潘允琪，李運(yùn)改，王堅(jiān)鏹，吳 瓊，湯 瑾

（上海市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200233）

尿路感染是臨床常見的泌尿系統(tǒng)感染性疾病之一，有25%～40%的成年女性在初次感染后6個(gè)月內(nèi)會(huì)再次感染[1]。非復(fù)雜性尿路感染經(jīng)過藥物治療后，仍會(huì)有定植于尿道口的腸道細(xì)菌上行至膀胱，引起復(fù)發(fā)性尿路感染（recurrent urinary tract infection，rUTI）。尿路致病性大腸埃希菌（uropathogenicEscherichiacoli，UPEC）是社區(qū)獲得性尿路感染（70%～95%）和大部分醫(yī)院獲得性尿路感染（50%）的主要致病菌[2]。UPEC入侵膀胱上皮后，可產(chǎn)生毒素和蛋白酶，并合成鐵載體，通過黏附素或菌毛附著到腎上皮細(xì)胞定植，產(chǎn)生組織損傷毒素，進(jìn)而引起反復(fù)感染[3]。隨著致病菌對(duì)抗菌藥物耐藥率的增加，rUTI的治療變得越來越具有挑戰(zhàn)性。為了更好地了解UPEC分離株的系統(tǒng)發(fā)育、毒力因子和耐藥性，及其與rUTI的相關(guān)性，本研究對(duì)分離自復(fù)發(fā)和再感染rUTI患者的UPEC臨床分離株進(jìn)行比較，并分析其異同。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2010年1月—2013年12月上海市第六人民醫(yī)院6個(gè)月內(nèi)被診斷為非復(fù)雜性尿路感染2次及以上的rUTI患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）2次感染期間中段尿培養(yǎng)均分離出大腸埃希菌，且細(xì)菌菌落數(shù)均＞105CFU/mL；（2）患者在首次感染使用抗菌藥物治療后，至少有1次中段尿培養(yǎng)陰性，或尿常規(guī)檢測(cè)白細(xì)胞數(shù)正常，在6個(gè)月內(nèi)發(fā)生再次感染，且2次感染的致病菌均為大腸埃希菌。排除患有其他病原體感染、無癥狀菌尿、留置導(dǎo)尿管和尿路結(jié)石等復(fù)雜性尿路感染患者[4]。所有培養(yǎng)陽(yáng)性病原菌經(jīng)分離純化后，采用法國(guó)生物梅里埃公司VITEK 2 Compact60全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定。最終納入60例rUTI患者。

1.2 方法

1.2.1 種系發(fā)育分型 參照CLERMONT等[5]的研究方法，采用多重聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），根據(jù)2個(gè)基因（chuA和yjaA）結(jié)合1個(gè)DNA片段（TSPE4.C2）確定大腸埃希菌的主要系統(tǒng)發(fā)育群，即A、B1、B2和D。采用Primer 5.0軟件和Oligo 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 UPEC系統(tǒng)發(fā)育分型引物序列和PCR條件

1.2.2 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE） 采用CHEF系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）進(jìn)行PFGE。通過XbaⅠ消化制備基因組DNA，用BioNumerics 6.0（比利時(shí)Applied-Maths公司）進(jìn)行條帶分析，并將其劃分為同源組（PFGE類型）。具有85%的遺傳相似性或不多于4段PFGE差異的菌株被判定為同源的克隆體。

1.2.3 多位點(diǎn)序列分型（multi-locus sequence typing，MLST） 采用PCR擴(kuò)增7個(gè)大腸埃希菌管家基因（adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA）并測(cè)序，引物設(shè)計(jì)參考MLST網(wǎng)站（http：//mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Ecoli）。測(cè)序結(jié)果提交MLST網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)。采用基因序列相關(guān)分型軟件（enhanced based upon related sequence types，eBURST）進(jìn)行MLST分析。

1.2.4 毒力因子檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)[6-8]篩選10個(gè)大腸埃希菌毒力基因，采用PCR擴(kuò)增90株大腸埃希菌的10個(gè)毒力基因，包括feoB、chuA、iutA、iroN、ireA、fimH、foc、sfa、aer和cnf，引物序列及PCR反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[6-9]。

1.2.5 體外藥物敏感性試驗(yàn) 采用VITEK 2 GN卡（法國(guó)生物梅里埃公司）進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)。質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）藥物敏感性根據(jù)2014年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。檢測(cè)的藥物包括氨芐西林、哌拉西林、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢唑啉、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星和復(fù)方磺胺甲噁唑13種抗菌藥物。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

根據(jù)PFGE結(jié)果將60例rUTI患者分為復(fù)發(fā)組和再感染組。復(fù)發(fā)組初次感染與再次感染病原菌為同源菌株；再感染組2次感染病原菌為非同源菌株。復(fù)發(fā)組與再感染組各30例，剔除同一患者同源性重復(fù)菌株，共納入30株分離自復(fù)發(fā)組的大腸埃希菌和60株分離自再感染組的大腸埃希菌。復(fù)發(fā)組有73.3%為女性，年齡（70.0±14.4）歲；再感染組有70.0%為女性，年齡（72.0±16.7）歲。復(fù)發(fā)組感染間隔時(shí)間為（90.2±66.8）d，再感染組2次感染間隔時(shí)間為（134.7±88.3）d。。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分型

系統(tǒng)發(fā)育分型結(jié)果顯示，在90株UPEC中，有55.6%屬于D型，B1型、B2型和A型分別占21.1%、20.0%和3.3%。復(fù)發(fā)組中除D型外，B2型所占比例較高，2個(gè)組之間系統(tǒng)發(fā)育分型無明顯差異（P＞0.05）。見表2。

表2 復(fù)發(fā)組與再感染組UPEC系統(tǒng)發(fā)育分型

2.3 MLST結(jié)果

90株UPEC共檢出27種ST型別，其中復(fù)發(fā)組13種，再感染組24種，ST131所占比例最高（31.1%）；復(fù)發(fā)組中其他ST型別依次為ST405（16.7%）、ST648（10.0%）、ST1193（6.7%）和ST38（6.7%）；再感染組其他ST型別依次為ST405（10.0%）、ST410（10.0%）和ST69（6.7%）。其他ST型別（110、14、1415、1434、155、1585、3492、354、361、457、46、4676、48、5020、57、617、711、73、744和95） 均檢出1～5 株（1.1%～5.6%）。系統(tǒng)發(fā)育分析驗(yàn)證各ST型別間的遺傳異質(zhì)性結(jié)果見圖1。

圖1 90株UPEC各ST型別的遺傳異質(zhì)性分析結(jié)果

2.4 體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

90株UPEC對(duì)環(huán)丙沙星、氨芐西林、哌拉西林、頭孢唑啉的耐藥率較高，對(duì)哌拉西林-他唑巴坦、亞胺培南、美羅培南的耐藥率較低。復(fù)發(fā)組中有3.3%的UPEC對(duì)美羅培南耐藥，但再感染組UPEC對(duì)美羅培南完全敏感?？傮w來看，2個(gè)組UPEC的抗菌藥物耐藥性模式無明顯差異（P＞0.05）。

2.5 毒力基因檢測(cè)結(jié)果

復(fù)發(fā)組與再感染組UPECiutA攜帶率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.020），其余毒力基因差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)于無癥狀細(xì)菌尿路感染和反復(fù)出現(xiàn)的復(fù)雜尿路感染患者，其個(gè)體差異和易感性，以及不同病原菌特點(diǎn)是影響感染的重要因素。見表3。

表3 90株UPEC毒力基因攜帶情況 株（%）

3 討論

UPEC是細(xì)菌性尿路感染的主要病原菌之一。有研究發(fā)現(xiàn)，性別（女性）、既往尿路感染病史、性活動(dòng)、陰道感染、糖尿病、肥胖以及遺傳易感性與尿路感染相關(guān)[1]。有研究結(jié)果表明，尿路感染的復(fù)發(fā)是由胞內(nèi)細(xì)菌儲(chǔ)存庫(kù)內(nèi)的UPEC釋放，并定植于尿道上皮細(xì)胞持續(xù)數(shù)周至數(shù)月引起的[10]。本研究中，復(fù)發(fā)組UPEC的PFGE模式不同，提示其可能來自不同的克??；復(fù)發(fā)組中具有相似PFGE模式的大腸埃希菌的ST型別相似，但再感染組有7株大腸埃希菌具有不同的PFGE模式，但其ST型別相同，其他23株P(guān)FGE模式不同，ST型別也不同；ST131型是本研究中最常見的MLST型別，ST型別間的相關(guān)性可揭示遺傳異質(zhì)性，即2個(gè)組UPEC菌株沒有克隆傳播。

本研究中，90株UPEC系統(tǒng)發(fā)育分型結(jié)果顯示，D型是UPEC的主要系統(tǒng)發(fā)育群，且系統(tǒng)發(fā)育型在復(fù)發(fā)組和再感染組UPEC中無差異（P＞0.05）。大腸埃希菌根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分為A、B1、B2和D型，在東亞地區(qū)，D型菌株在社區(qū)獲得性尿路感染中占優(yōu)勢(shì)[11]。有多中心研究結(jié)果顯示，分別有54%和19%的尿路感染由D型和B2型UPEC菌株引起[12]，與本研究系統(tǒng)發(fā)育分型結(jié)果一致。而歐美國(guó)家的研究發(fā)現(xiàn)，B2型菌株是rUTI持續(xù)存在的主要原因，提示應(yīng)進(jìn)一步了解疾病流行率差異背后的機(jī)制，除VF外，B2型菌株可能在rUTI持留的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[4]。

與大多數(shù)大腸埃希菌菌株不同，UPEC具有特殊的黏附因子、鐵獲取系統(tǒng)、宿主防御機(jī)制等毒力因子，這些機(jī)制被統(tǒng)稱為外毒力因子。本研究檢測(cè)的UPEC毒力基因中，有6種基因的攜帶率高于50%，分別為fimH（93.3%）、chuA（76.7%）、iutA（86.7%）、iroN（61.1%）、foeB（98.8%）和aer（66.7%），而在鐵獲取相關(guān)基因中只有ireA基因攜帶率低于20%。相關(guān)研究結(jié)果表明，UPEC臨床菌株中的所有大腸埃希菌菌株共有的鐵獲取相關(guān)基因都高度表達(dá)[13]，提示鐵獲取系統(tǒng)在UPEC分離株中的表達(dá)非常普遍。本研究復(fù)發(fā)組與再感染組之間鐵獲取基因iutA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02）。有研究結(jié)果表明，黏附素和鐵吸收系統(tǒng)與大腸埃希菌在共生腸道菌群中的持續(xù)存在有關(guān)，具有高度黏附力和鐵捕獲能力的UPEC菌株可能通過形成病原菌儲(chǔ)存庫(kù)進(jìn)一步導(dǎo)致rUTI持續(xù)存在[14]。iutA因子是泌尿道中最關(guān)鍵的鐵捕獲因子，有助于UPEC的膀胱定植，鐵獲取系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌群落（intracellular bacterial community，IBC）的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[15]。此外，UPEC可以從血紅素中清除鐵，缺乏血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白chuA的突變體在體內(nèi)形成更小的IBC[16]，鐵載體和血紅素相關(guān)的三價(jià)鐵表達(dá)系統(tǒng)促進(jìn)了IBC的形成[17]。因此，調(diào)節(jié)膀胱中的鐵水平可以有效地控制UPEC的持留、上皮細(xì)胞死亡，有利于rUTI的治療[3，18]。

本研究中，fimH基因是最常見的毒力基因，檢出率≥90%。1型菌毛黏附素fimH通過誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白重排導(dǎo)致細(xì)菌侵入，對(duì)其定植、侵襲和持留有重要作用[1]。本研究中，有14%（13/90）的菌株檢出foc基因，有3%（3/90）的菌株中檢出sfa基因。foc基因所占比例與以往研究接近，但sfa基因所占比例明顯低于RAHDAR等[19]報(bào)道的81%。本研究復(fù)發(fā)組與再感染組UPEC黏附基因攜帶率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。UPEC還可分泌細(xì)胞毒性壞死因子1，可在體外增強(qiáng)UPEC對(duì)尿路上皮細(xì)胞的侵襲[20]，但沒有研究結(jié)果表明細(xì)胞毒性壞死因子在體內(nèi)發(fā)揮作用[21]。相關(guān)研究都強(qiáng)調(diào)了沒有單一的UPEC毒力因子引起感染反復(fù)發(fā)作[17]。

本研究中，UPEC菌株對(duì)大多抗菌藥物具有較高的耐藥性，包括氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類和磺胺類，耐藥率均＞70%。氟喹諾酮是經(jīng)驗(yàn)性治療尿路感染的一線藥物，其高耐藥水平與當(dāng)?shù)乜咕幬锸褂玫念l率有一定的相關(guān)性。在本研究中，絕大多數(shù)菌株對(duì)碳青霉烯類藥物和磷霉素較敏感。也有研究結(jié)果顯示，上海地區(qū)UPEC菌株對(duì)美羅培南（99.5%）、亞胺培南（99.0%）有較高的敏感性[22]。有學(xué)者建議將磷霉素和呋喃妥因用于尿路感染的經(jīng)驗(yàn)性治療[23-24]，但無限制地使用這些抗菌藥物會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性逐漸增強(qiáng)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，再感染組對(duì)抗菌藥物的敏感性略高于復(fù)發(fā)組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可能提示UPEC對(duì)臨床常用抗菌藥物高度耐藥，但其并不是導(dǎo)致尿路感染反復(fù)發(fā)作的原因。

綜上所述，上海市第六人民醫(yī)院UPEC的主要ST型別為ST131和ST405型，UPEC常見毒力基因feoB和fimH攜帶率較高，UPEC對(duì)臨床常用抗菌藥物高度耐藥，但其并不是導(dǎo)致尿路感染反復(fù)發(fā)作的原因。尿路感染的高流行率、反復(fù)使用抗菌藥物、未使用嚴(yán)格的尿路感染診斷標(biāo)準(zhǔn)可能會(huì)導(dǎo)致病原菌對(duì)抗菌藥物耐藥性增強(qiáng)。對(duì)rUTI的病原體進(jìn)行詳細(xì)的流行病學(xué)調(diào)查，并確定泌尿道內(nèi)UPEC的致病機(jī)制，有助于制定新的治療策略，以消除UPEC。多重耐藥UPEC引起的rUTI高發(fā)率與高耐藥率相關(guān)，必須合理使用抗菌藥物，有效地治療rUTI。了解UPEC耐藥譜和毒力因子與疾病復(fù)發(fā)率的相關(guān)性對(duì)rUTI的臨床診斷、治療和預(yù)后具有重要的意義。