黃 山，孫溪若，呂松琴，許寶妹，聶 磊，王義娜，李曉非

[1.昆明市第三人民醫(yī)院（云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學(xué)中心），云南 昆明 650041；2.上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，上海 201108]

在人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染的初篩試驗中[1]，酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）因有較好的敏感性和特異性，對場地和設(shè)備要求不高，所以應(yīng)用最為廣泛[2]，但存在檢測耗時長、需手工操作、易出錯、易污染等缺點[3]。因此，為了克服ELISA的不足，臨床亟需一種可自動操作、簡便、檢測耗時短的HIV初篩方法。本研究擬初步探討干式熒光發(fā)光法在HIV感染篩查中的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2020年6月1日—12月31日昆明市第三人民醫(yī)院感染一科收治的疑似HIV感染患者351例，其中男186例、女165例，年齡（47.79±12.35）歲。收集所有患者的血清樣本，對所有HIV抗體篩查試驗有反應(yīng)的樣本采用HIV確證試驗（免疫印跡法）檢測，最終確認(rèn)HIV抗體陽性165例、陰性186例。本研究經(jīng)昆明市第三人民醫(yī)院倫理委員會審核通過，研究前向患者及家屬講述本研究的目的和實施方案，征得同意后并簽署知情同意書，臨床試驗嚴(yán)格遵循赫爾辛基宣言和中國有關(guān)臨床試驗研究規(guī)范、法規(guī)進(jìn)行。

1.2 儀器與試劑

HIV檢測試劑盒（干式熒光發(fā)光法）、HIV診斷試劑盒（ELISA）均購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司。人類免疫缺陷病毒（HIV 1+2型）抗體檢測試劑盒（免疫印跡法）購自新加坡MP生物醫(yī)學(xué)亞太私人有限公司。AFS-1000干式熒光免疫分析儀、AFS-1200干式熒光免疫分析儀均購自廣州藍(lán)勃生物科技有限公司，ELX808酶標(biāo)儀、ELX50洗板機均購自美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 HIV抗體補充試驗 采用人類免疫缺陷病毒（HIV1+2型）抗體檢測試劑盒（免疫印跡法）檢測HIV，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，根據(jù)試劑說明書提供的標(biāo)準(zhǔn)判定陰陽性。

1.3.2 HIV篩查實驗 （1）干式熒光發(fā)光法：嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。吸取100 μL血清，滴加到試劑卡的加樣孔中，反應(yīng)15 min后立即上機檢測，S/CO值≥1為陽性，S/CO值＜1為陰性。（2）ELISA：嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。呈非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料以率或例表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kappa值評估2種方法之間的一致性。采用Spearman相關(guān)分析評估2種方法的相關(guān)性。以HIV確證試驗（免疫印跡法）為金標(biāo)準(zhǔn)，分別計算2種方法的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干式熒光發(fā)光法與ELISA S/CO值的比較

ELISA的S/CO值為0.233（0.156～17.453），顯著高于干式熒光發(fā)光法[0.573（0.132～2.432）]（Z=5.608，P＜0.001）。見圖1。

圖1 干式熒光發(fā)光法與ELISA的S/CO值比較

趨勢分析結(jié)果顯示，干式熒光發(fā)光法的S/CO值隨ELISA S/CO值的升高而升高，呈正相關(guān)（r=0.715，P＜0.001）。在ELISA S/CO值=31.639和干式熒光發(fā)光法S/CO值=2.432時，2種方法的趨勢線交叉，自該交叉點起，隨著檢測結(jié)果數(shù)的增多，ELISA S/CO值的升高趨勢更明顯。見圖2。

圖2 干式熒光發(fā)光法與ELISA的S/CO值趨勢比較

2.2 干式熒光發(fā)光法與ELISA的檢測性能分析

以HIV確證試驗（免疫印跡法）為金標(biāo)準(zhǔn)，在351例樣本中，干式熒光發(fā)光法陽性165例、陰性186例，ELISA陽性168例、陰性183例。2種方法的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 干式熒光發(fā)光法與ELISA的檢測性能分析

干式熒光發(fā)光法與ELISA的陽性符合率為95.83%（161/168），陰性符合率為97.27%（178/183），總符合率為96.58%（339/351），一致性好（Kappa=0.931）。

3 討論

在HIV篩查試驗中，ELISA對儀器、設(shè)備要求不高，且具有較高的敏感性和特異性，因此應(yīng)用最為廣泛[4]。但ELISA從加樣到結(jié)果判讀需要2個多小時，從加樣一直到最后的終止反應(yīng)，所有檢測步驟基本為手工操作，極易出錯或被污染。當(dāng)操作出錯或受污染時，多數(shù)情況下需重新檢測，不僅浪費了人力、物力，提高了檢測成本[5]，還會耽誤患者的就診、確診時間[6]。干式熒光發(fā)光法僅需一臺小型熒光免疫分析儀，對設(shè)備的要求比ELISA更低，一份樣本的檢測時長只需15 min，整個檢測過程不涉及大量的手工操作，滴加樣本后只用等待上機判讀結(jié)果，出錯或被污染的概率很低。該技術(shù)采用雙抗原夾心法原理設(shè)計[7]，在硝酸纖維素膜檢測線（T線）位置包被HIV重組抗原1，檢測時樣本中的待測物先與固化在玻璃纖維上的熒光微球標(biāo)記的HIV重組抗原2結(jié)合，并繼續(xù)向硝酸纖維素膜層析，通過硝酸纖維素膜T線時，被包被在硝酸纖維素膜上的HIV重組抗原1捕獲。在熒光免疫分析儀上檢測時，陽性樣本的T線產(chǎn)生明顯信號，熒光數(shù)值的高低與樣本中的待測物濃度成正比。在硝酸纖維膜質(zhì)控線（C線）包被羊抗兔多克隆抗體，在玻璃纖維膜上固化有熒光微球標(biāo)記的兔IgG，無論樣本中是否含有待測物，C線羊抗兔多克隆抗體始終可以捕獲兔IgG熒光標(biāo)記物，因此C線始終有熒光信號產(chǎn)生。

本研究結(jié)果顯示，干式熒光發(fā)光法檢測HIV的敏感性和特異性均＞90%，準(zhǔn)確性高。與ELISA比較，雖然2種方法的S/CO值存在顯著差異，但變化趨勢基本一致，陽性符合率、陰性符合率和總符合率均＞90%，一致性好（Kappa=0.931）。由此可見，干式熒光發(fā)光法與ELISA具有較高的一致性。

綜上所述，干式熒光發(fā)光法各項檢測性能與ELISA相當(dāng)，且具備檢測快速、操作簡便等優(yōu)勢，在檢驗技術(shù)人員緊缺、場地及設(shè)備受限的部分欠發(fā)達(dá)地區(qū)和基層醫(yī)院可采用該技術(shù)開展HIV抗體篩查；該技術(shù)也為即時檢驗[8]及HIV快速檢測替代策略[9]提供了一種適宜的選擇，具有很好的應(yīng)用前景。