佀勝利，鄒莎莎，吳書云，王成湘

（凱里學(xué)院，貴州凱里 556011）

纖維素是植物細胞壁的主要成分之一，是自然界中現(xiàn)有數(shù)量最多且最低廉的資源，目前尚未得到充分合理的利用［1］。在自然狀態(tài)下，纖維素的生物降解主要通過微生物分泌的纖維素酶來完成，降解過程無污染、成本低，因而纖維素降解微生物的篩選一直受到研究者的關(guān)注［2-3］。自然界存在的產(chǎn)纖維素酶的微生物種類較多，對纖維素的降解能力差異較大，通過對其培養(yǎng)條件的優(yōu)化可以有效提高產(chǎn)纖維素酶的效率和對纖維素的降解能力［4-6］。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

多年自然生長松樹林下充分腐熟的松針土，采集于貴州省鎮(zhèn)遠縣。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：K2HPO41.00 g·L-1、NaCl 0.10 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.30 g·L-1、NaNO32.50 g·L-1、FeCl30.001 g·L-1、CaCl20.10 g·L-1。培養(yǎng)基按照每瓶50 mL 進行分裝，每個三角瓶中放入約0.50 g 濾紙條，121 ℃滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基：（NH4）2SO42.00 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.50 g·L-1、K2HPO41.00 g·L-1、NaCl 0.50 g·L-1、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）2.00 g·L-1、瓊脂20.00 g·L-1，121 ℃滅菌20 min。

含剛果紅的篩選培養(yǎng)基：在篩選培養(yǎng)基中加入2.00 g·L-1剛果紅。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨3.00 g·L-1、酵母粉0.50 g·L-1、（NH4）2SO42.00 g·L-1、KH2PO44.00 g·L-1、CaCl20.30 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.30 g·L-1，121 ℃滅菌20 min。

1.3 纖維素降解菌株的篩選

稱量1.00 g 土壤樣品，在30 ℃ 150 r·min-1富集培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至濾紙條完全裂解。用無菌水連續(xù)稀釋培養(yǎng)后的富集培養(yǎng)基，得到10-7稀釋液，取稀釋液200 μL 均勻涂布到含剛果紅的篩選培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)，待菌落長出后，挑選培養(yǎng)特征不同且具有明顯透明圈的單菌落轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基，純化后冷凍保存。將純化后的菌株轉(zhuǎn)接篩選培養(yǎng)平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。用0.5%的剛果紅溶液染色60 min，再用1 mol·L-1NaCl 溶液褪色60 min，觀察染色后的透明圈大小。選擇透明圈直徑（D）/菌落直徑（d）比值較大的菌株，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃ 150 r·min-1培養(yǎng)72 h，測定培養(yǎng)液的羧甲基纖維素酶活性（CMCA），選擇CMCA 最高的菌株，進行下一步試驗。

1.4 纖維素降解菌株的鑒定

1）形態(tài)學(xué)鑒定。接種菌株到篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，觀察菌落培養(yǎng)特征，進行革蘭氏染色。

2）分子生物學(xué)鑒定。將培養(yǎng)24 h 的純化菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行鑒定，利用細菌16S rDNA 通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCATGGC TCAG-3'）、1492R（5'-TAGGGTTACCTT GTTACGACTT-3'）

對菌株16S rDNA 序列進行擴增，對PCR 產(chǎn)物純化回收后測序，利用BLAST 軟件將測序結(jié)果與GenBank中已有序列進行比對，使用MEGA-X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的種屬。

1.5 發(fā)酵條件對纖維素降解菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

1.5.1 單因素試驗

選取發(fā)酵時間、發(fā)酵初始pH 值和發(fā)酵溫度進行單因素試驗，研究各因素對篩選出的菌株產(chǎn)纖維素酶的影響。將篩選出的菌株接種到一定初始pH 值的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在指定溫度下150 r·min-1振蕩培養(yǎng)一定時間，將發(fā)酵液3 000 r·min-1離心10 min，得粗酶液。測定單因素條件下粗酶液的CMCA 確定合適的正交設(shè)計參數(shù)。每個處理設(shè)3 個重復(fù)組。

1.5.2 正交優(yōu)化

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇發(fā)酵時間、初始pH值和發(fā)酵溫度，設(shè)計3 因素3 水平正交試驗，采用L9（33）正交表。

1.6 纖維素酶活性的測定

纖維素酶活性用DNS 法進行測定［6］。在特定條件下，1 mL 粗酶液1 min 轉(zhuǎn)化產(chǎn)生1μg 還原糖所需的酶量規(guī)定為1 個酶活力單位（U）。取0.50 mL 粗纖維素酶溶液、1.00 mL 檸檬酸緩沖液（pH=4.8）和1.50 mL CMC-Na 溶液充分混勻，50 ℃ 150 r·min-1酶解180 min，之后加入3.00 mL DNS 溶液，充分混勻后沸水浴5 min，冷卻后加入3.00 mL 蒸餾水，充分混勻后在540 nm 處測定吸光值。同時，設(shè)置底物空白和酶空白。

1.7 葡萄糖標準曲線的制作

向干燥試管中分別加入1.00 mg·mL-1標準葡萄糖溶液0.00 mL、0.30 mL、0.60 mL、0.90 mL、1.20 mL、1.50 mL，再分別加蒸餾水至體積為1.50 mL，加入DNS試劑3.00 mL，混勻，沸水浴5 min 后冷卻，最后用蒸餾水定容至10 mL，充分混勻后測定在540 nm 的吸光值。以葡萄糖濃度為縱坐標，吸光值為橫坐標，得到葡萄糖標準曲線方程為y=1.290 8x+0.059 4（R2=0.999 1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌株的篩選

將富集液稀釋后涂平板，共分離純化得到12 個產(chǎn)生明顯降解圈的纖維素降解菌株。對轉(zhuǎn)接后的菌株進行剛果紅染色，如圖1 所示。通過測定透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），菌株DT10、DT13、DT14 的透明圈直徑比值（D/d）較大。測定3 個菌株發(fā)酵所得粗酶液的CMCA，如表1 所示，DT13 的酶活最高，作為進一步研究的菌株。

表1 纖維素降解菌株D/d 值與羧甲基纖維素酶活性

2.2 纖維素降解菌株的鑒定

DT13 菌株在篩選培養(yǎng)基上生長24 h 的菌落呈白色、圓形、濕潤無皺褶，如圖1（a）所示。經(jīng)革蘭氏染色后顯微觀察，菌體為細桿狀，呈紫紅色，為革蘭氏陽性菌，如圖1（b）所示。該菌株經(jīng)DNA 提取、PCR 擴增獲得長度為1 434 bp 的16S rDNA 片段，通過BLAST 序列比對，菌株DT13 與枯草芽孢桿菌（B.subtillis）相似度在99.7%以上；選擇相似度較高的代表菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2，DT13 與枯草芽孢桿菌的進化關(guān)系較近，可靠性較高，確定菌株DT13為枯草芽孢桿菌（B.subtillis）。

圖1 菌株DT13 的形態(tài)特征與革蘭氏染色圖

圖2 菌株DT13 系統(tǒng)發(fā)育樹圖

2.3 發(fā)酵條件對菌株DT13 產(chǎn)纖維素酶的影響

2.3.1 發(fā)酵條件對纖維素酶產(chǎn)量影響的單因素試驗

將菌株DT13 在30 ℃ 150 r·min-1條件下進行纖維素酶發(fā)酵144 h，自發(fā)酵開始每隔24 h 取出一次樣品測定其纖維素酶粗酶液的CMCA。結(jié)果如圖3（a）所示，CMCA 隨著發(fā)酵時間的增加呈增加趨勢，在96 h 時達到最高，為4.86 U·mL-1；菌株DT13 接種在不同初始pH 值的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃ 150 r·min-1條件下發(fā)酵96 h，發(fā)酵后粗纖維素酶液的CMCA 如圖3（b）所示，CMCA 隨著pH 值的增加而增大，至pH 值7.5 時達到最大，為5.31 U·mL-1；菌株DT13接種在初始pH值為7.5 的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在不同溫度150 r·min-1條件下發(fā)酵96 h，發(fā)酵后粗纖維素酶液的CMCA 如圖3（c）所示，CMCA隨著溫度的增加而增大，至40 ℃時達到最高值，為6.56 U·mL-1，溫度繼續(xù)增加CMCA 呈下降的趨勢。綜合試驗結(jié)果，菌株DT13 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的較合適的單因素條件分別為發(fā)酵時間96 h、初始pH 值7.5、發(fā)酵溫度40 ℃。

圖3 菌株DT13 發(fā)酵試驗單因素對纖維素酶CMCA 的影響圖

2.3.2 正交試驗設(shè)計結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇A發(fā)酵時間（84 h、96 h、108 h）、B初始pH值（7.0、7.5、8.0）、C發(fā)酵溫度（37 ℃、40 ℃、43 ℃）設(shè)計3 因素3 水平正交試驗。發(fā)酵結(jié)束后，測定各組合得到的粗酶液的CMCA，試驗結(jié)果如表2 所示。影響發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶CMCA 的3 個因素排序為初始pH 值（B）＞發(fā)酵溫度（C）＞發(fā)酵時間（A），產(chǎn)酶的最佳組合為A2B1C2。

表2 菌株DT13 產(chǎn)纖維素酶CMCA 正交試驗結(jié)果分析表

2.3.3 驗證試驗

正交極差分析表中，A3B1C2培養(yǎng)組合所產(chǎn)的CMCA值最高，選取A2B1C2、A3B1C2發(fā)酵組合進行驗證試驗，結(jié)果如表3 所示，組合A2B1C2所產(chǎn)生的粗酶液的CMCA 約為6.69 U·mL-1，顯著高于組合A3B1C2。因此，確定菌株DT13 的最佳培養(yǎng)組合為A2B1C2，即初始pH值7.0、發(fā)酵溫度40 ℃，發(fā)酵時間96 h。

表3 正交設(shè)計組合驗證試驗結(jié)果表

3 結(jié)論

本研究從森林腐熟土壤中篩選出一株產(chǎn)纖維素降解菌DT13，經(jīng)形態(tài)學(xué)、革蘭氏染色和分子生物學(xué)鑒定確定DT13 為枯草芽孢桿菌（B.subtillis）。通過單因素試驗和正交試驗設(shè)計，對菌株DT13 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的條件進行研究，確定菌株DT13 的最佳發(fā)酵條件為初始pH 值7.0、發(fā)酵溫度40 ℃、發(fā)酵時間96 h。