孫 英，李 軼，閆文娟，荊 楠，馬 冰

（河南省直第三人民醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450000）

近年來，極具耐藥性的革蘭陰性細(xì)菌，尤其是碳青霉烯耐藥腸桿菌科細(xì)菌（carbapenemresistantEnterobacteriaceae，CRE）的檢出率日益增高[1]。2018年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測報告顯示，河南地區(qū)CRE檢出率居首位[2]。產(chǎn)碳青霉烯酶是CRE最重要的耐藥機(jī)制[3]。本研究回顧性分析河南省直第三人民醫(yī)院2019年少見CRE的臨床檢出和耐藥情況，并分析CRE產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶和絲氨酸碳青霉烯酶的情況，為CRE院內(nèi)防控及精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2019年分離自河南省直第三人民醫(yī)院臨床樣本的非重復(fù)少見CRE，從中隨機(jī)選取22株亞胺培南和/或美羅培南耐藥[最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）≥4 μg/mL]株。

1.2 儀器和試劑

美國BD公司Phoenix-100全自動細(xì)菌鑒定和藥敏系統(tǒng)、英國OXIOD公司藥物敏感性試驗紙片，鄭州安圖生物科技有限公司血瓊脂平板和M-H平板，珠海迪爾生物有限公司酶抑制劑法緩沖液試劑，NG-TEST CARBA 5膠體金試劑盒（長沙中生眾捷公司），MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀（德國布魯克公司）。

1.3 質(zhì)控菌株

銅綠假單胞菌（ATCC 27853）和大腸埃希菌（ATCC 25922）為體外藥物敏感性試驗質(zhì)控菌株；肺炎克雷伯菌（ATCC BAA-1705、ATCC BAA-1706、ATCC BAA 2146）為碳青霉烯酶初篩實驗質(zhì)控菌株，由河南省人民醫(yī)院閆文娟博士惠贈。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)菌培養(yǎng)鑒定及體外藥物敏感性試驗 按照第3版《臨床微生物檢驗標(biāo)準(zhǔn)化操作》[4]要求進(jìn)行樣本采集及細(xì)菌培養(yǎng)，采用 Phoenix-100全自動細(xì)菌鑒定和藥敏系統(tǒng)進(jìn)行菌株鑒定和體外藥物敏感性試驗，同時采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行補充體外藥物敏感性試驗，參照2018年美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S28文件[5]進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.4.2 碳青霉烯酶酶型初篩實驗 隨機(jī)選取22株除肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌外的CRE臨床分離株，采用MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀進(jìn)行菌種復(fù)核，采用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）聯(lián)合3-氨基苯硼酸（3-aminophenylboric acid，APBA）碳青霉烯酶抑制實驗和膠體金免疫層析法篩查菌株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶和絲氨酸碳青霉烯酶的酶型[6]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用WHONET 5.6和EXCEL 2013軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 CRE檢出情況

2019年河南省直第三人民醫(yī)院共檢出1 111株CRE，其中陰溝腸桿菌49株（15.4%）、產(chǎn)酸克雷伯菌14株（19.2%）、枸櫞酸桿菌屬12株（13.8%）。見表1。

表1 CRE菌種分布及構(gòu)成比

2.2 CRE耐藥性分析

CRE對多種臨床常用抗菌藥物有較高的耐藥率，不同菌屬對不同抗菌藥物的耐藥性存在差異。CRE對亞胺培南的耐藥率高于美羅培南；未檢出對替加環(huán)素、多黏菌素B耐藥腸桿菌屬、產(chǎn)酸克雷伯菌、枸櫞酸桿菌屬，對多黏菌素B及替加環(huán)素天然耐藥的變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬對氨曲南的耐藥率分別為5.3%和14.3%。不同菌屬CRE對抗菌藥物的耐藥率見表2。

表2 CRE對臨床常用抗菌藥物的耐藥率 %

2.3 碳青霉烯酶初篩實驗結(jié)果

從1 111株CRE中隨機(jī)選取22株，同時采用EDTA聯(lián)合APBA碳青霉烯酶抑制實驗和膠體金免疫層析法篩查菌株所產(chǎn)酶的酶型。結(jié)果顯示，有13株EDTA碳青霉烯酶抑制實驗陽性即產(chǎn)金屬酶，膠體金免疫層析法結(jié)果顯示其酶型為NDM；4株APBA碳青霉烯酶抑制實驗陽性即產(chǎn)絲氨酸酶，其中3株膠體金免疫層析法結(jié)果顯示其酶型為KPC，1株陰性；2株EDTA+APBA碳青霉烯酶抑制實驗陽性即產(chǎn)金屬酶+絲氨酸酶，膠體金免疫層析法結(jié)果顯示其酶型分別為KPC+IMP+NDM、KPC+NDM；3株碳青霉烯酶抑制實驗未檢出，其中1株膠體金免疫層析法檢測結(jié)果顯示酶型為OXA。部分結(jié)果見圖1。

圖1 部分碳青霉烯酶初篩實驗結(jié)果

3 討論

近年來，由于抗菌藥物的不合理使用，CRE日益增多，其對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥情況也日趨嚴(yán)重，給臨床抗感染治療帶來極大挑戰(zhàn)，分析細(xì)菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性和碳青霉烯酶酶型是解決臨床治療CRE困境的重要途徑[7]。本研究結(jié)果顯示，檢出的1 111株CRE中，肺炎克雷伯菌所占比例最高（51.8%），其他腸桿菌科如陰溝腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、枸櫞酸桿菌屬、普羅威登斯菌屬中亦不斷有CRE菌株檢出，應(yīng)引起臨床重視。本研究結(jié)果顯示，CRE對多種臨床常用抗菌藥物有較高的耐藥率，且腸桿菌科細(xì)菌不同菌屬對不同抗菌藥物的耐藥性存在差異；CRE對亞胺培南耐藥率高于美羅培南，腸桿菌屬、產(chǎn)酸克雷伯菌、枸櫞酸桿菌屬對替加環(huán)素、多黏菌素B均敏感。雖然CLSI提示普羅威登斯菌屬可能因存在非產(chǎn)碳青霉烯酶機(jī)制而導(dǎo)致亞胺培南MIC升高，但是臨床檢出菌株中美羅培南耐藥普羅威登斯菌屬CRE亦不斷出現(xiàn)。本研究中，對多黏菌素B和替加環(huán)素天然耐藥的變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬對氨曲南也有較低的耐藥率，分別是5.3%和14.3%。可能與其易產(chǎn)金屬酶而能被氨曲南抑制有關(guān)[7]。

腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機(jī)制主要為產(chǎn)碳青霉烯酶、產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶或頭孢菌素酶伴外膜蛋白缺失、外排泵系統(tǒng)上調(diào)等，其中最重要的耐藥機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶。根據(jù)耐藥機(jī)制研究和流行病學(xué)分析結(jié)果可知，我國CRE的主要流行株為產(chǎn)KPC型肺炎克雷伯菌，大腸埃希菌主要流行株為NDM型[8]，有關(guān)其他菌株的研究數(shù)據(jù)相對較少，酶型篩查大多采用CLSI推薦的改良碳青霉烯類失活法（modified carbapenem inactivation method，mCIM）或聯(lián)合乙二胺四乙酸-碳青霉烯類失活法（ethylenediaminetetraacetic acid-modified carbapenem inactivation method，eCIM）[9]，耗時較長。本研究隨機(jī)選取22株除肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌外的少見CRE臨床分離株，采用聯(lián)合EDTA和APB碳青霉烯酶抑制實驗，同步進(jìn)行膠體金免疫層析法菌株酶型篩查，結(jié)果顯示，EDTA碳青霉烯酶抑制實驗陽性即產(chǎn)金屬酶13株，膠體金免疫層析法檢測酶型均為NDM；APBA碳青霉烯酶抑制實驗陽性即產(chǎn)絲氨酸酶4株，膠體金免疫層析法檢測3株酶型為KPC，1株陰性，推測可能產(chǎn)KPC和OXA外的其他絲氨酸酶；EDTA+APBA碳青霉烯酶抑制實驗陽性即產(chǎn)金屬酶+絲氨酸酶2株，膠體金免疫層析法檢測酶型分別為KPC+IMP+NDM和KPC+NDM；碳青霉烯酶抑制實驗未檢出3株，其中1株膠體金免疫層析法檢測酶型為OXA，2株膠體金免疫層析法檢測結(jié)果為陰性的菌株可能是由非產(chǎn)酶機(jī)制引起的碳青霉烯類耐藥。有研究結(jié)果表明，CRE菌株中，除肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌外，其他腸桿菌科細(xì)菌酶型主要為NDM型金屬酶，該酶型對頭孢他啶-阿維巴坦的耐藥率較高[10]。

對CRE酶型進(jìn)行分析能對臨床CRE精準(zhǔn)治療提供用藥參考，因此碳青霉烯酶檢測具有很好的臨床價值。目前，檢測碳青霉烯酶的金標(biāo)準(zhǔn)是聚合酶鏈反應(yīng)，操作都較為繁瑣，需要特殊的試劑和儀器，且對操作人員有較高的要求，在大多臨床微生物實驗室無法常規(guī)開展。EDTA聯(lián)合APBA碳青霉烯酶抑制實驗操作簡便，結(jié)果易于判讀；膠體金免疫層析法方便快捷，大大縮短了報告時間，可盡早為臨床用藥提供參考。

綜上所述，CRE檢出率及耐藥率高是河南地區(qū)臨床抗菌藥物使用所面臨的棘手問題，少見CRE的耐藥性及其多樣的酶型更增加了臨床治療的困難。CRE的耐藥性和碳青霉烯酶酶型檢測有著廣泛的臨床意義，本研究后續(xù)將進(jìn)一步增加酶型檢測數(shù)量，并觀察臨床病例感染與治療情況，以期為CRE臨床診治和感染控制提供更精準(zhǔn)、快捷的參考。