馮金娜，殷西鋒，李善文，孔令武，敬霖志，付才力，馮聲寶，黃德建，

（1.青?；ブ囡乒煞萦邢薰荆嗪；ブ?810500；2.蘇州昊德生物科技有限公司，江蘇蘇州 215123；3.新加坡國立大學(蘇州)研究院，江蘇蘇州 215123）

青稞是青藏高原特色農(nóng)作物，具有較高的營養(yǎng)價值，其營養(yǎng)成分具有“三高兩低”的特點，即高蛋白、高可溶性膳食纖維、高維生素和低脂低糖。同時青稞還含有鋅、鐵、鈣、磷、銅和硒等多種對人體有益的礦物質(zhì)。此外，青稞還含有硫氨酸、尼克酸、β-葡聚糖、類黃酮和生育酚等功能性成分。

青稞適合釀酒，在青藏地區(qū)歷史悠久，每年該區(qū)的青稞七成以上用來釀酒。青稞酒是由青稞經(jīng)過篩選、去雜、脫皮、浸潤、蒸煮、瀝干攤晾、拌曲、發(fā)酵、蒸餾等工藝而制成。最近，青海青稞酒傳統(tǒng)釀造技藝入選國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)目錄。而青稞酒糟作為青稞白酒的副產(chǎn)物，主要成分來自釀酒原料青稞和酒曲，含有蛋白質(zhì)、氨基酸、可溶纖維、有機酸及香味物質(zhì)等。青稞酒糟產(chǎn)量大，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，酸度高，如果不加以適當?shù)奶幚砗图庸だ?，既會造成很大的資源浪費，還很容易腐敗變質(zhì)，造成環(huán)境污染。

目前，酒糟的利用主要集中在制作肥料或飼料，釀造食醋，培養(yǎng)食用菌，提取蛋白、木糖、β-葡聚糖以及發(fā)酵產(chǎn)生有機酸、木糖醇等。然而這些利用途徑存在著成本較高、工序較復雜等缺陷。在實際生產(chǎn)中，將酒糟用作飼料和堆積農(nóng)肥仍是當前使用最廣、切實可行的途徑。但是這種簡單粗放的處理方式最大的缺點就是資源利用率不高，產(chǎn)品附加值低。

本研究通過酶法工藝提取青稞酒糟水溶物，定量分析提取物的抗氧化、美白、抗紫外活性、總多肽和總可溶纖維素含量，并高效利用青稞酒糟中豐富的蛋白質(zhì)、可溶纖維、多酚抗氧化活性成分，設(shè)計出了具有保濕、抗氧化、美白、抗紫外等功能的全功能無紡布面膜。通過對面膜樣品進行過敏性測試與人體測試，結(jié)果表明，本青稞酒糟面膜對臉部皮膚的美白、保濕具有明顯的改善作用。青稞酒糟高值化綜合利用，將對青稞產(chǎn)業(yè)鏈產(chǎn)生重要的經(jīng)濟和社會效益。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

青稞酒糟：青?；ブ囡乒煞萦邢薰咎峁?/p>

試劑及耗材：酸性蛋白水解酶，江蘇銳陽生物科技有限公司；甘油，上海麥恪林生化科技有限公司；透明質(zhì)酸鈉，西安百川生物科技有限公司；尿囊素，上海麥恪林生化科技有限公司；煙酰胺，西安百川生物科技有限公司；羥乙基纖維素，上海麥恪林生化科技有限公司；羥苯甲酯，上海麥恪林生化科技有限公司；丁二醇，廣州川一化工有限公司。

儀器設(shè)備：JM-60B膠體磨，上海田崗機械制造有限公司；TDM-WS 離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；SF-5 提取罐，南京科爾儀器設(shè)備有限公司；HWCL-3 集熱式恒溫磁力攪拌器，鄭州長城科工貿(mào)；EON 酶標儀，上海基因有限公司；自動阿貝折射儀，上海儀電物理光學儀器有限公司；WBL2521H 料理攪拌機，廣東美的生活電器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 青稞酒的生產(chǎn)工藝以及青稞酒糟的質(zhì)量分析

青稞酒的生產(chǎn)工藝是在青?；ブ貐^(qū)傳承數(shù)百年的“清蒸清燒四次清”工藝，主要工藝環(huán)節(jié)包括：青稞浸泡、蒸煮、攤晾、冷卻、拌曲、入窖發(fā)酵、裝甑、蒸餾。此工藝入選國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)目錄，工藝流程詳見圖1。

圖1 青稞酒“清蒸清燒四次清”生產(chǎn)工藝

第四米查次燒酒結(jié)束后，新鮮酒糟出甑。新鮮酒糟色澤金黃色或褐黃色，混有酒糟的糟香和酸香，本項目分別檢測酒糟的水分含量、灰分、營養(yǎng)成分、農(nóng)藥殘留、重金屬等指標，驗證是否符合化妝品原料安全衛(wèi)生標準。

1.2.2 青稞酒糟的提取工藝

新鮮青稞酒糟加兩倍純凈水，用料理攪拌機打漿后，轉(zhuǎn)入圓底燒瓶，放置恒溫磁力攪拌器攪拌，45 ℃保溫，加酸性蛋白酶水解。按照不同酶解條件和酶解時間完成酶解后，取出酶解液離心，離心速率為4000 r/min。取上清液備用，離心殘渣在105 ℃鼓風干燥機烘干5 h 后稱重，計算提取率。如下：

提取率=（m-m）/m×100%

式中：m：第一組空白對照殘渣質(zhì)量；n：樣品編號；m：第n組樣品殘渣質(zhì)量。

1.2.3 青稞酒糟提取液活性檢測

新鮮酒糟加兩倍純凈水打漿后，45 ℃保溫，加0.5 g 酸性蛋白酶，按設(shè)定時間取樣后，樣品立即放入沸水浴進行酶滅活1 min。靜置冷卻后離心，離心速率為4000 r/min。取上清液檢測備用。另一組樣品不加酸性蛋白酶作為對照。分別對上清液進行抗氧化和抗輻射活性測試。

1.2.3.1 抗氧化活性檢測

沒食子酸有很強的抗氧化效果，一般用作檢測標準品，表達某種物質(zhì)的抗氧化力?？寡趸褪侨魏我缘蜐舛却嬖诰湍苡行б种谱杂苫趸磻?yīng)的物質(zhì)，其作用機理可以是直接作用在自由基，或是間接消耗掉容易生成自由基的物質(zhì)，防止發(fā)生進一步反應(yīng)。二苯代苦味酰基自由基(DPPH)是一種常見的穩(wěn)定自由基，其無水乙醇溶液呈紫色，在517 nm 波長處有最大吸收，吸光度與濃度呈線性關(guān)系。向其中加入自由基清除劑時，自由基數(shù)量減少，吸光度變小，溶液顏色變淺。

1.2.3.2 抗輻射活性檢測原理

雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪是一款廣譜紫外線吸收劑，吸收紫外光A 區(qū)(315～400 nm)和B區(qū)(280～315 nm)，被添加到各種防曬產(chǎn)品中以吸收紫外線。紫外吸收能力與其濃度呈線性關(guān)系。以此為對照，可檢測面膜精華液在該波段的紫外吸收能力，結(jié)果以雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪當量計。

1.2.4 青稞酒糟面膜精華液的制備

面膜精華液的配方為（按重量百分比）：水77 %，青稞酒糟提取液10 %，丁二醇6.4 %，甘油2%，羥乙基纖維素0.2%，透明質(zhì)酸鈉0.15%，羥苯甲脂0.15%，尿囊素0.1%，煙酰胺4%。其制備按照以下流程進行：將甘油、透明質(zhì)酸鈉混合→完全浸透潤濕→加入純凈水，攪拌溶解→加入尿囊素，攪拌溶解→加入煙酰胺，攪拌溶解→加入羥乙基纖維素，攪拌溶解→加入羥苯甲酯的丁二醇溶液→加入酒糟提取液，攪拌混勻→得到面膜精華液。

制得面膜精華液后，將25～28 g 精華液、單片無紡面膜布裝入面膜袋，封口，滅菌消毒，得到單片包裝的面膜樣品。

1.2.5 青稞酒糟面膜的功效測試

1.2.5.1 測試準備

（1）測試內(nèi)容：對制備的面膜，通過連續(xù)人體試用，并由儀器檢測、臨床評估和自評問卷，對該產(chǎn)品的保濕、抗皺、美白功效進行綜合評價。

（2）測試對象：健康女性，無明顯皮膚過敏癥，年齡35～60 歲，眼角皺紋等級三級以上，面部膚色暗沉，皮膚色度值（ITAo）55以下。

（3）測試方法：按照試用對象納入標準選取女性35 人，采取隨機、雙盲、對照（前后對照）方法，將制備的面膜樣品隨機分配給35 名受試者，每個受試者12 片面膜（有效數(shù)據(jù)不低于30 人）。受試者連續(xù)敷用28 d，每周3次，中間兩次間隔不超過3 d，每日固定時間使用。每次1 片，貼于肌膚后，提拉整型，敷貼15 min 后揭掉，用手輕輕按摩至精華液吸收。

需要注意以下幾點：（1）一般情況下，人體皮膚皺紋分0—6 級。0 級：沒有皺紋，面色紅潤，皮膚有彈性；1 級：有細小假性皺紋；2 級：有細小真性皺紋；3 級：有輕度真性皺紋；4 級：有中度真性皺紋；5級：有重度真性皺紋；6 級：有極重度真性皺紋皮膚彈性差。（2）ITAo 值：即皮膚色度值，是基于CIE L×a×b×顏色空間建立的皮膚顏色測量指標，廣泛應(yīng)用于皮膚顏色研究和化妝品功效評測中。（3）CIE L×a×b×：L 值表示明度，本文表示為皮膚亮白度，范圍由0 到100，表示顏色從深（黑）到淺（白）；a 值表示紅綠，數(shù)值變化由正到負，表示顏色從紅（正）到綠（負），a 值越大顏色越紅，a 值越小顏色越綠；b 值表示黃藍，數(shù)值變化由正到負，表示顏色從黃（正）到藍（負），b值越大顏色越黃，b值越小顏色越藍。

1.2.5.2 測試流程

（1）第一天受試者到訪，由評估師視感評估，符合入選條件的受試者入組。

（2）受試者用潔面產(chǎn)品清潔面部，并用干面巾紙擦干皮膚，在溫度21 ℃±1 ℃，50 %±5 % RH 的實驗室中靜坐20 min。

（3）試驗受試者皮膚基礎(chǔ)值數(shù)據(jù)采集。實驗室技術(shù)員操作Primos、Cutometer、Corneometer、Colorimeter、Mexameter 儀器對受試者的受試部位進行相關(guān)基礎(chǔ)值指標的測定。

（4）實驗室技術(shù)員根據(jù)產(chǎn)品使用要求和使用部位指導受試者使用產(chǎn)品，并提供書面試驗注意事項和產(chǎn)品使用說明；受試者領(lǐng)取樣品，離開實驗室。

（5）第14 天、第28 天受試者分別回訪，重復上述步驟，采集試驗受試者皮膚第14 天、第28 天數(shù)據(jù)，工作人員檢查受試者的使用記錄，測試流程結(jié)束。

測試數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0 for windows軟件包進行統(tǒng)計，應(yīng)用儀器設(shè)備檢測檢驗，比較受試者相同部位的前后自身差異，其顯著性差異水平均為低于5%。對測試部位的皮膚色度L 值、ITA 試值、黑色素值、角質(zhì)層水分含量、皮膚彈性以及眼角皺紋進行檢測。測試描述如表1所述。

表1 青稞酒糟面膜受試者測試部位、測試參數(shù)及設(shè)備要求

皮膚彈性R2=Ua/Uf，R5=Ur/Ue，其中：Ua 指從取消負壓到下一次連續(xù)測試皮膚表面再加負壓時皮膚的恢復值；Uf 指有負壓時的皮膚最大拉伸量；Ur 指取消負壓后，皮膚就會迅速恢復原狀態(tài)，即取消負壓0.1 s 后，皮膚的恢復值和粘彈性部分值，或稱塑性部分值；Ue 指恒定負壓加到皮膚上后，0.1 s時皮膚的拉伸量，定位彈性部分拉伸量。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞酒糟中各組成含量分析

2.1.1 新鮮青稞酒糟中各組分占比

青稞經(jīng)過90 d發(fā)酵取酒后，剩余的青稞酒糟主要包括水、糠皮、青稞殘存淀粉及各種微量成分等，青稞酒糟經(jīng)烘干后，主要成分含量見表2。

表2 新鮮青稞酒糟中主要指標

2.1.2 青稞酒糟中各營養(yǎng)組成分析

通過對青稞酒糟中營養(yǎng)物質(zhì)進行分析，可以看出，青稞經(jīng)過90 d 的發(fā)酵后，殘存的青稞酒糟中營養(yǎng)物質(zhì)豐富（表3 和表4，數(shù)值單位均以干重的百分比含量計）。

表3 青稞酒糟中的營養(yǎng)成分分析

表4 青稞酒糟中的氨基酸含量分析

2.2 青稞酒糟提取工藝

2.2.1 青稞酒糟提取率與酸性蛋白酶的用量關(guān)系100 g 新鮮青稞酒糟加200 g 純凈水，45 ℃保溫，同時加不同量的酸性蛋白酶,共設(shè)13組，每組蛋白酶水解時間設(shè)置見表5，第一組不添加酸性蛋白酶的樣品作為空白對照，酶解時間結(jié)束后按照要求干燥稱重，計算酶解率。

表5 不同青稞酒糟的酸性蛋白酶提取條件及酶解率對照表

通過對表5 結(jié)果作曲線圖，得到殘渣干重與酸性蛋白酶用量的關(guān)系圖（圖2），最終水解效果根據(jù)酒糟水解后殘渣的重量，以此確定酸性蛋白酶的用量和水解時間。

圖2 青稞酒糟殘渣干重與酶用量的關(guān)系曲線圖

樣品1（空白對照）殘渣質(zhì)量26.1 g，平行樣品7、8、9 殘渣質(zhì)量較低，酶解效果較好。因此，提取條件為：酸性蛋白酶0.5 g，酶解時間6 h。

2.2.2 青稞酒糟抗氧化能力與酸性蛋白酶的酶解時間關(guān)系

100 g 新鮮青稞酒糟加200 g 純凈水混合打漿后，45 ℃保溫，加0.5 g 酸性蛋白酶，設(shè)置不同酶解時間，并分別取樣0.5 mL 置于離心管中，樣品立即放置沸水浴中滅活1 min，4000 r/min 離心2 min 后，取上清液做抗氧化能力檢測（以沒食子酸當量計）。另一組不加酸性蛋白酶作為對照。

青稞酒糟提取液的抗氧化能力與取樣時間的關(guān)系見圖3。

圖3 青稞酒糟提取液的抗氧化能力與取樣時間的關(guān)系

從圖3 可以看出，酸性蛋白酶自身沒有抗氧化能力，而青稞酒糟提取液的抗氧化能力經(jīng)酸性蛋白酶水解后提高了約3 倍，6 h 后抗氧化能力達到最大值。

我們對青稞酒糟酶法提取條件進行了優(yōu)化。在完成青稞酒糟酶解液的固形物含量驗證后，以及考慮到生產(chǎn)實際情況和經(jīng)濟性等因素后，確定最佳工藝為：青稞酒糟加入純凈水，青稞酒糟與純凈水重量比（g/g）為1∶2，磨漿機磨漿備用。得到的料液加入提取罐，開啟加熱，溫度保持在45 ℃，立即加入酸性蛋白水解酶（黑曲霉優(yōu)良菌種經(jīng)發(fā)酵精制提煉而成），所述酸性蛋白水解酶的添加量為新鮮青稞酒糟重量的0.5 %，酶解時間為6 h，酶解反應(yīng)pH3.5～4.5。將酶解結(jié)束后的混合液滅活殺菌，溫度為70 ℃，保溫30 min，然后進行離心除渣，離心機的轉(zhuǎn)速為4000 r/min，離心時間2 min。離心得到的上清液即為酒糟提取液，可直接用于青稞酒糟面膜精華液的制備，也可干燥得到干粉樣后備用。

2.3 酒糟面膜精華液的制備與面膜樣品試制

根據(jù)面膜的制備工藝，按如下流程完成酒糟面膜的試制：

（1）磨漿。將新鮮的第四米查青稞酒糟（1000 g）與純凈水（2000 g）混勻，膠體磨磨漿。

（2）酶解。把漿料加入5 L 提取罐中，邊攪拌邊加熱，升溫至45 ℃，待溫度穩(wěn)定后，加入酸性蛋白水解酶5.0 g。

（3）滅菌。45 ℃保溫攪拌6 h 后，再次開啟加熱，升溫至70 ℃后保溫30 min，殺菌滅酶。

（4）離心。殺菌滅酶結(jié)束后降溫至45 ℃以下，漿料進行離心分離，得到的上清液即為酒糟提取液（約2150 g）。

（5）面膜精華液制備。在燒杯中加入430 g 甘油，32.25 g 透明質(zhì)酸鈉，完全浸透潤濕后，加入16555 g純凈水，攪拌溶解；分撒加入尿囊素21.5 g，攪拌溶解；分撒加入煙酰胺860 g（美白功效成分），攪拌溶解；分撒加入43 g羥乙基纖維素，攪拌溶解；將32.25 g 羥苯甲酯加入1376 g 丁二醇中，攪拌溶解，然后倒入上步溶液中；加入2150 g 酒糟提取液，攪拌混勻，得到面膜精華液。

（6）單片面膜制備：面膜袋中加入單片無紡面膜布和面膜精華液25～28 g，封口后，殺菌消毒，得到單片面膜。

2.4 青稞酒糟面膜的常規(guī)理化和安全性指標檢測

試制面膜的各項理化指標和安全性指標參照《面膜》QB/T 2872—2017標準執(zhí)行，結(jié)果見表6。

表6 青稞酒糟面膜的常規(guī)理化指標和安全性指標檢測結(jié)果

2.5 試制面膜精華液的功效指標檢測

根據(jù)試制面膜的功效定位，分別進行試制面膜精華液的功效檢測，檢測指標及結(jié)果見表7。

表7 青稞酒糟面膜精華液的功效檢測指標及檢測結(jié)果

2.6 青稞酒糟面膜的人體皮膚安全性評價

參考2015 年版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定的人體試用試驗皮膚不良反應(yīng)分級標準,篩選35 名受試者進行4 周人體試用試驗研究，以觀察樣品對人體皮膚安全性。受試者回訪時，仔細詢問、檢查并記錄受試者在使用樣品期間所發(fā)生的任何不良事件，包括不良事件的表現(xiàn)、發(fā)生時間、處理措施及轉(zhuǎn)歸，并對不良事件與所使用樣品的關(guān)系做出判斷。人體試用試驗皮膚不良反應(yīng)結(jié)果見表8。

表8 青稞酒糟面膜的人體皮膚安全性評價表

2.7 人體功效測試

本次參與功效測試人群的面部皮膚滿足眼角皺紋等級3—6 級（D0）且左右眼角皺紋等級沒有明顯差異，以及臉部皮膚偏干缺乏水分、膚色暗沉、中等偏黑受試者共35 人，連續(xù)使用面膜樣品28 d。根據(jù)不良反應(yīng)記錄結(jié)果顯示無任何不良反應(yīng)前提下，可以發(fā)現(xiàn)：

（1）連續(xù)使用面膜樣品28 d，受試者的皮膚明亮色度ITAo值在第14天與基礎(chǔ)值相比有顯著性上升，上升率為1.40%；在第28 天與基礎(chǔ)值相比有顯著性上升（p＜0.001），上升率為2.80%。

（2）連續(xù)使用面膜樣品28 d，受試者的皮膚亮白度L 值在第14 天與基礎(chǔ)值相比有顯著性上升（p＜0.001），上升率為0.98 %；在第28 天與基礎(chǔ)值相比有顯著性上升（p＜0.001），上升率為1.38%。

（3）連續(xù)使用面膜樣品28 d，受試者的皮膚彈性R5 在第14 天與基礎(chǔ)值相比有顯著性上升（p＜0.001），上升率為8.66 %；在第28 天與基礎(chǔ)值相比有顯著性上升（p＜0.001）上升率為11.39%。

（4）連續(xù)使用面膜樣品28 d，受試者的皮膚黑色素含量在第14 天與基礎(chǔ)值相比有顯著性下降（p＜0.001），下降率為3.14 %；在第28 天與基礎(chǔ)值相比有顯著性下降（p＜0.001），下降率為5.10%。

（5）連續(xù)使用面膜樣品28 d，受試者的皮膚角質(zhì)層水分含量在第14 天與基礎(chǔ)值相比有顯著性上升（p＜0.001），上升率為32.76%；在第28 天與基礎(chǔ)值相比有顯著性上升（p＜0.001），上升率為45.06%。

（6）連續(xù)使用面膜樣品28 d，受試者的Primos眼角皺紋面積在第14 天與基礎(chǔ)值相比有顯著性下降（p＜0.001），下降率為10.30%；在第28 天與基礎(chǔ)值相比有顯著性下降（p＜0.001），下降率為10.40%。

結(jié)果表明，連續(xù)使用面膜樣品28 d，對測試人群的面部皮膚具有顯著的保濕、提亮、美白、改善皺紋、增強皮膚彈性功效。

3 結(jié)論

青稞酒糟作為青稞酒釀造過程中副產(chǎn)物，目前僅進行低值處理，并產(chǎn)生一定的環(huán)境污染。本研究發(fā)現(xiàn)青稞酒糟中富含活性物質(zhì)，具有開發(fā)再應(yīng)用的價值。本研究通過酸性蛋白酶水解方法，高效提取青稞酒糟中的多種活性物質(zhì)，并通過配方設(shè)計和優(yōu)化，開發(fā)出一款青稞酒糟面膜，經(jīng)人體功能測試表明，該酒糟面膜具有良好的保濕、抗氧化、抗紫外、美白的功效。