劉文霞，王 瑋，林松洋，李振紅

（鄭州安圖生物工程股份有限公司研發(fā)中心，河南 鄭州 450016）

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）目前已被廣泛應(yīng)用于臨床診斷等領(lǐng)域，成為醫(yī)學(xué)診療活動(dòng)中不可缺少的技術(shù)[1]。然而，當(dāng)這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)中的血液、糞便等復(fù)雜生物樣本時(shí)，PCR抑制物成為結(jié)果判讀的障礙。PCR抑制物通常來(lái)源于樣本本身，或來(lái)源于收集、處理樣本的過(guò)程，會(huì)顯著降低PCR的靈敏度和擴(kuò)增效率，對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成干擾，降低結(jié)果的準(zhǔn)確性。針對(duì)PCR抑制物的干擾，添加劑成為解決此問(wèn)題的有效方法。學(xué)者們已發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的PCR增強(qiáng)劑，可在不同方面對(duì)PCR起促進(jìn)作用，如提高PCR的特異性、增加PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量及防止無(wú)效擴(kuò)增等[2-3]。在臨床檢驗(yàn)中，血液中的血紅素、尿液中的尿素、糞便中的膽酸鹽均對(duì)PCR有抑制作用[4]。為此，本研究擬探討13種PCR增強(qiáng)劑對(duì)臨床檢驗(yàn)中常見(jiàn)的PCR抑制物尿素、膽酸鹽和血紅素抑制作用的消除效果，以期降低臨床PCR檢測(cè)假陰性結(jié)果的概率，提高臨床檢測(cè)準(zhǔn)確性。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

從全血樣本中提取人基因組DNA后純化，-20 ℃保存。核酸提取或純化試劑、全血樣本處理試劑及人β珠蛋白基因擴(kuò)增試劑均購(gòu)自鄭州安圖生物股份有限公司。血紅素購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。膽酸鹽、尿素、亞精胺、甲酰胺、PEG6000、Tween-20、甜菜堿、海藻糖、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、明膠、硫酸銨、四甲基氯化銨（tetramethylammonium chloride，TMAC）、甘油、Triton X-100購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。Nonidet P 40（NP40）購(gòu)自湖北佰智昂生物化工有限公司。MILLI-Qreference超純水機(jī)購(gòu)自默克化工技術(shù)（上海）有限公司。AL204電子天平購(gòu)自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA制備 按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行全血樣本前處理及人基因組DNA模板的提取和純化。

1.2.2 熒光PCR擴(kuò)增體系構(gòu)建 以提取的人基因組DNA作為模板，擴(kuò)增β珠蛋白基因中的一段序列，上游引物為5'-GAAGGCTCATGGCAAGAAAG-3'，下游引物為5'-CTCACTCAGTGTGGCAAAGG-3'，探針序列為CTTGAGGTTGTCCAGGTGAGCCAG-CY5。本研究構(gòu)建了3種熒光PCR擴(kuò)增體系，具體信息見(jiàn)表1。將構(gòu)建好的擴(kuò)增體系在ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃22 s，45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后；如空白對(duì)照組擴(kuò)增曲線(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)S型曲線(xiàn)，循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）為29±1，則本次擴(kuò)增有效。

表1 3種熒光PCR擴(kuò)增體系構(gòu)建信息 μL

1.2.3 抑制物和增強(qiáng)劑的配制 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用超純水配制不同濃度膽酸鹽（4.65、6.98 mmol/L）、尿素（0.91、0.99 mol/L）、血紅素（6.40、6.98 mmol/L）作為抑制物。使用超純水配制不同濃度亞精胺（0.16～60.00 mmol/L）、甲酰胺（2.5%～40.0%）、PEG6000（2.5%～40.0%）、NP40（0.6%～10.0%）、Tween-20（2.5%～40.0%）、甜菜堿（0.1～5.0 mol/L）、海藻糖（0.125～1.500 mol/L）、BSA（30～376 mmol/L）、明膠（0.125%～2.000%）、硫酸銨（6.25～100.00 mmol/L）、TMAC（12.5～200.0 mmol/L）、甘油（20%～60%）、Triton X-100（1.25%～20.00%）作為增強(qiáng)劑。所有試劑均置于2～8 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 抑制物抑制作用和增強(qiáng)劑抗抑制作用的判定

1.3.1 抑制作用的判定 以PCR中無(wú)抑制物的擴(kuò)增結(jié)果作為對(duì)照，逐步增加抑制物濃度。當(dāng)含抑制物的樣本Ct值較對(duì)照增大1時(shí)，判定為擴(kuò)增受抑制，將無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn)、擴(kuò)增結(jié)果為“無(wú)Ct值”（Ct=0）時(shí)的最小抑制物濃度確定為抑制物的工作濃度。含抑制物的樣本占對(duì)照樣本擴(kuò)增平臺(tái)期熒光強(qiáng)度的百分比=含抑制物的樣本擴(kuò)增平臺(tái)期熒光強(qiáng)度/對(duì)照樣本擴(kuò)增平臺(tái)期熒光強(qiáng)度×100%，其中擴(kuò)增平臺(tái)期熒光強(qiáng)度可從ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上的該次實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)圖中讀出。如含抑制物樣本的Ct值與對(duì)照樣本相同，但百分比低于對(duì)照樣本，說(shuō)明抑制作用仍存在。

1.3.2 抗抑制作用的判定 在模板DNA中分別加入工作濃度的抑制物和5 μL不同濃度的13種增強(qiáng)劑，以不加入增強(qiáng)劑且含有相應(yīng)工作濃度抑制物的樣本作為對(duì)照。以與對(duì)照樣本相比擴(kuò)增曲線(xiàn)平臺(tái)期的熒光強(qiáng)度顯著提高、由無(wú)Ct值變?yōu)橛蠧t值或Ct值高于對(duì)照樣本為標(biāo)準(zhǔn)（對(duì)照樣本無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn)），判斷增強(qiáng)劑對(duì)膽酸鹽、尿素和血紅素的抗抑制作用。

2 結(jié)果

2.1 抑制物工作濃度確認(rèn)

膽酸鹽、尿素和血紅素的工作濃度分別為6.98 mmol/L、0.99 mol/L、6.98 mmol/L。見(jiàn)表2。

表2 抑制物工作濃度的確認(rèn)

2.2 增強(qiáng)劑對(duì)PCR抑制物的影響

6.5 mmol/L亞精胺、20%甘油可消除6.98 mmol/L膽酸鹽對(duì)PCR的抑制作用，6.5 mmol/L亞精胺、100 mmol/L硫酸銨、0.2 mol/L甜菜堿可消除0.99 mol/L尿素對(duì)PCR的抑制作用。300 mmol/L BSA、6.5 mmol/L亞精胺、20%PEG6000、50%甘油可消除6.98 mmol/L血紅素對(duì)PCR的抑制作用。40%甲酰胺、10%NP40、40% Tween-20、1.5 mol/L海藻糖、2%明膠、200 mmol/L TMAC和20% Triton X-100均無(wú)法降低6.98 mmol/L膽酸鹽、0.99 mol/L尿素和6.98 mmol/L血紅素對(duì)PCR的抑制作用。見(jiàn)表3。

表3 不同濃度增強(qiáng)劑抗膽酸鹽、尿素和血紅素抑制作用

3 討論

理論上，PCR可以檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞或DNA分子。然而，PCR抑制物的存在影響了PCR的擴(kuò)增效率，從而降低了PCR的檢測(cè)能力，降低了檢測(cè)靈敏度。增強(qiáng)劑是解決PCR抑制問(wèn)題的有效方法。目前已有多種PCR增強(qiáng)劑被開(kāi)發(fā)出來(lái)[5]。

本研究結(jié)果顯示，亞精胺表現(xiàn)出顯著的抗膽酸鹽、尿素和血紅素抑制的效果。WAN等[6]的研究結(jié)果顯示，亞精胺對(duì)PCR有增強(qiáng)作用，其原理是小分子亞精胺通過(guò)促進(jìn)聚合酶、引物和模板的結(jié)合來(lái)促進(jìn) PCR起始復(fù)合物的形成，微摩爾濃度的亞精胺可顯著增強(qiáng)植物基因組DNA的擴(kuò)增。海藻糖、BSA和Tween-20對(duì)蝦殼成分有抗抑制作用，因此常被用于檢測(cè)蝦樣本中病毒的PCR方法中[7]。此外，BSA可以提高rTth酶對(duì)生物樣本的抗性，且BSA中的賴(lài)氨酸含量高，可結(jié)合核酸提取過(guò)程中殘留的酚類(lèi)化合物，保護(hù)TaqDNA聚合酶活性，從而起到增強(qiáng)PCR擴(kuò)增效率的作用[8]。甜菜堿具有破壞富含GC的DNA序列的能力，可提高PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量和特異性。在中藥材鑒定中，硫酸銨可以?xún)?yōu)化引物與模板的特異性結(jié)合，提高PCR的特異性。本研究結(jié)果顯示，硫酸銨具有顯著的抗尿素抑制作用。有研究結(jié)果顯示，PEG600和甘油可通過(guò)增強(qiáng)酶的熱穩(wěn)定性及保護(hù)酶活性來(lái)提高PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量[9]。本研究結(jié)果顯示，甘油和PEG6000對(duì)不同抑制物表現(xiàn)出了不同的增強(qiáng)作用，甘油對(duì)膽酸鹽有顯著的抗抑制作用，而PEG6000對(duì)尿素和血紅素有顯著的抗抑制作用，這可能與抑制物自身的性質(zhì)有關(guān)，不同抑制物抑制PCR的機(jī)制有一定差異。

綜上所述，本研究所選的3種抑制物（膽酸鹽、尿素和血紅素）在臨床檢測(cè)中較為常見(jiàn)，即使樣本經(jīng)過(guò)某些前處理，仍不可避免地會(huì)有抑制物殘留。通過(guò)對(duì)PCR增強(qiáng)劑的篩選，可以為PCR抑制問(wèn)題提供一個(gè)可行的研究方向和解決方法，提高熒光PCR的檢測(cè)靈敏度。