張兆豐，萬 勇，余有貴，楊志龍，熊 翔

（1.邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南邵陽 422000；2.生態(tài)釀酒新技術(shù)與應(yīng)用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南邵陽 422000；3.湖南湘窖酒業(yè)有限公司，湖南邵陽 422000）

濃香型白酒的主要呈味成分是己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯，而占主導(dǎo)地位的是己酸乙酯，但是現(xiàn)在生產(chǎn)的濃香型白酒中乙酸乙酯、乳酸乙酯的含量非常高，為了解決這一問題，許多研究學(xué)者提出增己降乙，增己降乳等方法。任雪等所采用的無窖泥生產(chǎn)濃香型白酒，通過添加發(fā)酵液所生產(chǎn)的濃香型白酒四大酯含量協(xié)調(diào)。劉選成等針對此問題通過改進(jìn)生產(chǎn)工藝來達(dá)到降低乙酸乙酯的目的，改進(jìn)后乙酸乙酯含量降低了32.29 %。代佳慧等對成品濃香型白酒進(jìn)行微波輻射，在微波輻射時間為20～100 min 時，能對白酒中乙酸及乙酸乙酯的含量產(chǎn)生影響。除此之外，還有采用新窖池生產(chǎn)、使用強(qiáng)化大曲、窖泥的培養(yǎng)以及超級菌種等方法。

以小曲為糖化發(fā)酵劑的小曲酒，主要呈味物質(zhì)是乳酸乙酯。傳統(tǒng)濃香型白酒過于濃烈，在白酒淡爽化的新潮中，可通過大小曲聯(lián)用生產(chǎn)出醇香清雅、酒體柔和、回甜爽口、純凈怡然的新品白酒。本研究以高粱、玉米、大米、糯米為原料，在固態(tài)發(fā)酵法中使用小曲為糖化發(fā)酵劑，通過分析糧醅理化指標(biāo)，對糖化堆積中的糠殼、小曲、玉米添加量以及糖化堆積時間等參數(shù)進(jìn)行工藝優(yōu)化，為提高白酒出酒率、開發(fā)新型口味特征濃香型白酒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：高粱、大米、糯米、玉米、糠殼、小曲，均由湖南湘窖酒業(yè)有限公司提供。

試劑及耗材：葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、可溶性淀粉、酒石酸鉀鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉、次甲基藍(lán)等：分析純，市場購買。

儀器設(shè)備：恒溫培養(yǎng)箱（DH-420型），北京科偉永興儀器有限公司；恒溫水浴鍋（DK-99-3 型），江蘇金壇中大儀器廠；磁力攪拌器（HJ-1 型），常州越新儀器制造有限公司；自動壓力蒸汽滅菌器（GI54DWS 型），致微（廈門）儀器有限公司；便攜式pH 計(jì)（LE438 型），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-1FD 型），蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

高粱、大米、糯米、玉米→潤料→混合蒸糧→攤晾→白曲拌合→糠殼拌合→培菌堆積糖化

1.2.2 操作要點(diǎn)

原料處理：高粱、大米、糯米均為整粒糧食；玉米要求粉碎成能通過2.0 mm篩孔的占3/4。

潤料：常溫水浸泡1.5～2 h。

攤晾：攤晾均勻，與室溫相差1 ℃以內(nèi)。

白曲拌合：白曲的用量以糧食的重量計(jì)，添加量為糧食的0.3%。

糠殼拌合：糠殼的用量以糧食的重量計(jì)，添加量為糧食的一定百分比。

培菌堆積糖化：糖化后的糧食要求清香味甜，不流汁，無霉變和異味。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 不同堆積時間對培菌堆積糖化的影響

高粱、大米、糯米、玉米按照指導(dǎo)書的比例混合，小曲添加量為0.3 %，糠殼的添加量為1 %，在糖化過程中，分別測定0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、70 h 的還原糖、酸度、淀粉含量及微生物生長數(shù)量確定最佳的培菌時間。

1.2.3.2 不同糧食添加量對培菌堆積糖化的影響

高粱與大米的添加量不做改變，以總量100%為計(jì)，改變玉米的添加量5%、7.5%、10%、12.5%、15 %，糯米的添加量15 %、12.5 %、10 %、7.5 %、5%，小曲的添加量為0.3%，糠殼的添加量為1%，培菌糖化時間為24 h，經(jīng)糖化發(fā)酵后，通過測定還原糖、酸度、淀粉含量及微生物生長數(shù)量確定最佳的糧食添加量。

1.2.3.3 不同小曲添加量對培菌堆積糖化的影響

高粱、大米、糯米、玉米按照指導(dǎo)書的比例混合，堆積糖化時間為48 h，小曲添加量為0.1 %、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，糠殼的添加量為1%，經(jīng)糖化發(fā)酵后，通過測定還原糖、酸度、淀粉含量及微生物生長數(shù)量確定最佳小曲添加量。

1.2.3.4 不同糠殼添加量對培菌堆積糖化的影響

高粱、大米、糯米、玉米按照指導(dǎo)書的比例混合，堆積糖化時間為48 h，小曲添加量為0.3 %，糠殼添加量為1 %、2 %、3 %、4 %、5 %，經(jīng)糖化發(fā)酵后，通過測定還原糖、酸度、淀粉含量及微生物生長數(shù)量確定最佳糠殼添加量。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

確定不同時間（A）、玉米添加量（B）、小曲添加量（C）、糠殼添加量（D）為響應(yīng)因素，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以還原糖含量為響應(yīng)值，小曲糖化工藝響應(yīng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表

1.2.5 分析方法

酸度、水分、還原糖、淀粉的測定：參考標(biāo)準(zhǔn)DB 34/T 2264—2014；霉菌、酵母計(jì)數(shù)：參考國標(biāo)GB 4789.15—2016。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用Origin 2018 軟件作圖，利用Design Expert 12 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 堆積時間對培菌堆積糖化的影響

不同的堆積時間對糖化醅的指標(biāo)影響見圖1—圖4，除淀粉的消耗外，時間在很大程度上對糖化醅的各項(xiàng)指標(biāo)有著相同的影響，各項(xiàng)指標(biāo)隨著時間的延長都呈現(xiàn)出遞增的變化。考慮到企業(yè)的可實(shí)行性以及入窖的糖化醅標(biāo)準(zhǔn)，酸度低于0.6 mol/L，時間的縮短，故最佳糖化堆積時間選擇48 h。

圖1 堆積時間對還原糖及淀粉的影響

圖2 堆積時間對霉菌及酵母的影響

圖3 堆積時間對酸度的影響

圖4 堆積時間對水分的影響

2.1.2 糧食添加量對培菌堆積糖化的影響

不同的糧食添加量對糖化醅的指標(biāo)影響見圖5—圖7。由圖5—圖7 可知，隨著玉米添加量的改變，還原糖呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，淀粉呈現(xiàn)下降趨勢，但下降趨勢不明顯，水分呈現(xiàn)上升的趨勢，霉菌在玉米添加量10%時數(shù)量最多。分析原因是玉米中的支鏈淀粉較多，在短時間內(nèi)難以被微生物利用轉(zhuǎn)化為還原糖，淀粉剩余量較多，還原糖較少的情況下對酵母生長有一定的影響，水分呈現(xiàn)增長的趨勢，分析原因是玉米的吸水性較強(qiáng)。故玉米最佳添加量為10%。

圖5 玉米添加量對還原糖及淀粉的影響

圖6 玉米添加量對霉菌及酵母的影響

圖7 玉米添加量對水分的影響

2.1.3 小曲添加量對培菌堆積糖化的影響

不同的小曲添加量對糖化醅的指標(biāo)影響見圖8—圖10。由圖8—圖10 可知，還原糖在小曲添加量為0.3%時最高，淀粉在此添加量下利用較好，霉菌在此條件下數(shù)量最高；酵母數(shù)量及水分含量隨著添加量的增加而升高。故最佳小曲添加量為糧食比重的0.3%。

圖8 小曲添加量對還原糖及淀粉的影響

圖9 小曲添加量對霉菌及酵母的影響

圖10 小曲添加量對水分的影響

2.1.4 糠殼添加量對培菌堆積糖化的影響

不同的糠殼添加量對糖化醅的指標(biāo)影響見圖11—圖13。由圖11—圖13 可知，糠殼4 %時還原糖含量最高，淀粉最低，霉菌生長較好，水分較低，酵母生長情況較好。在糠殼合適的添加量情況下，糧醅的疏松度較好，有利于霉菌產(chǎn)糖的進(jìn)行，能對糧醅的水分含量產(chǎn)生一定的影響作用，是因?yàn)榭窔つ軐Χ逊e溫度有一定的調(diào)控作用。故糠殼最佳添加量為4%。

圖11 糠殼添加量對還原糖及淀粉的影響

圖12 糠殼添加量對霉菌及酵母數(shù)量的影響

圖13 糠殼添加量對水分的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以還原糖含量為響應(yīng)值，選取對糧醅有影響的堆積時間、糧食添加量、小曲添加量和糠殼添加量進(jìn)行4 因素3 水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

通過Design Expert 12 共設(shè)計(jì)29 組試驗(yàn)，對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次響應(yīng)面回歸模型為：還原糖含量=20.84-0.2125A+0.0792B+0.4792C-0.1292D-0.25AB+0.2375AC-1.13AD-0.25BC+7875BD+0.275CD-2.53A-1.73B-1.71C-1.04D

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

進(jìn)一步對該回歸模型進(jìn)行顯著性分析，響應(yīng)面數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果見表3。由表3 可知，該模型回歸極顯著（P＜0.001），失擬項(xiàng)的p 值0.0645，p＞0.05，表明該模型失擬不顯著，說明其他因素對模型的干擾程度較低，試驗(yàn)結(jié)果與回歸模型擬合度較好?；貧w方程的可信度分析顯示，該模型的R為97.16 %，R=94.31 %，變異系數(shù)CV=2.16 %，說明試驗(yàn)的擬合度較好。比較F 值大小可知，影響糧醅中還原糖含量的因素順序?yàn)椋盒∏砑恿浚–）＞堆積時間（A）＞糠殼添加量（D）＞玉米添加量（B）。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，模型中C、AD、BD、A、B、C、D對糧醅的還原糖含量影響極顯著。

表3 回歸方程方差分析

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)圖形分析

圖14 為各因素間交互作用的響應(yīng)面三維曲面圖和等高圖，圖14 能直觀反映各實(shí)驗(yàn)因素的交互作用情況，響應(yīng)面越平緩表示該因素對還原糖含量影響越小，響應(yīng)面越陡峭，說明該因素對還原糖含量影響越顯著，圖14 中a、c、e、g 都相對陡峭，i、k 相對平緩，圖14 中b、d、f、h、j、l 為還原糖含量對應(yīng)各因素構(gòu)成的一個三維空間在二維平面上的等高圖，能客觀反應(yīng)各因素之間的交互作用及其對響應(yīng)值的影響。圖14f 為一個橢圓形，表示兩因素交互作用顯著，即堆積時間和糠殼添加量交互作用明顯；圖14a 為一個圓形，表示兩因素交互作用不顯著，即堆積時間和玉米添加量交互作用不明顯，與上述結(jié)論一致。

圖14 各因素間交互作用的響應(yīng)面及等高線圖

2.2.3 最優(yōu)工藝參數(shù)確定及驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析可得小曲糖化工藝的最佳參數(shù)為：糖化時間為47.62 h，玉米的添加量為10.03%，小曲添加量為0.3135%，糠殼添加量為3.98%?？紤]試驗(yàn)的可操作性，將試驗(yàn)參數(shù)調(diào)整為糖化時間為48 h，玉米的添加量為10%，小曲添加量為0.3%，糠殼添加量為4%，測得還原糖含量為20.9 %，與預(yù)測值接近，說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的小曲糖化堆積工藝參數(shù)是合理的，具有一定的實(shí)際指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)研究小曲堆積糖化工藝中的糧食添加量、小曲添加量、糠殼添加量及堆積糖化時間對糖化醅中還原糖含量的影響。采用多因素的響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化糖化工藝。結(jié)果表明，最佳糖化堆積工藝為：糠殼添加量為4%、小曲添加量為0.3%、玉米添加量為10%、糖化堆積時間為48 h，在此條件下生產(chǎn)的糧醅還原糖含量為20.9 g/100 g，糧醅蜜香清雅、味甜純正，結(jié)果為后續(xù)發(fā)酵工藝優(yōu)化與釀酒效果的研究奠定了基礎(chǔ)。