀粉芽孢桿菌）能夠在萵苣根際土壤中分泌表面活性素、豐原素和桿菌霉素D，除直接抑制立枯絲核菌的生長外，還能夠誘導(dǎo)萵苣防御素基因PDF 1.2的上調(diào)表達，增強其對病原菌的免疫反應(yīng)。Gao等［23-25］均證實貝萊斯芽孢桿菌分泌的伊枯草菌素、豐原素等抗菌物質(zhì)能夠破壞植物病原菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，造成菌絲的扭曲、腫大和畸形，進而導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡。

此外，以蛋白酶、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶為代表的水解酶，可被芽孢桿菌分泌到胞外，對真菌的細(xì)胞壁進行降解破壞，從而達到抑制病原菌生長的目的［21］。李界秋等［18,26-27］均證實了貝萊斯芽孢桿菌具有分泌蛋白酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶等胞外酶的能力。王偉等［28］從貝萊斯芽孢桿菌12-51菌株發(fā)酵液中初步分離得到了蛋白類抗菌物質(zhì)組分，證實其對大麗輪枝菌具有拮抗活性。Xu等［29］從貝萊斯芽孢桿菌ZJ20中克隆獲得了1個β-1，3-葡聚糖酶，發(fā)現(xiàn)其重組蛋白能夠破壞栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、紫卷擔(dān)子菌(Helicobasidium purpureum)和桉樹焦枯病菌(Cylindrocladium quinqueseptatum)這3種植物病原菌的菌絲形態(tài)。

開展貝萊斯芽孢桿菌對稻瘟病菌的抑菌機制研究，對指導(dǎo)水稻稻瘟病的生物防治具有重要意義。本實驗從貝萊斯芽孢桿菌HKD-6基因組中擴增出了與脂肽類抗生素合成相關(guān)的基因srfAB、fenD、ituC、bacA、bamC、mycB和yndJ，表明該菌株具有產(chǎn)生芽孢桿菌類典型脂肽類抗生素的潛力。同時，該菌株的基因組亦含有葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶的編碼基因，但酶活平板檢測發(fā)現(xiàn)僅有蛋白酶和葡聚糖酶被分泌到胞外，可能直接參與致病真菌細(xì)胞壁的降解。然而究竟哪些活性成分在抑制稻瘟病菌過程中發(fā)揮主要作用，以及抑菌物質(zhì)的作用靶點和方式，仍有待于今后深入研究。

除了產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)外，生防菌株防治效果的發(fā)揮還依賴于菌體在復(fù)雜外界環(huán)境中的存活和定殖。本實驗發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌HKD-6對防治稻瘟病的常用化學(xué)殺菌劑具有良好的相容性，且能耐受較高濃度的鹽和較寬范圍的pH值，這有利于該拮抗菌株在各種環(huán)境中定殖以及實現(xiàn)與化學(xué)殺菌劑的聯(lián)合使用，因此貝萊斯芽孢桿菌HKD-6具有預(yù)防大田稻瘟病的潛力。今后應(yīng)進一步對貝萊斯芽孢桿菌HKD-6的施用方式進行研究，并評價其與其他化學(xué)殺菌劑、菌劑和肥料的協(xié)同效果，以期為稻瘟病生防菌劑的開發(fā)和應(yīng)用提供更多的數(shù)據(jù)支撐。