于大永， 高鴻雁， 曹 鶴， 盧 軒， 史麗穎

(大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 大連116622)

癌癥是危害人類(lèi)健康的重大惡性疾病之一，目前已經(jīng)成為一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]，放療、化療仍是其主要治療方式，但治療的副作用較大，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，因此，尋找天然活性物質(zhì)對(duì)腫瘤進(jìn)行防治則引起了廣泛的關(guān)注[3-4]。乳腺癌是現(xiàn)代女性中常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，闡明乳腺癌的發(fā)病機(jī)理與有效治療是目前一個(gè)亟待解決的難題[5]。膀胱癌是發(fā)生在膀胱黏膜的惡性腫瘤，發(fā)病率居泌尿男性生殖系統(tǒng)腫瘤首位[6-7]。惡性黑色素瘤是一種來(lái)源于黑色素細(xì)胞的惡性程度極高的皮膚腫瘤，近幾十年，惡性黑色素瘤的發(fā)病率急劇升高，成為實(shí)體瘤發(fā)病率上升速度最快、惡性程度最高的腫瘤[8-9]。人白血病是發(fā)生于血液和骨髓中的惡性腫瘤，不易治愈，部分患者會(huì)愈后復(fù)發(fā)。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是目前針對(duì)白血病治療的研究熱點(diǎn)[10-11]。

細(xì)胞松弛素類(lèi)化合物主要從真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到，研究表明該類(lèi)化合物具有抗腫瘤[12-13]、抗炎[14]、抗菌[15-16]等活性。Chaetoglobosins E (ChE)是細(xì)胞松弛素類(lèi)化合物之一，有研究[17]發(fā)現(xiàn)其對(duì)MCF-7、U937、A549和Hela等細(xì)胞系具有明顯的細(xì)胞毒性，加藥處理72 h后IC50為1.4～9.2 μmol/L，但研究?jī)H停留在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)階段，ChE對(duì)腫瘤細(xì)胞的具體作用機(jī)制仍不明確。為進(jìn)一步探索ChE對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制情況，本研究將ChE對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人膀胱癌T-24細(xì)胞、人黑色素瘤C8161細(xì)胞和人白血病U937細(xì)胞等4種腫瘤細(xì)胞活性抑制進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)，并基于細(xì)胞增殖抑制結(jié)果對(duì)其中一種細(xì)胞系的具體作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探究，為該化合物抗腫瘤的新藥開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人膀胱癌T-24細(xì)胞(大連物理化學(xué)研究所)、人黑色素瘤C8161細(xì)胞(大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院)和人白血病U937細(xì)胞(日本人類(lèi)科學(xué)基金會(huì))。

1.2 主要試劑與儀器

Chaetoglobosins E (相對(duì)分子量530.65)，課題組從毛殼屬(Chaetomiumsp.)真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離、純化后，鑒定為該化合物；噻唑蘭(MTT)，抗體，生工生物工程(上海)股份有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司；凋亡檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Invitrogen公司；胎牛血清，天津康源生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，Hoechst 33342，北京索萊寶試劑公司；活性氧檢測(cè)試劑盒，RIPA裂解液，蛋白酶抑制劑PMSF，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；RNase，Dioc6(3)，Sigma-Aldrich公司；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，新加坡ESCO公司；SYGN2/7503化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，英國(guó)Gene公司；ECLIPSE Ts2倒置熒光顯微鏡，日本尼康公司；流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司；酶標(biāo)儀、PowerPacTMBasic電泳儀，美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人膀胱癌細(xì)胞T-24、人黑色素瘤細(xì)胞C8161，培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)；人白血病細(xì)胞U937，培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基內(nèi)。分別于37 ℃、5% CO2、飽和濕度下常規(guī)傳代培養(yǎng)，使細(xì)胞保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

將細(xì)胞濃度調(diào)整為3×104個(gè)/mL，向96孔板接種等量且處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞。培養(yǎng)12 h后吸出原培養(yǎng)基，加入ChE，使其終濃度分別為6.25、12.50、25、50、100 μmol/L，陰性對(duì)照組加入等量完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入10 μL MTT溶液(5 g/L)。培養(yǎng)結(jié)束后，貼壁細(xì)胞棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上搖20 min；懸浮細(xì)胞每孔直接加入150 μL鹽酸-SDS-異丁醇三聯(lián)溶解液，置于培養(yǎng)箱中過(guò)夜。待結(jié)晶充分溶解后，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度A，計(jì)算體外細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A0)×100%。

1.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105個(gè)/mL，向6孔板接種等量且處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的MCF-7細(xì)胞。 培養(yǎng)12 h后吸去原培養(yǎng)基后加藥處理，使ChE終濃度為25、50、100 μmol/L，陰性對(duì)照組加入等量完全培養(yǎng)基。將6孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，加入適量的Hoechst 33342溶液，使其工作質(zhì)量濃度為2 ug/mL，避光染色10 min，收集細(xì)胞，用熒光顯微鏡拍照。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

細(xì)胞加藥處理方法同1.5。將6孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后收集細(xì)胞，用滅菌后的冷PBS緩沖液洗3次后用195 μL緩沖液重懸細(xì)胞，依次加入5 μL FITC標(biāo)記的AnnexinⅤ和10 μL PI染液后室溫避光15 min，將染色后的MCF-7細(xì)胞用低溫離心機(jī)按1 500 r/min離心5 min后加入500 μL PBS緩沖液重懸MCF-7細(xì)胞，用300 μm細(xì)胞篩過(guò)濾后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7 細(xì)胞周期檢測(cè)

細(xì)胞加藥處理方法同1.5。將6孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷70%乙醇細(xì)胞30 min，用PBS洗去乙醇后重新離心收集細(xì)胞，加入預(yù)冷RNase和PI，避光孵育30 min，篩網(wǎng)過(guò)濾后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。

1.8 細(xì)胞活性氧(ROS)檢測(cè)

細(xì)胞加藥處理方法同1.5。將6孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后收集細(xì)胞，用滅菌后的低溫PBS緩沖液洗3次后加入終質(zhì)量濃度為10 μg/mL的DCFH-DA染液，避光30 min，離心后用冷PBS緩沖液洗2次MCF-7細(xì)胞，篩網(wǎng)過(guò)濾后用流式細(xì)胞儀得到不同濃度ChE處理的MCF-7細(xì)胞活性氧含量。

1.9 細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)

細(xì)胞加藥處理方法同1.5。將6孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后收集細(xì)胞，用滅菌后的低溫PBS緩沖液洗3次后加入Dioc6(3)，使其工作濃度為40 nmol/L，避光培養(yǎng)30 min，離心后用冷PBS緩沖液洗2次MCF-7細(xì)胞，篩網(wǎng)過(guò)濾后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.10 Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白

細(xì)胞加藥處理方法同1.5。將6孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液和PMSF提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白于95 ℃水浴中變性15 min后置于-20 ℃暫存準(zhǔn)備電泳。采用4%濃縮膠和10%分離膠，每上樣孔加入30 μg蛋白樣品，以80 V進(jìn)行恒壓電泳，電泳結(jié)束后以0.3 A恒流轉(zhuǎn)膜1 h將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂牛奶-TBST對(duì)膜封閉90 min。室溫孵育Bax、Bcl-2、Bid、Caspase-3、cleaved Caspase-3以及GAPDH一抗4 h，結(jié)束后用TBST洗膜3次，孵育二抗，再次洗膜，加入顯影液避光2 min后用顯影儀拍照，利用Image J軟件分析灰度值。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ChE對(duì)4種腫瘤細(xì)胞增殖抑制的影響

不同濃度ChE處理細(xì)胞24、48 h后細(xì)胞存活率如圖1所示，與對(duì)照組相比，隨著ChE濃度增加，4種腫瘤細(xì)胞存活率均有不同程度下降，且多數(shù)為極顯著差異(P<0.01)，在處理48 h后的細(xì)胞存活率較24 h細(xì)胞存活率更低，表明ChE呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

圖1 Chaetoglobosins E 結(jié)構(gòu)式

IC50越小，代表該藥物在這種癌細(xì)胞中的半抑制質(zhì)量濃度越低，即癌細(xì)胞對(duì)藥物越敏感[18]。將得到的細(xì)胞存活率采用GraphPad Prism 7.04軟件計(jì)算IC50值(表1)，ChE對(duì)MCF-7的IC50最低，即對(duì)該細(xì)胞抑制效果最強(qiáng)。

圖2 不同濃度ChE對(duì)4種腫瘤細(xì)胞24、48 h增殖的影響

表1 ChE對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的IC50

2.2 細(xì)胞凋亡的形態(tài)觀察

前期MTT篩選實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)了ChE對(duì)MCF-7細(xì)胞有較高的細(xì)胞毒性作用，為了確定其抑制MCF-7細(xì)胞增殖的作用機(jī)制是否與誘導(dǎo)凋亡相關(guān)，對(duì)處理后的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行了Hoechst 33342染色，該染料可以與細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)DNA結(jié)合，經(jīng)過(guò)特定波長(zhǎng)光源激發(fā)后呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，但該染料不可透過(guò)健康細(xì)胞的細(xì)胞膜，因此不會(huì)對(duì)其染色;而受到破壞的細(xì)胞，其膜的完整性喪失，因而通過(guò)熒光顯微鏡觀察到其形態(tài)變化，基于此原理可以觀察到ChE使MCF-7細(xì)胞形態(tài)改變的具體情況。與陰性對(duì)照組相比(圖3)，ChE對(duì)MCF-7細(xì)胞處理6 h后，細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡特征，細(xì)胞熒光強(qiáng)度增大，細(xì)胞核的體積縮小，細(xì)胞核裂解并伴有凋亡小體。隨著ChE濃度的增加，凋亡細(xì)胞數(shù)量隨之顯著增加。

圖3 不同濃度ChE對(duì)MCF-7細(xì)胞處理6 h后的細(xì)胞形態(tài) (×400)

2.3 ChE誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡

ChE對(duì)MCF-7細(xì)胞處理12 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。25 μmol/L ChE處理后，與陰性對(duì)照組相比(圖4)，凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著增多，且凋亡數(shù)目呈ChE濃度依賴(lài)性增加(P<0.01)。

圖4 不同濃度ChE處理MCF-7細(xì)胞12 h后的凋亡情況

2.4 ChE對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響

ChE對(duì)MCF-7細(xì)胞處理4 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化情況。與陰性對(duì)照組相比(圖5)，加藥組G1期細(xì)胞減少，在100 μmol/L時(shí)達(dá)到顯著差異(P<0.05)，S期細(xì)胞略有增加，Sub G1期細(xì)胞在25 μmol/L顯著增加(P<0.01)，G2/M期細(xì)胞增多，在100 μmol/L時(shí)達(dá)到顯著差異(P<0.05)，表明抑制細(xì)胞有絲分裂是ChE抑制MCF-7細(xì)胞增殖的機(jī)理之一。

圖5 不同濃度ChE處理MCF-7細(xì)胞4 h后細(xì)胞周期的變化

2.5 ChE對(duì)MCF-7細(xì)胞活性氧的影響

細(xì)胞受到刺激后，在很短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生ROS,會(huì)迅速導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)及組分的氧化損傷,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。ChE對(duì)MCF-7細(xì)胞處理2 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞ROS變化情況。隨著給藥濃度增加，各組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度均有所增強(qiáng)(圖6)。與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞ROS在25 μmol/L時(shí)顯著增加(P<0.05)，在50 μmol/L差異極顯著(P<0.01)，表明ChE抑制MCF-7細(xì)胞增殖可能與細(xì)胞內(nèi)ROS累積有關(guān)。

圖6 不同濃度ChE處理MCF-7細(xì)胞2 h后細(xì)胞內(nèi)ROS的變化

2.6 ChE對(duì)MCF-7細(xì)胞線粒體膜電位的影響

ChE對(duì)MCF-7細(xì)胞處理3 h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度。與陰性對(duì)照組相比(圖7)，經(jīng)25 μmol/L濃度ChE處理后的細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著降低(P<0.05)，100 μmol/L時(shí)差異極顯著(P<0.01)，表明經(jīng)ChE處理可使MCF-7細(xì)胞線粒體膜電位降低。

圖7 不同濃度ChE處理MCF-7細(xì)胞3 h后細(xì)胞線粒體膜電位損失率的變化

2.7 ChE對(duì)MCF-7細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

ChE對(duì)MCF-7細(xì)胞處理6 h后，Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化(圖8)。與陰性對(duì)照組相比，ChE處理后，細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax與逆凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量的比值在50、100 μmol/L濃度顯著增加(P<0.05)，Bid和Caspase-3的表達(dá)量均隨著ChE處理濃度的增加而極顯著下降(P<0.01)，而Cleaved Caspase 3隨給藥濃度增加顯著增加(P<0.01)(圖8B)。

圖8 不同濃度ChE處理MCF-7細(xì)胞6 h后細(xì)胞蛋白表達(dá)量的變化

3 討論

細(xì)胞松弛素是由聚酮和氨基酸聚合而成的一類(lèi)真菌次生代謝產(chǎn)物，具有多種藥理活性，例如抗腫瘤、抗炎和抗菌等。LI等[19]發(fā)現(xiàn)Chaetoglobosin K可通過(guò)p53依賴(lài)性途徑誘導(dǎo)了順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞凋亡和G2周期阻滯；KNUDSEN等[12]發(fā)現(xiàn)Chaetoglobosin A通過(guò)靶向細(xì)胞骨架優(yōu)先誘導(dǎo)慢性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞凋亡；MA等[20]發(fā)現(xiàn)Cytochalasin H通過(guò)PI3K/AKT/P70S6K和ERK1/2信號(hào)通路抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的HIF-1α蛋白的積累和VEGF表達(dá)抑制血管生成，而ChE對(duì)腫瘤細(xì)胞的具體作用機(jī)制的研究迄今為止仍未見(jiàn)報(bào)道。

癌細(xì)胞的無(wú)限增殖特點(diǎn)使得癌癥在體內(nèi)發(fā)展迅速、難以治療，因此，能否抑制腫瘤的異常增殖是評(píng)價(jià)藥物抗腫瘤能力的標(biāo)準(zhǔn)之一[21]。乳腺癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)癌癥之一，死亡率居于婦科腫瘤首位，嚴(yán)重影響了女性生命健康[22]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將ChE作用于MCF-7、T-24、C8161和U937四種腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ChE均表現(xiàn)出抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性，尤其對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖抑制作用更強(qiáng)，24、48 h的IC50分別為82.04±7.01、49.87±2.28 μmol/L。

細(xì)胞凋亡是藥物抗腫瘤細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一[23-24]，本實(shí)驗(yàn)中Hoechst 33342染色觀察到乳腺癌MCF-7細(xì)胞經(jīng)ChE處理后出現(xiàn)了明顯的凋亡特征：細(xì)胞核體積縮小，細(xì)胞核裂解并伴有凋亡小體。流式細(xì)胞術(shù)中Annexin Ⅴ-PI雙染也驗(yàn)證了這一結(jié)果，隨著ChE濃度的增加，凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞經(jīng)ChE處理后Sub G1和G2/M期細(xì)胞顯著增加。有研究[25-26]表明，細(xì)胞內(nèi)ROS的累積與細(xì)胞凋亡存在一定的聯(lián)系，過(guò)多的氧自由基將導(dǎo)致細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，腫瘤細(xì)胞由于代謝旺盛受損傷更為嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性氧產(chǎn)生增加，表明MCF-7細(xì)胞經(jīng)ChE處理后出現(xiàn)的凋亡現(xiàn)象可能與ROS累積有關(guān)。

內(nèi)源性線粒體途徑是細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[27]。Bcl-2家族蛋白在線粒體途徑的調(diào)控中十分關(guān)鍵，包括抗凋亡蛋白(如Bcl-2)和促凋亡蛋白(如Bax、Bid等)，當(dāng)促凋亡蛋白比例升高時(shí)，線粒體內(nèi)、外膜的通透性升高，使線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C等促凋亡因子釋放進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[28-30]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞經(jīng)ChE處理后，細(xì)胞線粒體膜電位降低。Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞經(jīng)ChE處理后，Bid、Caspase 3蛋白表達(dá)量降低，Cleaved Caspase 3、Bax蛋白與Bc1-2蛋白表達(dá)量的比值均增加。

4 結(jié)論

首次對(duì)ChE的抗乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖作用機(jī)制進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：ChE對(duì)MCF-7、T-24、C8161和U937細(xì)胞增殖均有抑制作用，且均呈現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴(lài)性。4種腫瘤細(xì)胞中，ChE對(duì)MCF-7增殖的抑制效果最強(qiáng)。將ChE作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞觀察其細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞核形態(tài)改變，后續(xù)流式實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ChE處理后的細(xì)胞活性氧增多，膜電位喪失，細(xì)胞有絲分裂在G2/M期有所累積，相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)量的變化揭示ChE抑制MCF-7細(xì)胞生存與線粒體凋亡途徑有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)為ChE的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。